Il pesce grotta sta crescendo come un fantastico murale animale per comprendere l'evoluzione e i processi biomedici. Ora stiamo conducendo un'indagine biomedica usando questo tratto come parallelo di un sintomo umano. Qui mostreremo la batteria del saggio sui comportamenti e il sistema di analisi che può essere utilizzato sia per gli studi evolutivi che biomedici.
Per saggiare le vibrazioni che attraggono e il comportamento, un'asta di vetro vibrante viene inserita in una ciotola di vetro contenente un pesce al buio. I pesci vengono acclimatati quattro giorni prima del saggio in acqua condizionata con un ciclo buio di 12, 12 luci. Il giorno prima del giorno del saggio dopo tre giorni di acclimatazione, sostituire l'acqua nella camera di dosaggio con acqua fresca condizionata.
Il giorno del test, i pesci vengono privati del cibo fino al termine del test, perché la cessazione cambierà la loro risposta alle vibrazioni. Preparare l'apparecchio che emette vibrazioni sintonizzandosi su 40 Hertz. Impostare i parametri di registrazione, le condizioni di magazzino e il file di destinazione appropriati.
Posizionare il cilindro di dosaggio sul palco di registrazione, illuminato con retroilluminazione a infrarossi in una stanza buia, e consentire ai pesci di acclimatarsi per tre minuti dopo essere stati posizionati sul palco. Dopo tre minuti di acclimatazione al buio, registra tre minuti e 30 secondi di video. All'inizio della registrazione, inserire l'asta di vetro vibrante di 7,5 millimetri di diametro nella colonna d'acqua, circa 5 centimetri di profondità.
Evita di fare rumore o vibrazioni mentre posiziona l'asta di vetro vibrante nell'acqua, poiché i pesci possono percepire piccoli rumori e vibrazioni. Assicurarsi di completare questa procedura entro 30 secondi dall'avvio della registrazione video per assicurarsi che vengano registrati più di tre minuti di comportamento. Eseguire il file batch facendo doppio clic su avs_creator.
per convertire il video AVI compresso in formato leggibile per ImageJ. La macro può essere caricata semplicemente trascinando e rilasciando in una shell grafica dell'interfaccia utente. Questa macro consentirà alcuni tasti di scelta rapida per l'analisi seguente.
Nella directory di lavoro creare una nuova cartella e denominarla Process_ImageJ. Questa cartella verrà utilizzata automaticamente per archiviare i file di output dalla seguente analisi. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file video AVS da analizzare e selezionare montaggio rapido.
Dopo aver montato il file AVS come unità esterna, aprire il file AVI in ImageJ. Per impostare la scala della misurazione della distanza, selezionate il diametro della camera di dosaggio disegnando una linea retta attraverso la camera utilizzando lo strumento di selezione della linea retta, quindi impostate la scala facendo clic su analizza, impostate la funzione scala. Per il nostro caso, iniamo 9,4 centimetri.
Selezionare la casella radio globale per standardizzare la scala in tutte le seguenti analisi video. Copiare l'area della camera di dosaggio utilizzando lo strumento di selezione ovale, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il duplicato dell'immagine. Al momento, specificate l'intervallo di fotogrammi da conservare per ulteriori analisi.
Cancellare all'esterno della camera di dosaggio e convertire l'immagine in un'immagine binaria colpendo il tasto di scelta rapida sette sulla barra dei numeri. Dopo che lo sfondo si è sgombrato, verrà richiesto di aggiungere un punto nero al centro per indicare la posizione dell'asta di vetro vibrante utilizzando lo strumento di selezione ovale già impostato su nero con la funzione di riempimento. Fare clic su OK e la macro richiederà di passare alla regolazione della soglia.
Regolare la soglia in modo che il pesce possa essere visto durante l'intero video clip, quindi selezionare applica. Eseguire il plug-in Tracker colpendo il tasto di scelta rapida otto sulla barra dei numeri. Impostare la dimensione minima dei pixel su 100, quando richiesto.
Questo processo genererà la distanza tra la barra di vetro vibrante e il pesce per fotogramma per tutti e tre i minuti del video binario. Per salvare il file tracker, premere il tasto di scelta rapida nove sulla barra dei numeri. Questo esporterà automaticamente uno stack binario di immagini dell'intero video e un file XLS con coordinate e dati di distanza, nel caso in cui sia necessario rianalizzare.
Questo chiuderà anche tutti i file associati al video corrente. I file generati possono ora essere ulteriormente analizzati a seconda della domanda di ricerca specifica. Acclimata cinque pesci sperimentali per quattro giorni o più in ogni camera di un acquario di registrazione acrilico da 10 litri personalizzato pieno di acqua condizionata.
Ogni singola camera è separata con tavola acrilica nera. Ogni serbatoio deve essere coperto per evitare che i pesci saltino in un'altra camera. Impostare il timer di alimentazione programmabile per accendere automaticamente la luce LED bianca per 12 ore e spegnersi per 12 ore al giorno durante il periodo di acclimatazione.
Questo intrappola il ritmo circadiano del pesce se il pesce è suscettibile all'intrappolamento. Al fine di fornire una luce bianca più diffusa, utilizziamo una tavola acrilica opaca bianca piatta di dimensioni simili al serbatoio da 10 litri come diffusore per passare la luce per ogni serbatoio. Durante questo periodo, fornire una volta al giorno l'alimentazione con gamberetti salamoia vivi e fornire l'aerazione attraverso il filtro spugna in ogni acquario.
Nota, assicurarsi che il pesce sia nutrito in un momento coerente. Ad esempio, una volta al giorno al mattino. Il giorno prima del giorno del saggio, tre giorni o più dell'acclimatazione, sostituire l'acqua nella camera di dosaggio con acqua fresca condizionata.
Impostare la registrazione dei parametri nel software VirtualDub. Il video verrà registrato in 15 fotogrammi al secondo nel tempo di esposizione fisso. Il video viene compresso nel codec X264VFW per ottenere una compressione circa 700 volte superiore.
Il giorno della registrazione, nutrire ogni pesce con gamberetti salamoia vivi. Rimuovere tutto il filtro spugna e iniziare la registrazione. Accendere la luce infrarossa nella fase di registrazione.
Osservando virtualdub immagine dal vivo sullo schermo, regolare la posizione di ogni acquario per assicurarsi che affrontino correttamente la fotocamera USB. Inizia la registrazione 24 ore su 24 al mattino. Ad esempio, l'ora di inizio è 9 a.m.
e l'orario di arrivo è .m il giorno seguente. Inizia a catturare il video e proteggi la posizione per evitare disturbi.
Controllare occasionalmente se la registrazione è in esecuzione. Dopo 24 ore di registrazione, assicurarsi che il video sia stato salvato correttamente. Trasferire il video nella workstation PC per tenere traccia del comportamento del pesce.
Dopo aver trasferito il video nella cartella appropriata, eseguire rapidamente un controllo di qualità del video per assicurarsi che sia di buona qualità. Ciò include guardare l'illuminazione, verificare se c'è un pesce in ogni sezione e se ci sono movimenti stranieri che possono causare errori ditracking. Da qui, il freeware SwisTrack viene utilizzato per il tracciamento degli animali.
Il vantaggio di questo software è che il software può tracciare più animali contemporaneamente e sottrarre l'immagine di sfondo utilizzando un frame arbitrario che identifichiamo. Gli svantaggi sono che il tracciamento può saltare tra arene contenenti un pesce diverso. L'immagine di sfondo potrebbe non essere adeguata per i fotogrammi successivi e SwisTrack assegna casualmente l'ID di tracciamento ai singoli pesci, pertanto è necessario recuperare l'ID pesce tracciando la posizione fisica media di ogni pesce.
Per superare questi problemi, vengono utilizzati tre approcci. L'uso di maschere binarie, una per il tracciamento di arene con numeri pari e una per il tracciamento di arene dispari. L'uso dell'automazione Win per aggiornare automaticamente le immagini di sfondo ogni tre minuti e l'uso di script Perl per ricostruire gli ID pesce.
Il primo passo dell'analisi è quello di creare le maschere binarie per arene dispari e pari. Dopo aver controllato la qualità del video, scegli un fotogramma rappresentativo in un software di editing video e usalo per creare due maschere binarie, una pari e una per arene dispari. Lo scopo di queste maschere binarie è quello di evitare errori di traccia tra arene adiacenti.
Dopo aver escoeto maschere binarie, aprite i file dei parametri SwisTrack che determinano i percorsi e i parametri dei file per il processo di rilevamento. Preparare un file di parametri in ciascuna delle cartelle di file pari e dispari per il rilevamento video. In questo file digitare il percorso dei percorsi dei file video e maschera.
Dopo aver preparato i file dei parametri, aprire il file eseguibile di automazione win che reimposta automaticamente lo sfondo ogni tre minuti. Con questo file eseguibile, SwisTrack verrà eseguito automaticamente, quindi aprirà il file dei parametri in ogni cartella pari o dispari in questo software di tracciamento. Eseguire il software di tracciamento per tenere traccia del movimento del pesce.
Entro i primi 9.000 fotogrammi di tracciamento, assicurati che il pesce venga monitorato correttamente guardando il componente di tracciamento del vicino più vicino. Dopo aver stabilito correttamente il rilevamento, tornare alla scheda del componente di sottrazione di sfondo adattiva e premere il tasto di scelta rapida R sulla tastiera per eseguire l'automazione win per la sottrazione di sfondo adattiva continua. Dopo circa cinque ore, vengono generati file di testo per ogni pesce, contenenti coordinate X e Y per ogni fotogramma del video.
Per continuare l'analisi, allocare i tre file script Perl alla cartella che include cartelle pari e dispari. Per convertire la lunghezza in pixel in centimetri, è necessario conoscere il rapporto centimetro/pixel. Digitare questo rapporto nel percorso appropriato del file di script Perl denominato 1.fillupGaps.pl.
Eseguire 1.fillupGaps. pl Script Perl che utilizza un emulatore Unix per Windows. Utilizzare innanzitutto il comando CD per passare alla directory di lavoro corrente, quindi digitare Perl 1.fillupGaps.
pl per eseguire lo script Perl. Gli altri due script verranno chiamati automaticamente in ordine sequenziale. Questi tre script assegnano ogni file di tracciamento a ogni sezione dell'acquario e quindi possono essere utilizzati per analizzare il comportamento di ogni pesce.
Conferire con il file di testo denominato Summary_Sleep generato dopo l'esecuzione degli script per verificare che il numero di frame eliminati dall'analisi sia abilmente basso. La mancanza di meno del 15% dei fotogrammi è considerata accettabile. Copiare e incollare i dati di rilevamento in un file di foglio di calcolo con una macro internamente.
Questa macro ristrutturerà i dati analizzati in diversi livelli di processo di passaggio, ad esempio la media della durata del sonno e la somma della distanza di nuoto. Per macchiare la linea laterale del pesce, sciogliere la soluzione di stock DASPEI in acqua condizionata per una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro, quindi immergere il pesce nella soluzione a temperatura ambiente in un ambiente buio per 45 minuti. Dopo 45 minuti, recuperare il pesce dalla soluzione DASPEI e immergerlo in acqua condizionata ghiacciata con MES triplo due.
Una volta che il pesce è profondamente anestetizzato, montare il pesce in una piastra di Petri e osservarlo al microscopio efficiente. Assicurati di prendere una serie statistica per includere tutti i piani del pesce a fuoco e compilare tutto in un'unica immagine. Per l'analisi delle immagini, aggiungere una nuova cartella Process_ImageJ e il file macro alla cartella contenente le immagini da analizzare.
Aprire il software ImageJ e quindi aprire la macro trascinando il file macro su ImageJ. Eseguire la macro facendo clic su macro, eseguire la macro. Se l'immagine non si apre automaticamente, fare clic su macro, ritiro file.
Macro quindi ritirerà automaticamente un file di immagine da analizzare. Per la quantificazione neuromasta mostra la regione di interesse facendo clic sul poligono due e disegnando l'area sull'immagine. Otto, cinque per duplicare la regione di interesse.
Usa lo strumento di pittura per rimuovere o aggiungere qualsiasi punto extra o mancante nell'immagine precedente e quindi otto, sei. Una volta che hai otto, sei, appariranno due nuove finestre. Una finestra che mostra uno schema di punti neuromast numerati e una finestra con una tabella con neuromast totale quantificato.
Premi sette per salvare entrambi i file. Una volta fatto clic su OK, tali file vengono archiviati e verrà aperto un nuovo file di immagine per ulteriori analisi. Consolidare il conteggio dei neuromast eseguendo macro.
I seguenti risultati sono risultati rappresentativi di ciò che ci si può aspettare per entrambi i morfi di pesce in condizioni controllate. Queste quattro cifre mostrano risultati rappresentativi dei test sul comportamento dell'attrazione delle vibrazioni. A e B sono le migliori vedute del sentiero di nuoto di A, un pesce di superficie e B un pesce grotta.
Le linee rosse sono le tracce delle coordinate generate dal tracciamento ImageJ in tre minuti di registrazione. C e D mostrano un confronto dei risultati di C, un pesce di superficie, e D, un pesce grotta, estratto dalla macro foglio di calcolo dai file TXT. L'asse Y è il numero contato di volte in cui il pesce si è avvicinato alla canna vibrante.
Ogni punto rappresenta un'osservazione sperimentale durante il saggio comportamentale di un pesce. Si noti che i pesci di superficie non mostrano un aumento degli approcci a qualsiasi frequenza, mentre i pesci grotta mostrano un massimo di attrazione intorno ai 35-40 Hertz. Queste due figure mostrano i risultati rappresentativi dei test sul comportamento della sospensione estratti dalle macro del foglio di calcolo dai file TXT.
A e B illustrano due delle metriche riepilogate automaticamente dal file macro. La figura A mostra la distanza di nuoto durante il giorno e la notte per i pesci di superficie e i pesci delle caverne, mentre B mostra la durata del sonno per entrambi i morfi. In questo caso, il pesce grotta ha mostrato iperattività e meno sonno rispetto ai pesci di superficie.
Queste cifre mostrano i risultati dell'analisi delle immagini DASPEI estratta dalla macro del foglio di calcolo dai file TXT. A e B dimostrano la relazione tra il numero di neuromast rispetto al comportamento di attrazione delle vibrazioni e le dimensioni dei neuromast rispetto al comportamento nei pesci delle caverne, nei pesci di superficie e nella progenie F1. Ogni punto rappresenta ogni pesce.
Nota, il numero di neuromast è positivamente correlato con il comportamento di attrazione delle vibrazioni, suggerendo che il neuromast può regolare questo comportamento. Anche la dimensione del neuromast supporta questa conclusione. C e D sono immagini di esempio di daspei macchiato neuromast di C, un pesce di superficie, e D, un pesce grotta.
Ogni punto fluorescente nelle immagini è un neuromast, che ha ripreso DASPEI. Nota, l'abbondanza notevolmente maggiore di neuromaschere sui pesci delle caverne. Abbiamo mostrato una serie di analisi del comportamento per l'attività di nuoto e il sonno del comportamento laterale basato sulla linea.
Il sistema di tracciamento degli animali può anche essere adattato ad altri comportamenti, come comportamenti ripetitivi stereotipati, interazioni sociali e lateraletà comportamentale.
