Ringraziamo Wu Pechino per l&#39;utilizzo dei suoi dati. Questo lavoro è stato supportato da un riconoscimento alla CARRIERA NSF a JEK

1. Preparazione di ~ 50 nm Diametro piccole vescicole unilamellari (SUV) per Folding delle proteine ​​di membrana <ol><li> Una soluzione di 1,2-dimyristoyl-sn-glicero-3-phosphocholine (DMPC) lipidi in cloroformio viene acquistato e aliquotted in fiale di vetro pulita in quantità di 20 mg per fiala per la conservazione. Uno strato di gas azoto viene aggiunto a ogni fiala per prevenire l&#39;ossidazione dei lipidi, e le fiale sono chiusi con tappi e parafilm. I flaconcini sono conservati in un congelatore di -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Un singolo flaconcino che contiene una aliquota di 20 mg di lipidi in cloroformio viene utilizzato per ogni esperimento. Il contenuto della fiala vengono essiccati utilizzando un flusso di azoto per 1 ora fino a quando non rimane solvente. </li><li> Lipidi secchi sono risospesi in 1 ml di tampone fosfato di potassio 20 mM (pH = 7,3) con un sonicatore bagnomaria per circa 30 secondi. Questa soluzione di lipidi sospesi apparirà nuvoloso, e viene trasferito in una plastica da 15 ml tubo con un fondo conico. Un altro 1 aliquota mL di tampone fosfato viene aggiunta al flacone di vetro vuote che in origine conteneva dei lipidi, e sonicazione si ripete, la soluzione viene quindi aggiunto allo stesso tubo da 15 ml. Questo processo viene ripetuto per un totale di 4 volte fino a quando il volume finale nel tubo è di 4 ml, con una conseguente concentrazione dei lipidi di 5 mg / ml di questa soluzione vescicola stock. </li><li> I 4 ml di soluzione delle vescicole lipidiche è collocato in un ambiente caldo (~ 30 ° C) bagno d&#39;acqua, e sonicato utilizzando un microtip ultrasonicatore per 1 ora a duty cycle del 50%. Lo scopo del bagnomaria è duplice. In primo luogo, impedisce la soluzione dei lipidi di diventare troppo caldo a causa del processo di sonicazione. In secondo luogo, il bagno caldo assicura che la temperatura della soluzione acquosa lipidica rimane al di sopra della temperatura di transizione di fase doppio strato durante la sonicazione, per DMPC, questa temperatura di transizione è ~ 23 ° C. </li><li> La soluzione sonicato è passato attraverso una siringa da 0,22 micron filtro per rimuovere i detriti dalla punta sonicatore, e questa soluzione filtrata viene equilibrata durante la notte a 37 ° C. </li></ol> 2. Preparazione del campione per la curva iniziale fluorescenza Unfolding <ol><li> Una soluzione madre di 10 M urea in tampone fosfato 20 mM (pH 7,3) è fatto. E &#39;essenziale che l&#39;acqua da aggiungere al solido (e non viceversa) perché la grande quantità di urea occupa un volume significativo nella soluzione. Questa soluzione di urea può essere fatta con l&#39;aggiunta di soluti ad un ambiente pulito, una bottiglia vuota e l&#39;aggiunta di acqua fino al volume di destinazione finale. Questa soluzione potrebbe richiedere il riscaldamento a bagnomaria o su una piastra calda con mescolando per sciogliere il soluto. L&#39;urea è igroscopico e quindi, la concentrazione effettiva della soluzione di riserva urea devono essere determinate con indice di rifrazione 1. </li><li> Una soluzione tampone stock di fosfato 20 mM (pH 7,3) è fatto. </li><li> Una soluzione di riserva della dispiegato proteina è preparato. Questa soluzione di proteine ​​di riserva dovrebbe avere una concentrazione di circa 200 proteine ​​mM in 8 M urea, 20 mM tampone fosfato. </li><li> Campioni per studi di fluorescenza sono preparati nel modo seguente. Volumi adeguati di proteine ​​stock (paragrafo 2.3), lipidi soluzione madre (5 mg / ml lipidi, sezione 1), fotografia di soluzione di urea 10 M (sezione 2.1), e tampone fosfato stock (sezione 2.2) sono combinati per rendere campioni contenenti ~ 4 proteina mM, 1 mg / mL lipidi, e 0-8 M urea in incrementi di 1 M. Il volume totale di ogni campione è di 200 microlitri. Un foglio di esempio (Tabella 1) è compreso che i volumi di liste di desiderata con uno stock 200 mM soluzione proteica. </li><li> Campioni in bianco sono realizzate come descritto nel paragrafo 2.4, tuttavia, la proteina non viene aggiunto. Al posto di proteine, 4 ml di una soluzione di urea 8 M possono essere aggiunti in modo da concentrazioni di altri componenti sono identici a quelli nella sezione 2.4. Questi spazi vengono utilizzati per sottrarre dispersione del segnale e background che appare negli spettri di fluorescenza di proteine. </li><li> I campioni di sezioni 2.4 e 2.5 sono autorizzati a incubare a 37 ° C per almeno 2 ore prima misura di spettri di fluorescenza per assicurare pieghevole completo e equilibrio. </li></ol> 3. Misura di spettri di fluorescenza Triptofano fluorescenza di ciascun campione e vuota è misurata con un fluorimetro steady-state. Spettri di fluorescenza devono essere registrati con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 290 nm per evitare di eccitazione dei residui di tirosina e digitalizzati 305-500 nm. Ingresso tipici e banda passante uscita è di 3 nm. L&#39;incremento lunghezza d&#39;onda e tempo di integrazione può essere ottimizzato per segnale-rumore. Valori tipici per incrementare lunghezza d&#39;onda e tempo di integrazione sono 1 nm / passo e 0,5 sec / step, rispettivamente. Proteine ​​di membrana in genere piega in lipidi di sintesi solo quando la temperatura è al di sopra della temperatura di transizione di fase doppio strato. Pertanto, in questo caso di DMPC, la temperatura del campione è mantenuta costante a 30 ° C. Una cuvetta silice fusa microvolumi con 160 microlitri è utilizzato in questi experiments. 4. Generazione di curve iniziali Unfolding e stima dell&#39;energia libera di Gibbs di proteine ​​di membrana Unfolding <ol><li> Spettri di fluorescenza nella forma di un insieme di dati xy vengono caricati in software come Igor Pro, Matlab, Origin o Excel. </li><li> Segnale dal fondo vescicola urea e lipidico deve essere sottratto con la seguente procedura: Spettro A = spettro di fluorescenza prime di proteine ​​in presenza di vescicole lipidiche e di concentrazione specifici di urea. Spettro B = spettro prime fluorescenza corrispondente campione in bianco che contiene vescicole lipidiche e la concentrazione di urea identica a quella dello spettro A, nessuna proteina nei campioni è vuoto. Spettro corretta = Spectrum A - C * spettro B. C è uno scalare tipicamente pari a 1,0. In alcuni casi, C è inferiore o superiore a 1,0 a causa di problemi di dispersione che causano sovra o sotto-sottrazione vicino alla regione 305-320 nm ~. </li><li> La lunghezza d&#39;onda del massimo di fluorescenza, λ max, è tabulati da spettri corretti per ciascuna concentrazione di urea. Un valore tipico per la piena spiegato proteina di membrana è di 350 nm, mentre quello della proteina ripiegata è ~ 330 nm. Lunghezze d&#39;onda tabulati vengono convertiti in frazione spiegato convertendo la gamma di valori di λ max (~ 330 a ~ 350 nm) per la gamma 0,0-1,0 per correlare il valore λ max a frazione della popolazione spiegato. Per esempio, un valore λ massima di 330 nm corrisponde a 0,0, 350 nm corrisponde a 1,0 e 340 nm corrisponde a 0,5 in termini di frazione spiegato. Questa frazione di proteine ​​è spiegato poi complottato contro la concentrazione di urea. Come detto sopra, la concentrazione di urea deve essere determinato sperimentalmente misurando indice di rifrazione. </li><li> Partiamo dal presupposto che la proteina può esistere in uno dei due stati: ripiegati o aperti. La trama della frazione spiegato, f, in funzione della concentrazione di urea, C, può essere in forma per l&#39;equazione: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> Il coefficiente m corrisponde al tasso di variazione della energia libera rispetto alla concentrazione di denaturante e C m corrisponde alla concentrazione di urea punto medio in cui la popolazione piegata uguale alla popolazione spiegato. Questi valori sono le variabili montaggio ottenuto da minimi quadrati da un software di analisi dati. R (0.001987 kcal / mol • K) è la legge costante dei gas, e T è la temperatura (303 K). </li><li> I coefficienti ottenuti dal fit sono utilizzati per determinare l&#39;energia libera di Gibbs (kcal / mol) di dispiegarsi in assenza di urea: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Equazione 3"/> . </li></ol> 5. Ottimizzato Unfolding Curva Per una misurazione più precisa della energia libera di Gibbs di Unfolding. <ol><li> La curva di svolgimento sopra descritta rivela l&#39;intervallo di concentrazioni di urea che provoca il più grande cambiamento nella massima λ. Questa gamma è in genere piccolo, e la maggior parte di svolgimento avviene all&#39;interno di questa gamma di piccole dimensioni. Al fine di determinare con precisione l&#39;energia libera di dispiegarsi, campioni supplementari vengono analizzati in questa regione per ottenere una trama che contiene molti punti dati necessari per ottimizzare minimi quadrati. Per esempio, se la proteina si svolge tra 2 e 4 M urea, i campioni possono essere fatte che contengono 2-4 M urea in incrementi di 0,2 M per rivelare più precisamente la forma di questa importante regione della curva di svolgimento. Non è necessario misurare spettri vuoto ad ogni concentrazione di urea, ma è sufficiente per misurare uno spettro vuoto ogni passo ~ 0,5 M. </li><li> L&#39;energia libera di dispiegarsi ottenuti da questo complotto possono differire leggermente da quello ottenuto nella curva originale svolgimento, ma riflette un valore più preciso. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: <table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> finale [Urea], M </td><td> magazzino proteine ​​(mL) </td><td> magazzino dei lipidi (mL) </td><td> stock 10 M urea (mL) </td><td> magazzino tampone (mL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0,16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Volume delle soluzioni madre tenuto a fluorescenza di campioni <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Triptofano spettri di fluorescenza di ~ 5 proteina di membrana rappresentante mM che contiene un singolo residuo triptofano. (A) spettri Raw fluorescenza di proteine ​​(spettro da 4,2 A), (B) spettri Raw fluorescenza bianca (spettro di B da 4,2), (C) rettificato spettro da 4,2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Corretto triptofano spettri di fluorescenza di proteine ​​di membrana dalla Figura 1 per le concentrazioni di urea numerosi. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Unfolding curva ottenuta dai dati in figura 2, con forma di equazione in 4.4. L&#39;energia libera di Gibbs è calcolato in base al paragrafo 4.5.

<ol>
	<li>Shirley, B. A., Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Folding and Stability. , 177-190 (1995).</li><li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves.">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li><li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein.">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li><li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro.">&#946;-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li><li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+scene+investigation:+membrane+proteins.">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li><li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces.">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li><li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Tryptophan+Microenvironment,+Soluble+Domain,+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding:+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA.">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;attuale protocollo descrive la generazione di curve di svolgimento associata alla membrana proteine ​​e peptidi che contengono residui di triptofano. Qui, si presume che la fluorescenza triptofano riflette se la proteina viene piegato e inserito in vescicole lipidiche sintetico, o si è svolto in soluzione. Ipotesi aggiuntive, come due Stati piegatura e dipendenza lineare di energia libera con concentrazione denaturante, sono contenute nella relazione corrente;. Modifica di tali presupposti risultato in divers...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850345C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biochemicals</td>
<td>04821527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P288</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P285</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

thermodynamics of membrane protein folding measured by fluorescence spectroscopy

Ripiegamento delle proteine ​​della membrana è un tema emergente di significati fondamentali e relativi alla salute. L&#39;abbondanza di proteine ​​di membrana delle cellule in base alla necessità per lo studio completo della piegatura di questa famiglia ubiquitaria di proteine. Inoltre, i progressi nella capacità di caratterizzare malattie associate con le proteine ​​mal ripiegate hanno motivato notevoli sforzi teorici e sperimentali nel campo del ripiegamento delle proteine. Rapidi progressi in questo importante settore è purtroppo ostacolata dalle sfide inerenti associate proteine ​​di membrana e la complessità del meccanismo di ripiegamento. Qui, delineare una procedura sperimentale per la misura di proprietà termodinamiche di energia libera di Gibbs di dispiegarsi in assenza di denaturante, Δ G ° H 2 O, per una proteina di membrana integrale rappresentante da E. coli. Questo protocollo si concentra sull&#39;applicazione della spettroscopia di fluorescenza per determinare l&#39;equilibrio le popolazioni degli stati piegato e spiegato in funzione della concentrazione di denaturante. Considerazioni sperimentali per la preparazione di vescicole lipidiche sintetici, nonché alle fasi principali della procedura di analisi dei dati sono evidenziati. Questa tecnica è versatile e può essere perseguito con diversi tipi di denaturante, tra cui la temperatura e pH, così come in vari ambienti ripiegamento dei lipidi e delle micelle. Il protocollo attuale è quella che può essere generalizzato a qualsiasi membrana o proteina solubile che soddisfa l&#39;insieme dei criteri discussi di seguito.

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Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Questo articolo dettagli video la procedura sperimentale per ottenere l&#39;energia libera di Gibbs di ripiegamento delle proteine ​​della membrana da triptofano fluorescenza.

Termodinamica di Folding delle proteine ​​di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

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18.2K Views.  University of California San Diego - UCSD. Questo articolo dettagli video la procedura sperimentale per ottenere l'energia libera di Gibbs di ripiegamento delle proteine ​​della membrana da triptofano fluorescenza.

Video: Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

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Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Miscelatori per lo studio microfluidici Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per Brillouin Spettroscopia

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingegneria fluorescenza 'D'oro' per incorporazione di pressione selettiva di aminoacidi Non canonico e l'analisi della proteina di fluorescenza e di spettrometria di massa

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Termodinamica di Folding delle proteine ​​di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza

Termodinamica di Folding delle proteine di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza