Questa ricerca è sostenuta dalla National Science Foundation assegnato a JOD (OCE-0623475), SPC (OCE-0623534 e 0727544), e JHC (OCE OCE-0727587 e-0623508) e dall&#39;Office of Naval Research assegnato a JHC ( N000140810654). KK è supportato dal Programma Postdoctoral Scholar al Woods Hole Oceanographic Institution, con i finanziamenti forniti dalla Fondazione Devonshire.

<ol><li> Per iniziare questa procedura, ci assicuriamo che tutti i componenti SCUVA essere abbastanza potente batteria, registrazione su nastro (per l&#39;alta definizione o una videocamera HD), e funzionano correttamente. A seconda del flusso da misurare, selezionare fotocamera a risoluzione video e frame rate che danno migliori risultati per velocimetria immagine digitale di particelle (DPIV). 1,2 </li><li> Preparare gli alloggiamenti laser e telecamera per l&#39;uso da pulire l&#39;O-ring scanalature e o-ring con un panno pulito o pulire. Produttore diffusione fornito o-ring grasso in modo uniforme sulla o-ring e sostituirli nelle scanalature alloggi. Inoltre, pulire le aperture alloggiamento laser e fotocamera per evitare la deformazione lamiera laser e segna sulla lente fotocamera. </li><li> Controllare l&#39;o-ring mettendo entrambi alloggiamenti vuoti in una vasca piena d&#39;acqua. Oggetti ponderato dovrà essere posizionato sulla parte superiore del carter di sommergere dal loro alloggiamenti galleggiante quando è vuoto. Dopo 5 a 10 minuti, rimuovere gli alloggiamenti dalla vasca e t asciugamano asciuttolui fuori. Verificare se vi è tutta l&#39;umidità all&#39;interno della custodia. Anche considerare l&#39;utilizzo usa e getta, strisce di umidità carta durante la prova di pressione per indicare se c&#39;è umidità nelle sedi dopo il test. </li><li> Dopo le custodie superare il test di pressione, posizionare i componenti all&#39;interno del SCUVA alloggiamenti. </li><li> Collegare scarica ad alta intensità (HID) baccelli luce della fotocamera. Assicurarsi che le luci sono orientate in modo tale che essi illuminano l&#39;area direttamente davanti alla telecamera e operatore, e non interferiscono con il mantenimento presa su maniglie e il funzionamento dei comandi della fotocamera. </li><li> In un ambiente di scarsa luminosità, in modo che il raggio laser è correttamente allineato rispetto alla lente ottica installata nel corpo laser. Se correttamente allineati, il laser / lente aggregazione darà vita a un foglio verticale di luce che è orientato perpendicolarmente alla fotocamera. Per motivi di sicurezza, utilizzare un sensibile alla temperatura foglio di carta per determinare l&#39;orientamento foglio laser. </li&gt; <li> Utilizzando gli allegati SCUVA e rigido, braccio estensibile, collegare l&#39;alloggiamento laser e l&#39;alloggiamento della telecamera tra di loro. Assicurare che le custodie sono saldamente fissati e che i corpi non è possibile ruotare gli uni rispetto agli altri. E &#39;fondamentale che il foglio di laser resta orientato perpendicolarmente al campo visivo della telecamera di vista durante tutta la misura. </li><li> A causa delle attuali capacità di SCUVA, immersioni misura può essere condotta solo in condizioni di scarsa luce o posizioni nelle ore notturne per evitare interferenze luce naturale con il foglio laser. Pertanto, consigliamo di attendere fino al tramonto o poi prima di entrare in acqua. </li><li> Accendere la telecamera prima di entrare in acqua. L&#39;alloggiamento della telecamera ha un sensore di umidità elettronico che fornisce avvisi visivi (luci lampeggianti a LED) in caso di umidità nella fotocamera. Il sensore funziona solo quando l&#39;alloggiamento della telecamera è accesa. </li><li> SCUVA Immergere in acqua e collegare l&#39;apparato a se stessi utilizzandouna linea. Una volta collegato l&#39;apparecchio, rilascio SCUVA per determinare le caratteristiche di galleggiabilità del dispositivo. A seconda delle caratteristiche di galleggiabilità, allegare schiuma galleggiabilità o portare pesi a una o entrambe le sedi per assicurare un assetto neutro e impedire la rotazione del dispositivo in acqua. </li><li> Successivamente, accendere il laser e tenere l&#39;apparato fermo. Posizionare il laser utilizzando il braccio estensibile sufficientemente lontano dal subacqueo per ridurre al minimo la misura di flussi di sub-indotta. Eventuali misure di diver-indotta scorre vicino al bersaglio introdurre errori e non sono utilizzati per successive analisi. Regolare lo zoom della fotocamera fino a quando il campo di fotogrammi visualizzare la destinazione e fluido circostante. </li><li> Pur mantenendo l&#39;apparato fisso, messa a fuoco la telecamera sul foglio laser finché le particelle appaiono nitide ea fuoco. Una volta che l&#39;aereo foglio laser è a fuoco, passare la fotocamera alla modalità di messa a fuoco manuale. Ciò impedirà la fotocamera da rifocalizzazione sugli oggetti che appaiono nel campo dellavista durante la misurazione, con conseguente particelle sfocata nella scheda laser. </li><li> Per calibrare SCUVA, posto un oggetto di dimensioni conosciute nel foglio laser all&#39;interno del campo della telecamera di vista. Record per alcuni secondi. Dopo l&#39;immersione, l&#39;immagine verrà estratta da questa sequenza video per determinare una costante di calibrazione che converte il campo visivo delle unità di pixel a cm. Se in qualsiasi momento l&#39;operatore regola il campo visivo essere ri-posizionare il braccio estensibile o cambiare lo zoom della telecamera durante l&#39;immersione, punti 12 e 13 dovranno essere ripetuti. </li><li> Iniziare l&#39;immersione scendendo per la profondità di lavoro. Quando trova un bersaglio, l&#39;impatto ambientale proprietà di flusso di massa devono essere determinati. Se presente, l&#39;attuale direzione detterà apparecchi e posizionamento subacqueo relativa al target durante le misurazioni. La direzione del flusso di massa che circonda l&#39;obiettivo si può dedurre osservando le bolle espirata dal sub e notando il loro movimento laterale. InOltre a bolle, una piccola quantità di colorante fluorescente (es. fluoresceina) può essere rilasciato per determinare la direzione della corrente. Dal sub-ha generato un flusso può essere una fonte di errore di misura DPIV, il subacqueo non deve essere posizionato a monte del bersaglio. Inoltre, il foglio laser deve essere posizionato parallelamente alla direzione della corrente in modo da massimizzare il tempo di permanenza delle particelle all&#39;interno del foglio di laser, riducendo al minimo gli errori DPIV. Tuttavia, se nessun flusso di corrente o di massa è presente, subacqueo e posizionamento SCUVA relativo al target sono senza restrizioni. </li><li> Posizione di SCUVA per illuminare e registrare il movimento fluido che circonda un bersaglio. Se si tenta di registrare il flusso che circonda un oggetto in movimento prima di prevedere la posizione del bersaglio, e poi SCUVA posizione del Parlamento al luogo previsto, pur rimanendo immobile. Quando il target si muove attraverso campo visivo della telecamera di vista, iniziare la registrazione. Se il bersaglio è immobile, incorniciano il target e fluido circostante nella videocamera e# X2019; s campo di vista e iniziare a registrare, pur rimanendo immobile. L&#39;operatore deve astenersi da movimenti di rotazione e out-of-plane durante la registrazione video poiché questi movimenti in conseguenza dei risultati erronei DPIV. Pertanto, le misurazioni raccolte durante rotazione e out-of-plane mozioni subacqueo non saranno utilizzati per ulteriori analisi dei dati. </li><li> Una volta collezione di video è completo, spegnere tutti i componenti di SCUVA e ripristinare il braccio laser in posizione chiusa. Rimuovere SCUVA dall&#39;acqua e staccare la telecamera e custodie laser dal braccio. Sciacquare o immergere l&#39;apparecchio in acqua dolce prima di asciugare per prevenire la ruggine degli apparecchi. Una volta che i contenitori vengono essiccati, rimuovere i componenti dalla alloggiamenti, e ricaricare le batterie e sostituire, se necessario, per un altro tuffo. </li><li> Collegare la videocamera a un computer ed estrarre il video dal nastro HD utilizzando un pacchetto software di video HD (ad esempio, Adobe Premiere Pro o iMovie). Dopo che il video è estratto, determinare l&#39;intervallo divideo da convertire in una serie di immagini per l&#39;analisi DPIV. Assicurare che le proporzioni pixel e le dimensioni delle immagini estratte corrispondere alle impostazioni video HD. </li><li> Queste immagini sono importate in un programma di elaborazione DPIV (cioè, Davis o MatPIV). Dopo la selezione corretta costante di calibrazione e parametri di acquisizione delle immagini, che sono spinto dal pacchetto software DPIV, campi di velocità possono essere generati a partire da immagini di particelle consecutive. Ulteriori fasi di post-processing, a seconda della qualità e tipi di misure, può essere applicato anche 3. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Quando il protocollo è fatto correttamente, le immagini delle particelle circostanti l&#39;obiettivo sarà forte e facile da distinguere. Utilizzando i campi delle particelle catturate in situ da una videocamera SCUVA (Figura 1A) e un pacchetto di elaborazione DPIV software, campi di velocità del flusso che circonda il bersaglio (Figura 1B) sarà rivelato. Vettori nel Velocity campo indicano entità e la direzione della velocità del flusso locale. Se il video è sufficiente raccolte per fornire una serie temporali di immagini, una serie storica dei campi di velocità può essere anche determinato. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1, misurato nei campi delle particelle in situ (A) che circondano Aurelia labiata. Velocità di campo corrispondente (B) con vettori gialli che indicano la direzione del flusso e la grandezza. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 Nei campi di particelle in situ circostanti Mastigias sp. Solmissus e sp. (A e B, rispettivamente). Freccia rossa in A indica una regione di alta riflettività, che provoca la saturazione dell&#39;immagine, il che rende difficile distinguere tra le particelle e il bersaglio. Freccia rossa in B indica una regione di striature che risulta quando la portata èNon campionati ad una frequenza abbastanza alta.

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	<li>Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-imaging+techniques+for+experimental+fluid+mechanics.">Particle-imaging techniques for experimental fluid mechanics.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 23, 261-304 (1991).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Raffel, M., Willert, C., Wereley, S., Kompenhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry: A Practical Guide. , (2007).</li><li>Agrawal, Y. C., Pottsmith, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+diffraction+particle+sizing+in+STRESS.">Laser diffraction particle sizing in STRESS.</a> Cont. Shelf Res. 14, 1101-1121 (1994).</li><li>Katz, J., Donaghay, P. L., Zhang, J., King, S., Russell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submersible+holocamera+for+detection+of+particle+characteristics+and+motions+in+the+ocean.">Submersible holocamera for detection of particle characteristics and motions in the ocean.</a> Deep Sea Res. 46, 1455-1481 (1999).</li><li>Katija, K., Dabiri, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+field+measurements+of+aquatic+animal-fluid+interactions+using+a+self-contained+underwater+velocimetry+apparatus+(SCUVA).">In situ field measurements of aquatic animal-fluid interactions using a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA).</a> Limnol. Oceanogr.-Meth. 6, 162-171 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un vincolo potenzialità nel campo è la necessità di particelle nel flusso, che sono necessarie per realizzare l&#39;immagine digitale velocimetria di particelle (DPIV). In acque costiere, le particelle in sospensione presenta dimensioni dell&#39;ordine di 10 micron di diametro e concentrazioni tra 0,002 e 10 per mm 3. 4 studi Ulteriori holocamera utilizzando un sommergibile per il rilevamento di particelle confermare sufficiente presenza di particelle di semina per eseguire DPIV in acqua dell&#39;oceano. 5 Durante mare aperto e le immersioni oceaniche delle coste, abbiamo trovato che la densità delle particelle e le dimensioni non sono un vincolo per lo svolgimento in loco DPIV. Oltre a densità delle particelle e le dimensioni, un&#39;altra preoccupazione rilevante per le misure DPIV è l&#39;omogeneità delle concentrazioni di particelle. Qualitativamente, se una regione all&#39;interno di una finestra di interrogazione è concentrazioni di particelle più grande di un altro, la grandezza velocità generata dal DAnalisi PIV sarà sbilanciata verso la regione con le concentrazioni di particelle superiore. Pertanto, le misure devono essere condotte SCUVA dove la concentrazione di particelle variabilità è ridotta al minimo. Abbiamo trovato concentrazioni thatcle sono relativamente costanti durante le concentrazioni di particelle sono relativamente costanti durante le immersioni in cui è sospeso il subacqueo a metà della colonna d&#39;acqua. Tuttavia, i campi di particelle in ambienti bentonici hanno il potenziale di disomogeneità a causa della risospensione delle particelle da flussi ambientali o sub-indotta in prossimità del fondo del mare. Si deve prestare attenzione al minimo le disfunzioni delle particelle durante le misurazioni in ambienti bentonici. A conoscenza degli autori &#39;, un&#39;analisi formale di errori generati da campi disomogenea concentrazione di particelle non è stata condotta sia in condizioni di laboratorio o sul campo, e dovrebbe essere un argomento da approfondire in una pubblicazione separata. Diversi problemi diversi devono essere considerati durante la preparazione econdurre esperimenti in situ utilizzando il protocollo. Durante la registrazione, l&#39;operatore è incaricato di rimanere fermo e astenersi da tutte le out-of-plane e il movimento di rotazione. Questa richiesta è semplice, in teoria, ma difficile nella pratica, e queste misure richiedono avanzate abilità subacquee per essere completata. Fuori dal piano e movimenti di rotazione del risultato dell&#39;operatore in DPIV dati errati. Tuttavia, nel piano mozioni possono essere corretti utilizzando il software in-house. 6 Si raccomanda agli operatori di praticare il controllo dell&#39;assetto per diverse immersioni prima di utilizzare SCUVA per massimizzare l&#39;efficienza di misura. Oltre a considerazioni di galleggiabilità, l&#39;operatore deve essere consapevole della direzione del flusso di destinazione. Flussi che viaggiano fuori dal piano relativo al foglio di laser non produrrà risultati affidabili DPIV, e l&#39;operatore deve orientare SCUVA per catturare questi flussi più efficace. Inoltre, la posizione del subacqueo rispetto l&#39;obiettivo deve essere selected in modo da ridurre al minimo il flusso sub-indotta nelle misure. Diver-indotta flusso introduce errore al flusso di destinazione e le misure che includono effetti subacqueo non deve essere utilizzato per ulteriori analisi. Nel caso in cui il bersaglio ha una superficie altamente riflettente, la regione del fluido che circonda l&#39;obiettivo sarà fortemente illuminato, il che rende difficile distinguere vicina singole particelle di fluido circostante (regione indicata dalla freccia rossa, figura 2A). I filtri polarizzatori o può essere aggiunto al alloggiamenti laser o la fotocamera per ridurre l&#39;intensità della luce laser catturati dal sensore della fotocamera video. Se questo non è possibile a causa di vincoli logistici e accesso limitato alle attrezzature, post-processing di immagini utilizzando il software in-house in grado di fornire sufficiente correzione sottraendo dalle immagini le intensità dei pixel elevato vicino al bersaglio. Un&#39;altra considerazione che riguarda la qualità dei dati è se DPIV striature delle particelle sono presenti. Se la particellai campi sono regioni di striature (indicato dalla freccia rossa, figura 2B), la videocamera sta registrando con un frame rate troppo basso per risolvere queste alte velocità. Aumentando il frame rate, striature di particelle può essere ridotto. Tuttavia, questo si traduce in una riduzione di luce che raggiunge il sensore videocamera e rende il campo dimmer particella look. Se la videocamera ha la possibilità di impostare manualmente le impostazioni di apertura, aumentare l&#39;impostazione di apertura per evitare oscuramento del campo delle particelle. Determinare le impostazioni del dispositivo ottimale può richiedere più immersioni con SCUVA successo prima raccolta dei dati.

quantitatively measuring in situ flows using a self-contained underwater velocimetry apparatus (scuva)

La possibilità di misurare direttamente i campi di velocità in un ambiente fluido è necessario fornire i dati empirici per gli studi in campi diversi come l&#39;oceanografia, ecologia, biologia e meccanica dei fluidi. Introdurre misure di campo sfide pratiche come le condizioni ambientali, la disponibilità degli animali, e la necessità di campo compatibili tecniche di misura. Per evitare queste sfide, gli scienziati utilizzano in genere ambienti controllate di laboratorio per lo studio delle interazioni fluido-animale. Tuttavia, è ragionevole chiedersi se si può estrapolare il comportamento naturale (cioè quella che avviene in campo) da misure di laboratorio. Pertanto, in situ misure di flusso quantitativo sono necessari per descrivere accuratamente il nuoto degli animali nel loro ambiente naturale. Abbiamo progettato un self-contained, dispositivo portatile che funziona indipendentemente da qualsiasi collegamento con la superficie, e può fornire misurazioni quantitative dei surrou campo di flussoending un animale. Questo apparecchio, un apparecchio autonomo per velocimetria subacquea (SCUVA), può essere azionato da un subacqueo solo in profondità fino a 40 m. A causa della complessità intrinseca delle condizioni di campo, le considerazioni aggiuntive e preparazione sono necessari rispetto alle misure di laboratorio. Queste considerazioni includono, ma non sono limitati a, movimento dell&#39;operatore, prevedere la posizione dei target di nuoto, disponibile particolato naturale sospeso, e l&#39;orientamento di SCUVA rispetto al flusso di interessi. Il seguente protocollo ha lo scopo di affrontare queste sfide campo comune e per massimizzare il successo di misura.

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

Questo protocollo fornisce le istruzioni su come utilizzare un apparecchio autonomo subacqueo velocimetria (SCUVA), che è progettato per la quantificazione in situ di animali generati flussi. Inoltre, questo protocollo affronta le sfide poste dalle condizioni del campo, e comprende il movimento dell&#39;operatore, la posizione di previsione degli animali, e l&#39;orientamento di SCUVA.

Misura quantitativamente In situ Flussi utilizzando un autorespiratore subacqueo Velocimetry (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

quantitatively-measuring-situ-flows-using-self-contained-underwater

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

12.9K Views.  Woods Hole Oceanographic Institution. Questo protocollo fornisce le istruzioni su come utilizzare un apparecchio autonomo subacqueo velocimetria (SCUVA), che è progettato per la quantificazione in situ di animali generati flussi. Inoltre, questo protocollo affronta le sfide poste dalle condizioni del campo, e comprende il movimento dell'operatore, la posizione di previsione degli animali, e l'orientamento di SCUVA.

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Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Fondamenti electrospinning: Soluzione Ottimizzazione e parametri Apparatus

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Ricerca

Bioingegneria

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-Particle Image Velocimetry per Velocity Misure profilo dei flussi Micro sangue

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM di assemblee biologiche in liquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

Appositamente studiata apparecchi di riscaldamento a base laser per la Release Innescata di Cisplatino da termosensibile liposomi con Risonanza Magnetica Guidance Immagine

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Apparato per la raccolta del tessuto microcolonne

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Meso-scala Particle Image Velocimetry studi di Neurovascular scorre In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...