Questo lavoro è stato sostenuto da R01 DK078161 da NIDDK (LO), borse di studio post-dottorato da American Heart Association (AB), il Wenner-Gren Fondazioni di Svezia e Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Svezia (UB). Ulteriore supporto è stato fornito dal Maine Medical Center Research Institute strutture di base per Istopatologia, Bioinformatica e FACS (supportato da 2P20RR18789-06) e il Fondo per animali MMCRI.

1. Reagenti per la preparazione digestione del rene <ol><li> 1,5 ml di 0,25% Collagenasi A (w / v) e soluzione 1% Pancreatina digerire (w / v) saranno necessari per l&#39;estrazione di cellule zona nefrogenica (NZCs) da 8 E17.5 reni. Perché Pancreatina dura circa 2 ore per sciogliere a temperatura ambiente, basta digerire soluzione per il maggior numero di rene embrionale attesi dovrebbero essere fatte prima dell&#39;esperimento. Preparare digerire soluzione in primo luogo l&#39;aggiunta di 25 mg di Collagenasi A fosfato 10 ml Soluzione salina tamponata Dulbecco (DPBS) in modo chiaro da 15 ml, provetta sterile. E &#39;fondamentale che il DPBS non contiene calcio e magnesio in quanto interferiscono con la digestione enzimatica. Mescolare soluzione su un nutator per 10 minuti per sciogliere Collagenasi A. Aggiungere 100 mg di pancreatina a Collagenasi sciolto Una soluzione e mescolare su un nutator per almeno 2 ore. In alternativa, Collagenasi A / Pancreatina soluzione di analisi possono essere mescolati in un nutator notte a 4 ° C. Si consiglia di indossare una maschera, come Collagenasi A e Pancreatina disperdono facilmente in atmosfera durante la pesatura e può causare irritazione delle vie nasali. </li><li> Preparare un 5% di siero fetale bovino (FBS) (v / v) in soluzione salina tamponata di Hank (HBSS). Miscelare. 1 ml per ogni tubo di 8 reni sarà necessario. </li><li> Preparare un terreno di coltura, completandola cheratinociti medio siero libero con 1% glutamina (v / v) e 1% penicillina-streptomicina (PenStrep) (v / v). </li><li> Cappotto sterile fondo piatto in polistirolo tessuto piastre di coltura (96, 48, 24 o 6 così) con la soluzione fibronectina umana ad una concentrazione di 5 mg per cm 2 di superficie di crescita. 5 mg di polvere di fibronectina è risospeso in 5 ml di soluzione sterile H 2 O. Questo è diluito 1:25 in DPBS sterile senza calcio o di magnesio e 250 ml sono aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra ben 24. Le piastre sono poi incubate con una soluzione fibronectina a temperatura ambiente per 1 ora seguita da 1 ora a 4 ° C. In alternativa, le piastre possono essere incubate overnight a 4 ° C. La soluzione viene poi aspirato in una cappa a flusso laminare prima dell&#39;aggiunta di medio / cellule. </li></ol> 2. Reni dissezione e rimozione di capsule (Fatto a temperatura ambiente) <ol><li> A E17.5, il sacrificio della madre con una procedura approvata dal vostro Cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, rimuovere l&#39;utero, e metterlo in una capsula di Petri contenente DPBS con calcio e magnesio. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare orologiai &#39;forcipe per rimuovere ogni embrione dall&#39;utero e decapitare ogni embrione. Una volta che l&#39;intera cucciolata è fuori dell&#39;utero, trasferire gli embrioni per un piatto pulito Petri contenenti DPBS basta con il calcio e magnesio per coprire interamente gli embrioni lasciando dietro di sé come molto sangue e frammenti di tessuto possibile. </li><li> Utilizzando pinze, fare una incisione circonferenziale della parete addominale dell&#39;embrione a livello dell&#39;ombelico. Poi posto l&#39;embrione sul dorso, perno verso il basso alle spalle con un set di pinze, e rimuovere gli organi interni dai polmoni fino alla vescica con l&#39;altro set di pinze. Con la pratica questo può essere fatto in un unico movimento. I reni devono essere allegati alla parte posteriore della massa di organi. Se i reni non rimangono attaccati agli organi eviscerati, possono essere accuratamente rimosso dalla parete dorsale del corpo. Reni che sono stati danneggiati nel corso di questo processo di dissezione deve essere eliminata in quanto saranno contaminare la cultura finale con tipi di cellule inappropriate. </li><li> Delicatamente stuzzicare via i reni dal resto degli organi, avendo cura di mantenere i reni collegati tra loro. Tenere il tessuto tra i reni con un set di pinze e prendete la ghiandola surrenale collegato a uno dei reni con le pinze altri. La ghiandola surrenale deve essere collegato alla capsula renale. Buccia delicatamente la ghiandola surrenale e dalla capsula intorno alla parte esterna del rene, simile a sbucciare una banana. Fare attenzione a non dividere il rene a metà mentre peeling, ed essere sicuri di non danneggiare il tessuto renale al di sotto della capsula. Rimuovere con cura ogni capsula rimanente, come pure l&#39;uretere se è ancora attaccato. Ripetere con il rene residuo. </li><li> Utilizzare una pipetta trasferire taglio di inserire i reni in una provetta di polistirolo 5 ml di HBSS. Ripetere i passaggi 2,2-2,4 per ogni embrione. Reni possono essere raggruppati 8 per tubo. Con rimozione pratica, la dissezione e la capsula si terrà 2-3 minuti per ogni embrione. </li></ol> 3. La digestione enzimatica di Reni (tutti i passaggi a temperatura ambiente salvo diversa indicazione) <ol><li> Rimuovere la soluzione HBSS da provette da 5 ml contenente reni con una pipetta, mentre con cura evitando il contatto con i reni. Immediatamente aggiungere 1,5 ml di Collagenasi A Pancreatina / soluzione di analisi per il tubo 5 ml contenente reni prima di passare al campione successivo. Ripetere per ogni tubo di reni. </li><li> Tubi posto con l&#39;enzima / reni digerisce su un nutator in un pre-riscaldato a 37 ° C incubatore per 15 minuti. 2 minuti primacompletamento del digest, aggiungere 3 ml di DNasi (1 U / ml) a un dolce in polistirene 5 ml per ogni digerire in corso. </li><li> Rimuovere rapidamente digerisce da incubatore, aggiungere 75 ml di FBS e capovolgere 3 volte per mescolare. Lasciate riposare in panchina per 2 minuti. </li><li> Trasferire 1,4 ml di sospensione cellulare al tubo di polistirene da 5 ml contenente DNasi (1 U / ml), lasciando il restante 0,2 ml di sospensione cellulare e reni dietro. L&#39;extra 0,2 mL di soluzione lasciato conterrà impurità come matrice extracellulare. </li><li> Mix sospensione cellulare / DNase su un nutator in un pre-riscaldato a 37 ° C incubatore per 10 minuti. </li><li> Rimuovere rapidamente sospensioni cellulari da incubatore e trasferire ciascuna in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. Spin sospensioni cellulari in microcentrifuga a 325 g per 5 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante dal pellet e risospendere pellet in 1 ml di 5% di FBS / HBSS, pipettando su e giù 5 o 6 volte. Cap ciascun tubo prima di passare al campione successivo. </li><li> Spin sospensioni cellulari in una microcentrifuga a 325 g per 5 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,5 ml di cheratinociti media i livelli di free (KSFM) con additivi per ogni tubo e tubo tappo prima di passare al campione successivo. Dopo medio è stato aggiunto a tutti i tubi, risospendere delicatamente ogni cella pellet pipettando su e giù 5 o 6 volte con una micropipetta 1ml. Combina tutte le sospensioni di cella in una fresca 5 ml di tubo in polistirolo. </li><li> Pre-umido due da 40 micron cellule tappi filtro collocato su una provetta da 5 ml in polistirolo fondo rotondo con KSFM per campione. Passano sospensioni cellulari attraverso un tappo cellula filtro trasferendo con una micropipetta 1 ml. Evitare di toccare il filtro con la punta della pipetta. Raccogliere flow-through e ripetere filtrazione attraverso il tappo filtro secondo. Togliere il tappo filtro cellulare e sostituirlo con un nuovo tappo di un tubo normale 5 ml in polistirolo. </li><li> Contare le celle con un emocitometro o il conteggio delle cellule di altri dispositivi e le cellule trasferimento in pozzetti di una piastra fibronectina cultura patinata ad una densità di 100.000-200.000 cellule per cm 2, diluendo se necessario con KSFM con additivi. In generale, si recupera circa 4.5x10 6 celle per 10 cucciolata embrione. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2. </li><li> Consentono alle cellule di recuperare e fissare per 2-4 ore in media prima della stimolazione con reagenti aggiuntivi. Stimolano le cellule con il composto di interesse da 1 a 48 ore. Purificare l&#39;RNA per analisi PCR utilizzando il Qiagen RNeasy Micro Kit seguendo le istruzioni del produttore o seguire le istruzioni qui sotto per immunostain fluorescenti le cellule. </li></ol> 4. Reagenti per la preparazione di fissazione delle cellule e immunocolorazione <ol><li> Preparare 4% PFA: sciogliere 4% paraformaldeide in PBS (v / v) a 55 ° C con agitazione regolari. Raffreddare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Questa soluzione è tossico e deve essere eliminata in contenitori per residui designato. </li><li> Preparare la soluzione di permeabilizzazione con l&#39;aggiunta di Triton X-100 di PBS per ottenere una soluzione allo 0,3% (v / v). </li><li> Preparare una soluzione al 5% di blocco in PBS con siero della stessa specie, come è stato utilizzato per sollevare l&#39;anticorpo secondario da utilizzare. Per esempio, se si rileverà un anticorpo di coniglio contro il vostro antigene bersaglio con un asino anti-coniglio Alexa Fluor 568, preparare una soluzione bloccante contenente siero asino 5%. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione primaria di anticorpi aggiungendo la giusta concentrazione di anticorpi al 5% di soluzione di blocco. </li><li> Preparare la soluzione secondaria di anticorpi immediatamente prima dell&#39;uso. Aggiungi fluoroforo anticorpo coniugato a una concentrazione consigliata dal costruttore, insieme con il nucleare di contrasto DAPI e altri marcatori di organelli come falloidina di soluzione al 5% di blocco. Se lo stoccaggio è necessario, conservare la soluzione al buio a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Preparare il 50% glicerolo / PBS soluzione (v / v) per la conservazione di cellule immunostained. In alternativa, Vectashield può essere utilizzato. </li></ol> 5. Fissazione delle cellule e immunocolorazione <ol><li> Il protocollo seguito è progettato per la fissazione e la colorazione di NZCs in un piatto ben 24. I volumi indicati sono per un singolo pozzo. Reagenti devono essere delicatamente pipettati durante tutte le fasi per evitare il distacco delle cellule, e piastra di agitazione non è raccomandato nelle fasi di incubazione. </li><li> Rimuovere delicatamente con una media da 1 ml micropipetta e aggiungere 0,5 ml di PFA 4% per attaccati cellule in coltura. Incubare per 15 minuti indisturbati a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il 4% PFA e aggiungere 0,5 ml per pozzetto di soluzione permeabilizzazione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e risciacquare delicatamente due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione di blocco e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti. </li><li> Rimuovere soluzione di saturazione e aggiungere 0,225 ml di soluzione di anticorpo primario. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 2 ore o una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e delicatamente riNSE due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare. </li><li> Aggiungere 0,225 ml di soluzione di anticorpo secondario. Incubare piastra al buio a temperatura ambiente per 60 minuti. </li><li> Rimuovere la soluzione secondaria di anticorpi e delicatamente lavare due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare. </li><li> Aggiungere 0,3 ml di 50% glicerolo / PBS soluzione (v / v) o Vectashield sufficiente per coprire parte inferiore della superficie bene. </li><li> Celle di immagine con microscopio a epifluorescenza o conservare avvolto in un foglio a 4 ° C. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. NZCs sono stati purificati da E17.5 embrioni, placcato a 200.000 cellule per cm 2 e incubate a 37 ° C per un totale di 24 ore. Le cellule sono state ripreso dal contrasto di fase con un microscopio Leica DM IRB invertita prima della colorazione immunofluorescenza. (A) 20X contrasto vista fase di NZCs dopo 24 ore di cultura. (B) Le cellule sono state fissate e colorate con un anticorpo anti-PAX2 coniglio specifici per le cellule progenitrici nefrone (rosso) e uno secondario Alexa Fluor 568 coniugato asino anti-coniglio. Nota nuclei blu di contrasto con DAPI. (C) 40X contrasto fase di vista di un gruppo di progenitori nefrone (centrato) dopo 24 ore di cultura. (D) l&#39;immagine di 40X NZCs LacZ + isolate da embrioni del ceppo Foxd1 LacZ, che esprime la β-galattosidasi sotto il controllo del promotore Foxd1. Foxd1 si esprime nella popolazione di cellule stromali all&#39;interno della zona nefrogenico del rene di sviluppo. Le cellule sono state colorate con la F-actina marcatore falloidina (Oregon verde primario coniugato), il nucleare macchia DAPI (blu) e di coniglio anti-β-galattosidasi (secondaria - Alexa Fluor asino anti-coniglio 568) per il rilevamento di Foxd1 + cellule stromali ( rosso).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo si descrive un metodo per isolare le cellule e la cultura dalla zona nefrogenico del rene embrionale. E &#39;lo sviluppo di un metodo inizialmente pubblicato come parte di uno studio degli effetti del trattamento BMP7 sulle cellule della zona nefrogenica (Blank et al., 2009). Nello studio iniziale, una serie di esperimenti per caratterizzare i tipi di cellule rappresentate all&#39;interno della popolazione NZC sono stati condotti. In breve, la purificazione della NZCs dei giornalisti geneti...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

Sviluppo embrionale del rene è stato ampiamente studiato sia come modello per l&#39;interazione epitelio-mesenchimale in organogenesi e per guadagnare la comprensione delle origini della malattia renale congenita. Più recentemente, la possibilità di sterzo ingenuo cellule staminali embrionali verso destini nefrogenico è stato esplorato nel campo emergente della medicina rigenerativa. Studi genetici nel topo hanno identificato diversi percorsi necessari per lo sviluppo del rene, e un catalogo globale di trascrizione del gene nell&#39;organo è stata recentemente generato <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> , fornendo regolatori candidato numerose funzioni essenziali dello sviluppo. Organogenesi del rene roditori possono essere studiati in coltura d&#39;organo, e le relazioni molti hanno utilizzato questo metodo per analizzare i risultati delle due proteine ​​applicare candidato o abbattere l&#39;espressione di geni candidati utilizzando siRNA o Morpholinos. Tuttavia, l&#39;applicabilità della cultura d&#39;organo allo studio di segnalazione che regola staminali / differenziazione delle cellule progenitrici verso il rinnovo nel rene di sviluppo è limitato come organi colto contenere una diffusione compatto matrice extracellulare limitazione delle macromolecole e particelle virali. Per studiare la cellula di segnalazione eventi che influenzano le staminali / progenitrici di cellule di nicchia nel rene abbiamo sviluppato un sistema primario cella che stabilisce la zona nefrogenico o cellule progenitrici di nicchia del rene sviluppo ex vivo in isolamento dal induttore di differenziazione epiteliale. Utilizzando limitato digestione enzimatica, le cellule della zona nefrogenica può essere selettivamente liberato dallo sviluppo di reni a E17.5. A seguito di filtrazione, queste cellule possono essere coltivate come un monostrato irregolari con condizioni ottimizzate. Gene marcatore analisi dimostra che queste culture contengono una distribuzione dei tipi di cellule caratteristico della zona nefrogenico in vivo, e che dispongono di idonee espressione del gene marcatore durante il periodo di coltura. Queste cellule sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che facilita enormemente lo studio degli effetti delle cellule staminali candidato / progenitrici regolatore. Parametri cellula base biologici quali proliferazione e morte cellulare così come i cambiamenti nell&#39;espressione di marcatori molecolari caratteristici della nefrone cellule staminali / progenitrici in vivo può essere usato con successo come risultati sperimentali. I lavori in corso nel nostro laboratorio utilizzando questa nuova tecnica cellula primaria mira a scoprire i meccanismi di base che regolano la regolamentazione di auto-rinnovamento contro nefrone differenziazione in cellule staminali / progenitrici.

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

In questo rapporto si descrive un metodo per l&#39;isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione efficiente di percorsi candidato.

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

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Research

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Biology

17.9K Views.  Maine Medical Center Research Institute. In questo rapporto si descrive un metodo per l'isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione effi...

Video: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

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Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolamento e la coltura di cellule embrionali aviaria progenitrici valvolare

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...