Il pirosequenziamento è una tecnica di sequenziamento per sintesi che può essere utilizzata per genotipizzare polimorfismi a singolo nucleotide nel DNA mitocondriale. Questo metodo è vantaggioso nella sua facilità di implementazione e convenienza rispetto ad altri metodi di sequenziamento. Può essere facilmente utilizzato come metodo diagnostico per alcune malattie mitocondriali determinando i valori di eteroplasmia delle varianti patogene nel DNA mitocondriale.
Per iniziare, ottenere un file di sequenza del DNA mitocondriale per la specie da genotipizzare e identificare la posizione del polimorfismo a singolo nucleotide, o SNP. Assicurarsi che la sequenza di riferimento utilizzata utilizzi la numerazione di base appropriata per la mutazione studiata in modo che la posizione dell'SNP possa essere facilmente identificata. Copiare 1.000 coppie di basi a monte e a valle del sito SNP e incollare la sequenza troncata nel software di progettazione del primer di pirosequenziamento.
Evidenziare la base polimorfica, fare clic con il pulsante destro del mouse su di essa, quindi selezionare Imposta regione di destinazione per impostare la base SNP analizzata come destinazione del saggio di pirosequenziamento. Premi l'icona Play nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia per avviare la selezione del primer e attendi che il software generi automaticamente i trii di primer, due primer per la preamplificazione del DNA del modello e il terzo primer per il sequenziamento mediante sintesi nella macchina di pirosequenziamento. Fate clic con il pulsante destro del mouse e selezionate Copia tutti i set di primer per conservare tutti i set di primer.
Aprire il software di esecuzione fornito con il pirosequenziatore, selezionare Nuovo test, quindi selezionare il modello di saggio di quantificazione allelico. Inserire la sequenza da analizzare nella casella corrispondente digitando i nucleotidi direttamente a valle del primer di sequenziamento. Per la posizione variabile, indicare le due possibili basi, separate da una barra.
Premere Genera ordine di dispensazione e lasciare che il software determini automaticamente un ordine adatto per i nucleotidi da erogare nel sequenziamento per reazione di sintesi. Salvare e specificare un nome per il test. Successivamente, eseguire la corsa diluendo il DNA da analizzare a 5 nanogrammi per microlitro.
Nella prima esecuzione, assicurarsi di includere campioni di eteroplasmia nota come riferimento e campioni wild-type. Quindi eseguire una PCR di presequenziamento di 5 microlitri di DNA diluito e reazioni da 25 microlitri, utilizzando i primer e i parametri di amplificazione. Per eseguire l'impostazione del file, selezionare Nuova esecuzione nel software pirosequenziale.
Il pirosequenziatore può sequenziare simultaneamente 48 reazioni preamplificate separate con un quadrato vuoto che rappresenta un singolo pozzo di sequenziamento su un disco di pirosequenziamento. Caricare i saggi facendo clic con il pulsante destro del mouse su un quadrato e selezionando Carica test. Se necessario, sequenziare fino a quattro saggi separati con diversi primer di sequenziamento.
Impostare la modalità di dispensazione del primer su automatica per assegnare automaticamente una camera di iniezione per ciascun primer di sequenziamento utilizzato per la corsa. Impostare la modalità di esecuzione su standard, a meno che non si eseguano quattro diversi tipi di test su un disco di sequenziamento. Assicurarsi che il numero di test sul file modello di esecuzione corrisponda al numero di reazioni PCR amplificate.
Quindi salvare i file eseguiti su un'unità USB. Per innescare il pirosequenziatore, premere il pulsante di pulizia sul touchscreen principale del dispositivo e pulire tutti gli iniettori con acqua ad alta purezza, seguendo le istruzioni sullo schermo. Quando si inserisce la striscia assorbente nella macchina, assicurarsi che le estremità si incontrino nella posizione a ore 9.
Dopo aver collegato la chiavetta USB, premere il pulsante Sequenza per caricare i file di esecuzione preparati in precedenza. Seguire le istruzioni sul dispositivo per caricare e innescare i reagenti, come richiesto, negli iniettori corrispondenti sulla macchina. Caricare 3 microlitri di perline nei pozzetti, quindi caricare 10 microlitri di ciascuna reazione PCR da sequenziare nel campione corrispondente.
Pipettare su e giù per mescolare il campione con le sfere magnetiche. Cerca l'indicazione nel pirosequenziatore innescato che il disco può essere caricato nella macchina. Svitare il dado di fissaggio della piastra e allineare la piastra di campionamento caricata con il perno metallico nello scomparto del disco.
Una volta che la piastra è saldamente avvitata nel vano della piastra, avviare la sequenza premendo il pulsante di avvio sull'interfaccia touchscreen. Una volta completata l'esecuzione, rimuovere l'unità USB dalla macchina e ricollegarla al computer su cui è in esecuzione il software pirosequenziale. Dopo che il file di esecuzione appena generato viene visualizzato sull'unità USB, fare doppio clic sul file dei risultati dell'esecuzione.
Questo analizza automaticamente l'uscita della luciferasi di ciascun pozzetto al momento dell'incorporazione nucleotidica e quantifica l'allele mitocondriale di interesse. Cerca i punteggi dei colori mostrati dal software in base alla qualità delle letture. Per salvare i risultati, selezionare Report nella finestra superiore, seguito da Report completo per generare un file PDF contenente i pirogrammi e i risultati di ciascun pozzetto della corsa.
In alternativa, scaricare i risultati in altri formati nella scheda Report. Elettroforesi su gel di agarosio di un'amplificazione PCR utilizzando i primer di amplificazione di entrambi i set selezionati per la mutazione m. 3243A>G come mostrato in questa figura.
Qui, Het indica il campione quasi omoplasmatico m. 3243A>G da analizzare. In questa figura è riportato un confronto delle prestazioni di entrambi i set di primer utilizzando standard molari per la calibrazione.
I valori misurati sono indicati dalle linee tratteggiate verticali. Viene visualizzata una funzione lineare X = Y per illustrare quanto ciascuno dei due saggi testati sia vicino a una misurazione ideale. I nomi delle linee cellulari sull'asse X sono i nomi dei vari cloni di cibridi che sono stati genotipizzati usando questo test.
I risultati della genotipizzazione su quattro cloni di cibridi di eteroplasmia m. 3243A>G sconosciuta utilizzando entrambi i saggi sono mostrati qui. Il sequenziamento è stato eseguito in triplice copia tecnica.
I risultati della genotipizzazione delle cellule trattate con nucleasi a dita di zinco mitocondriale, insieme ai controlli non trattati e trattati con simulazione, e i pirogrammi di due repliche di PCR di campioni di cellule MEF utilizzate per generare i risultati, nonché il controllo di genotipizzazione wild-type sono mostrati qui. Il pirosequenziamento può essere utilizzato come lettura per esperimenti di terapia genica per valutare varie tecnologie di terapia genica nel DNA mitocondriale.
