Siamo grati a Samuel Shepard, Peter Bazeley e John David Bell per la gestione delle pagine web Genomic risonanza magnetica. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation Career &quot;Indagine su introne ruoli cellulare&quot; premio [codice di autorizzazione MCB-0643542].

Tutti i programmi usati nel documento sono stati scritti usando perl, e tutte le pagine web sono stati creati utilizzando PHP. 1. Punto di partenza: Aprire la home page del pacchetto on-line Genomic RM http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / gmri /. La risorsa web fornisce anche istruzioni / spiegazioni sui programmi nella &quot;Guida (How-to/README)&quot; anello di collegamento, mentre tutto il materiale pubblicato sul Genomic algoritmi di risonanza magnetica e simili sono elencati nella sezione &quot;Links a risorse rilevanti&quot;. 2. Preparazione e caricamento della sequenza di ingresso (s). Creare un file con formato FASTA-sequenza (s) per avviare una sessione di analisi GMRI. Ogni sequenza nucleotidica in questo formato dovrebbe essere preceduto da una singola linea di partenza con il carattere &quot;&gt;&quot; che rappresenta un identificatore, seguito sulla stessa linea da una breve descrizione di questa sequenza. Sequenze nucleotidiche per l&#39;analisi GMRI permette anche personaggi come R, Y, N, X, ecc Hwever, non-A, T, C, G personaggi non saranno trattati dal programma e verrà ignorato. Le sequenze in cui gli elementi ripetitivi sono state &quot;mascherate&quot; (sostituito da &quot;N&quot; s) può essere utilizzato come input. Nota che i caratteri sequenza sono case insensitive. <ol><li> Iniziare una sessione GMRI cliccando sul pulsante &quot;Start o Riprendi&quot; sulla pagina Genomic casa risonanza magnetica. Questo porta l&#39;utente a una pagina in cui sequenze nucleotidiche può essere caricato. </li><li> Copia e incolla il tuo FASTA formattati sequenze o caricare un file contenente le sequenze dal computer locale utilizzando il tasto &quot;scegli file&quot;. </li><li> Clicca sul &quot;nuovo inizio sessione con questo file&quot; pulsante. Un messaggio di conferma apparirà sopra la finestra di input affermando che &quot;La sequenza è stato caricato con successo&quot; e si dovrebbe anche ottenere una alfanumerico &quot;GMRI identificatore&quot; [il sito lo definisce un &quot;marchio di sessione&quot;] per la sessione (ad esempio b16yMj), che può essere utilizzato per recuperare e continuare una sessione per un massimo di due settimane dopo il primo utilizzo. </li></ol> NOTA: D&#39;ora in poi le sequenze di ingresso sono denominati &quot;userfile&quot;. 3. Ottenere una distribuzione di frequenza Oligonucleotide delle sequenze di input (opzionale). Clicca su &quot;SRI Analyzer&quot; scheda (riga in alto) al fine di ottenere una distribuzione di frequenze oligonucleotide per l&#39;intero set di sequenze di input. L&#39;acronimo sta per SRI a corto raggio disomogeneità. A questo punto, l&#39;utente può specificare la lunghezza massima di oligonucleotidi (da 2 fino a 9 nucleotidi, predefinito 6 NTS) per i quali frequenze verranno calcolati. Questa selezione viene fatta cliccando sull&#39;opzione desiderata all&#39;interno del &quot;Dimensione massima oligomeri&quot; casella di riepilogo. Quindi premere il pulsante &quot;Analizza File&quot; per avviare il calcolo. Una rappresentazione approssimativa della composizione sequenza di input verrà immediatamente visualizzato come una tabella breve nel mezzo di questa pagina web e scaricabile come &quot;userfile.comp.tbl&quot;. Questo tavolo rappresenta solo gli oligonucleotidi più e il meno abbondante nei sequenze di input. La tabella di frequenza per tutti gli oligonucleotidi possibile è generato come un file chiamato &quot;userfile.comp&quot;, che può essere ottenuto attraverso il &quot;Download file di composizione&quot; link. NOTA: SRI analizzatore conta l&#39;intero insieme di tutte le oligonucleotidi che si sovrappongono. 4. Generare sequenze casuali con la stessa composizione oligonucleotidi Come in sequenze di input (opzionale). (Completamento della fase 3 del protocollo è necessario per questo compito). <ol><li> Clicca su &quot;Generatore di SRI&quot; scheda (riga in alto) per aprire una nuova pagina web che crea sequenze casuali. Scegli il numero di campioni di sequenze casuali da generare utilizzando la casella di riepilogo in questa pagina web. Ognuno di questi file di esempio contengono sequenze casuali del numero e della stessa lunghezza, come le sequenze di ingresso in &quot;userfile&quot;. Inoltre, se una sequenza di input contiene non-A, T, C, G o caratteri, la sequenza casuale avrà s &quot;N&quot; esattamente le stesse posizioni nella sequenza di input. </li><li> Scegli la più lunga durata di oligonucleotidi per i quali frequenze sarà approssimato nelle sequenze casuali. Questo può essere scelto selezionando il pulsante di opzione per il livello oligomero desiderato (ad esempio &quot;4-mers&quot; per quattro-base oligonucleotidi) nella tabella al centro dello schermo. E &#39;da notare che sequenze casuali sarà composto non solo le frequenze approssimativa a livello oligomero scelto, ma anche le frequenze dei corrispondenti livelli di oligomeri più brevi, come nelle sequenze di input. Piccole fluttuazioni nella oligonucleotidefrequenze di ingresso e di sequenze casuali sono possibili in base al metodo del modello di Markov applicato per la generazione di sequenze casuali. </li><li> Avviare il programma facendo clic sul pulsante &quot;Generate File&quot;. Se le sequenze di input sono di grandi dimensioni potrebbe richiedere un paio di minuti per generare sequenze casuali. Quindi, un utente deve attendere blu &quot;Download&quot; link appaiono in fondo a questa pagina. I set casuali sono posti in file con nomi come &quot;userfile.randX_Y&quot; dove X è il numero del set casuale e Y è il livello oligomero scelto (ad esempio &quot;userfile_rand2_4&quot;). </li></ol> 5. Analisi di Mid-Range disomogeneità (MRI) di ingresso e sequenze casuali. <ol><li> Clicca su &quot;MRI Analyzer&quot; scheda (riga superiore), che apre una nuova pagina web che analizza il mid-range disomogeneità della composizione delle sequenze nucleotidiche. </li><li> Selezionare una sequenza da analizzare dalla &quot;File da analizzare&quot; casella di riepilogo (una scelta tra la sequenza di input e set di sequenze casuali generati possono essere fatti qui). </li><li> Scegli il tipo di contenuto della risonanza magnetica da analizzare attraverso la casella di riepilogo in dotazione. (Sette opzioni contenuti sono disponibili: G + C, G + A, G + T, A, G, C o T.) </li><li> Scegliere la lunghezza della finestra per cui le sequenze ricche di contenuti e povero di contenuti sarà esaminato tramite la casella &quot;dimensioni Finestra&quot; lista (di default è di 50 nucleotidi, l&#39;intervallo valido da 30 a 1000). </li><li> Scegli la soglia superiore e inferiore della soglia per le regioni ricche di contenuti e povero di contenuti, rispettivamente. Queste soglie possono essere definite in base al numero esatto di nucleotidi particolare nella finestra corrente (utilizzando l&#39;opzione di numero nella casella di riepilogo) o in percentuale di questi nucleotidi nella finestra (utilizzando l&#39;opzione di percentuale) </li><li> Dopo che tutte e cinque le scelte sono state fatte (per esempio: Sequenza = &quot;userfile&quot; Content = GC; dimensioni della finestra = 50; soglia superiore = 35; soglia inferiore = 15), richiamare il programma premendo il pulsante Analizza file. Il programma esegue una scansione di tutte le sequenze da l&#39;ingresso selezionato consecutivamente. Ad ogni passo si ottiene un segmento della sequenza corrente con durata pari alla dimensione della finestra specificata e calcola se il numero o la percentuale di nucleotidi del contenuto scelto è al di sopra della soglia superiore o inferiore alla soglia inferiore. Se la finestra non corrisponde né criteri, la finestra successiva sovrapposizione (spostato di un solo nucleotide) viene selezionata per la stessa analisi. Quando una finestra in cui si trova la sequenza soddisfa uno dei requisiti di soglia per i contenuti ricchi o poveri di composizione, il programma salva la sequenza di questa finestra nel file di output e genera un picco in uscita grafica. Dopo di ciò, il programma salta alla prossima non sovrapponibili finestra adiacente e riprende il processo di scansione fino alla fine della sequenza è raggiunta. </li><li> Dopo il completamento del programma, un collegamento al file di output (con il nome &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot; per l&#39;esempio sopra) appare e una rappresentazione grafica dei risultati viene visualizzato al centro della pagina web (vedi Figura 1). Su questo display grafico tutte le sequenze di input dal userfile sono concatenati in un&#39;unica stringa e presentata come una linea nera orizzontale sull&#39;asse X, con lunghezza in kilobasi (kb) mostrato di seguito. Tutti i contenuti regioni ricche lungo sequenze di input sono contrassegnati come blu &quot;in alto&quot; picchi e contenuti regioni povere come il rosso &quot;in basso&quot; punte. Il numero totale delle finestre di contenuti ricchi e poveri di contenuti sono riportati nella parenthses nella legenda in fondo di questa figura (32 e 19, rispettivamente). La figura serve ad illustrare l&#39;abbondanza relativa e la disposizione delle regioni risonanza magnetica. Nel frattempo i dettagli specifici sono presentati nel file di output (vedi Figura 3). In questo file, tutti i segmenti di sequenza di nucleotidi che corrispondono contenuti ricchi o poveri criteri e le loro coordinate sono disponibili per un utente come un elenco in base alla loro posizioni consecutive lungo le file di input. </li><li> Dopo il completamento di analisi MRI per la sequenza scelta l&#39;utente può avviare un nuovo processo nella stessa pagina web apportando modifiche ai parametri e / o file di input. Per esempio, per esaminare il campione precedentemente casuali generati # 1 con gli stessi parametri RMN, l&#39;utente deve solo modificare il file di analizzare opzione e selezionare il file &quot;userfile_rand1_4&quot;, e quindi premere il pulsante Analizza file. Un nuovo file e la visualizzazione grafica andrà a sostituire quello vecchio. I risultati e le cifre di tutti gli esami sotto ogni &quot;sessione di etichetta&quot; (GMRI identificativo) verrà salvato e reso disponibile per due settimane dalla ultima attività. Al fine di salvare i risultati / ficoUres in modo permanente, l&#39;utente deve selezionare l&#39;opzione &quot;Scarica file&quot; scheda (riga superiore) e scaricare l&#39;intera sessione o singoli file, se necessario. </li><li> Con questa pagina web MRI Analyzer un utente può studiare <ul><li> (G + C)-ricchi e (A + T)-regioni ricche </li><li> Purina (A + G)-ricchi e pirimidina (C + T) le regioni ricche di </li><li> Keto (G + T)-ricchi e aminoacidi (A + C)-regioni ricche </li><li> Regioni ricche A-e A-poveri </li><li> Le regioni ricche di G e G-poveri </li><li> T-regioni ricche e T-poveri </li><li> C-C-ricchi e poveri regioni </li></ul></li><li> L&#39;ultima versione di Genomic risonanza magnetica ha una nuova opzione per lo studio delle regioni ricche in purine (R) / pirimidina (Y) modelli di alternanza che potrebbero formarsi Z-DNA conformazioni. Attualmente questa opzione è disponibile dal link &quot;Z-DNA&quot; e funziona sulla stessa base di altre regioni di cui sopra risonanza magnetica. Un utente deve selezionare le soglie inferiori e superiori per il numero di (RY + YR) dinucleotidi sovrapposizione nella finestra di scansione. Il programma produce un output simile grafica e un file di segmenti di DNA arricchito e impoverito, alternando purine e pirimidine. Il presunto Z-DNA regioni devono essere altamente arricchito alternando R / Y basi (vedi recensione F &amp; F 2011). </li></ol> 6. I programmi nel quadro del pacchetto Genomic RM (opzionale). La risorsa Genomic RM ha inoltre due opzioni avanzate per la generazione di sequenze casuali molto specifiche. Sono disponibili attraverso il &quot;Generatore di risonanza magnetica&quot; e &quot;CDS Generator&quot; schede nella riga superiore. <ol><li> Generatore di risonanza magnetica crea sequenze randomizzati con la stessa composizione oligonucleotide come il file di input (simile a SRI generatore). Tuttavia, in aggiunta, le sequenze randomizzati imitare un modello particolare risonanza magnetica specificato dall&#39;utente. All&#39;interno di questa pagina web che un utente deve specificare da una casella di riepilogo un modello particolare risonanza magnetica per essere imitato. La casella di riepilogo contiene tutti i modelli che sono stati esaminati in questa sessione di analizzatore di risonanza magnetica (es. &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;). Una sequenza casuale generato con questa opzione hanno la stessa composizione oligonucleotide del file di input selezionato e anche lo stesso GC-ricchi e poveri di modelli di come si è visto in &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;. </li><li> CDS generatore è utilizzato per la randomizzazione di sequenze codificanti proteine. Conserva la stessa sequenza aminoacidica come quella codificata dalla specificati dall&#39;utente ingresso. Inoltre, il programma conserva la codone stesso e di-codone pregiudizi, come specificato nel scelto dall&#39;utente tabella di input. La versione online del generatore CDS accetta anche una sequenza di proteine ​​come input. Tutte le altre opzioni per il programma sono offerte solo tramite script Perl stand-alone disponibile per il download dalla pagina Web principale di Genomic risonanza magnetica. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati Questo protocollo permette ad un utente di studio disomogeneità compositiva delle sequenze nucleotidiche. Importante, supporta anche la generazione di una serie di sequenze randomizzati con una composizione oligonucleotide approssimazione che delle sequenze di input. Di solito, le sequenze genomiche di eucarioti complessi non sono omogenei nella composizione, ma rappresentano invece un complesso mosaico di segmenti di sequenza di nucleotidi arricchito da particolari (ad esempio, ricchi di purine, (G + T)-ricchi, (A + T)-ricchi, ecc.) Questi modelli di fascia media scala (3-10 bp) sono visualizzati con l&#39;output grafico di analizzatore di risonanza magnetica che mostra selezionato ricchi di contenuti come i segmenti superiori picchi blu e poveri di contenuti, come i segmenti più bassi picchi rossi (vedi figure 1 e 2). Tipicamente, il numero di regioni ricche di contenuti e povero di contenuti in una sequenza naturale (Figura 1) è nell&#39;ordine di volte superiore al numero degli stessi tipi di regioni corrispondenti sequenze randomizzati (Figura 2) avere la stessa oligonucleotide composizione. Questi segmenti sequenza con mid-range disomogeneità nella composizione dei nucleotidi possono essere di interesse per l&#39;utente. Sono disponibili i file di output Genomic risonanza magnetica per ulteriori indagini. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un esempio di output analizzatore di risonanza magnetica grafico a partire dal punto 5.7. I risultati sono stati ottenuti su un campione di 44 introni umani. Barre blu rappresentano le posizioni di GC regioni ricche lungo questi introni. Barre rosse rappresentano GC-poveri (o ricchi) MRI regioni. L&#39;asse y contiene soglie inferiori e superiori per il tipo di contenuti. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. MRI uscita analizzatore per la sequenza casuale &quot;userfile.rand1_4&quot;. Il graficamentecal rappresentazione di risonanza magnetica all&#39;interno di una sequenza generata in modo casuale utilizzando il programma generatore di SRI. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un esempio l&#39;inizio di un file di output testuale da analizzatore di risonanza magnetica. Tutte le sequenze ricche di contenuti e povero di contenuti individuati dal programma sono presentati negli ultimi (quarto) colonna. Le loro posizioni relative, misurata in numero di finestre, sono riportati nella prima colonna. La seconda e terza colonna sono indicatori per le regioni ricche di contenuti e povero di contenuti, rispettivamente.

<ol>
	<li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures.">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li><li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales.">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li><li>Fedorov, A., Fedorova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+An+Intricate+Mosaic+of+Genomic+Patterns+at+Mid-range+Scale.">Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale.</a> Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).</li><li>Shepard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+Binary-abstracted+Markov+models+and+their+application+to+sequence+classificatio.">Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio.</a> The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , 57-157 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Regioni con disomogenea composizione nucleotide al mid-range scale (3-10 nucleotidi) sono sovrabbondante nel genoma degli eucarioti complessi e possono essere trovati ovunque (regioni intergeniche, introni, regioni non tradotte degli esoni, elementi ripetitivi). Queste regioni sono frequentemente associate con conformazioni del DNA insolito. Per esempio, le sequenze purine-/pyrimidine-rich tendono a formare triplexes DNA (H-DNA), con alternanza di sequenze purina / pirimidina basi sono associati con Z-DNA conformazioni; (G + C)-regioni ricche mostrano anomalie strutturali in B- DNA e potrebbe essere soggetta a scissione spina dorsale; (A + T)-regioni ricche potrebbe formare un insolito struttura - un elemento di svolgimento del DNA, ecc (recensito da Fedorov &amp; Fedorova 2010). Alcuni di questi modelli di fascia media (ad esempio (G + T)-regioni ricche) sono scarsamente indagato e ancora in attesa di esplorazione approfondita e riconoscimento. L&#39;obiettivo principale della nostra risorsa Genomic web MRI è quello di aiutare gli utenti nella individuazione di queste regioni MRI per la loro ulteriore analisi sperimentale e per l&#39;esplorazione delle loro funzioni possibili. Conoscenza delle regioni MRI potrebbero essere inserite in e migliorare la nuova generazione di programmi predittore gene (Shepard 2010) e migliorare la nostra comprensione delle funzioni del genoma e proprietà.

<ul><li> Computer con Internet </li><li> I file con sequenze di nucleotidi per l&#39;esame. </li></ul>

genomic mri - a public resource for studying sequence patterns within genomic dna

Regioni non codificanti genomiche negli eucarioti complesso, comprese le zone intergeniche, introni, e segmenti non tradotti degli esoni, sono profondamente non casuale nella loro composizione nucleotidica e consistono in un complesso mosaico di modelli di sequenza. Questi modelli includono i cosiddetti Mid-Range disomogeneità (MRI) le regioni - sequenze di 3-10 nucleotidi di lunghezza che si arricchiscono di una base particolare o una combinazione di basi (ad esempio (G + T)-ricchi, ricchi di purine, ecc ). Regioni risonanza magnetica sono associati con le strutture del DNA insolito (non-B-forma) che sono spesso coinvolte nella regolazione dell&#39;espressione dei geni, ricombinazione e altri processi genetici (Fedorova e Fedorov 2010). L&#39;esistenza di un pregiudizio forte fissazione all&#39;interno delle regioni risonanza magnetica contro le mutazioni che tendono a ridurre la loro disomogeneità sequenza supporta inoltre la funzionalità e l&#39;importanza di queste sequenze genomiche (Prakash et al. 2009). Qui mostriamo una risorsa liberamente disponibile su Internet - il pacchetto di Genomic MRI programma - (. Bechtel et al 2008) progettato per l&#39;analisi computazionale di sequenze genomiche al fine di individuare e caratterizzare i vari modelli di risonanza magnetica al loro interno. Questo pacchetto permette inoltre la generazione di sequenze randomizzati con diverse proprietà e il livello di corrispondenza alle sequenze naturali del DNA di ingresso. L&#39;obiettivo principale di questa risorsa è quello di facilitare l&#39;esame di vaste regioni di DNA non codificante, che sono ancora poco indagato e attendono l&#39;esplorazione approfondita e riconoscimento.

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Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Vi presentiamo un sito web pubblico computazionali per l&#39;analisi di sequenze genomiche. Rileva schemi sequenza di DNA con diverse composizioni nucleotide non casuale. Questa risorsa genera anche sequenze randomizzati con diversi livelli di complessità.

Genomica risonanza magnetica - una risorsa pubblica per lo Studio Patterns sequenza all&#39;interno del DNA genomico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

genomic-mri-public-resource-for-studying-sequence-patterns-within

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Views.  University of Toledo Health Science Campus. Vi presentiamo un sito web pubblico computazionali per l'analisi di sequenze genomiche. Rileva schemi sequenza di DNA con diverse composizioni nucleotide non casuale. Questa risorsa genera anche sequenze randomizzati con diversi livelli di complessità.

Video: Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Ricerca

Biologia

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Studiare età-dipendente instabilità genomica utilizzando il S. Saccharomyces Modello Durata cronologica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Trasformazione genomica del Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico da kit di raccolta del sangue per Plasma Proteina Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...