The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.

1. Preparazione del campione <ol><li> Pulizia Coverslip NOTA: Lavorare sotto una cappa aspirante. <ol><li> Utilizzare pinzette pulite per posizionare vetrini (diametro 24 mm) in un vetrino porta che separa le singole lamelle. </li><li> Mettere il supporto con vetrini in un bicchiere e aggiungere cloroformio fino a quando i coprioggetti sono coperti. Coprire il becher con foglio di alluminio per ridurre l&#39;evaporazione e ultrasuoni in un bagno sonicatore per 1 ora a RT. Prendete il titolare vetrino fuori del bicchiere e lasciare i coprioggetti asciutto. </li><li> Ripetere passo 1.1.2 con la soluzione di NaOH 5M invece di cloroformio. </li><li> Estrarre il porta vetrino in una nuova becher e lavare tre volte con acqua distillata. Mettere coprioggetti puliti in una piastra di coltura cellulare di vetro riempito con 100% di etanolo. </li></ol></li><li> Preparazione dei campioni di taratura <ol><li> Sciogliere colorante fluorescente in solvente appropriato. </li><li> Preparare una diluizione seriale 1:10 del colorante fluorescente che vannoda 1:00 a 1 nM filtro (0,22 micron) di acqua sterilizzata. </li><li> Prendere coprioggetti puliti memorizzati in 100% etanolo e lavare con acqua sterilizzata per filtrazione. Spot 20 ml di ogni diluizione colorante fluorescente su un vetrino pulito separato. Lasciate che i coprioggetti asciugare sotto una cappa sterile. Proteggere i coprioggetti dalla luce e dalla polvere fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare questi esempi per stimare l&#39;intensità di molecole fluorescenti singoli (vedi punto 3). </li></ol></li><li> Transfezione <ol><li> Cellule CHO cultura in miscela 1:1 medio / nutriente Dulbecco Modified Eagle F-12 (DMEM/F12) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina e 100 pg / ml di streptomicina a 37 ° C, in . 5% di CO 2 NOTA: Usare mezzi di comunicazione liberi fenolo-rosso tutto l&#39;esperimento per ridurre al minimo autofluorescenza. </li><li> Prendere coprioggetti puliti dalla soluzione di etanolo al 100%, lavarli con sterile tampone fosfato salino (PBS), e mettere un vetrino in ciascun pozzetto di un 6 celle ben cultura plmangiato. </li><li> Trypsinize, contare e cellule CHO seme con una densità di 3 x 10 5 cellule / pozzetto nella piastra di coltura cellulare 6-pozzetti contenenti le lamelle. Lasciare che le cellule crescono in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per 24 ore al fine di raggiungere ca. 80% di confluenza, che è la densità cellulare ottimale per la trasfezione. </li><li> Per ogni bene, diluire 2 mg di DNA plasmide desiderato (ad es., SNAP-tag β del recettore 2-adrenergici) e 6 ml Lipofectamine 2000 a due tubi separati contenenti 500 microlitri di media OptiMEM. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Unire le soluzioni dal punto 1.3.4 in una provetta e miscelare per ottenere una miscela di trasfezione. Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione (1.3.5), prendere le cellule CHO e lavare due volte con pre-riscaldato (37 ° C) PBS. Sostituire PBS con 1 ml / pozzetto di fenolo mezzo DMEM/F12 aneritro supplementato con 10% FBS ma senza antibiotici. </li><li> Aggiungere l&#39;intero transfectmiscela di ioni (1 ml) dal punto 1.3.5 goccia a goccia in ogni pozzetto, e delicatamente Rock il piatto avanti e indietro per garantire la completa miscelazione. </li><li> Incubare per 2 a 4 ore a 37 ° C, in 5% CO 2 e procedere subito dopo il passaggio successivo. NOTA: Queste condizioni di trasfezione sono stati ottimizzati per raggiungere densità dei recettori &lt;0,45 particelle / 2 micron, che sono adatti per singola l&#39;imaging molecola. Le regolazioni possono essere necessari quando si utilizzano diverse celle, costrutti o reagenti. </li></ol></li><li> Etichettatura Protein <ol><li> Diluire 1 ml di soluzione madre fluoroforo-BG in 1 ml di mezzo DMEM/F12 supplementato con 10% FBS per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Prendere le cellule trasfettate dall&#39;incubatore e lavare due volte con preriscaldata (37 ° C) PBS. Sostituire PBS con 1 ml di soluzione 1 mM fluoroforo-BG e incubare per 20 min a 37 ° C 5% CO 2 in un incubatore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule trevolte con DMEM/F12 mezzo supplementato con 10% FBS, ogni volta seguiti da 5 minuti di incubazione a 37 ° C. Prendete un vetrino (con cellule marcate) con le pinzette e mettetelo in una camera di imaging. </li><li> Lavare due volte con 300 microlitri di buffer di imaging. Aggiungere 300 ml di buffer di immagini fresche e procedere immediatamente alla diagnostica per immagini (parte 2). </li></ol></li></ol> 2. Acquisizione Immagine NOTA: Usare un totale di fluorescenza di riflessione interna (TIRF) microscopio, dotato di un obiettivo ad immersione in olio ad alta apertura numerica (ad esempio, apertura numerica 100X magnification/1.46.), I laser adatti (ad esempio, 405 nm, 488 nm, 561 nm e 645 laser a diodi nm), un dispositivo ad accoppiamento di carica dell&#39;elettrone moltiplicando (EMCCD) macchina fotografica, un incubatore e un controllo della temperatura per visualizzare molecole fluorescenti singoli. <ol><li> Impostare i parametri desiderati microscopio, cioè., Linea laser, l&#39;angolo TIRF (questo parametro controlla la penetrazionezione profondità del campo evanescente), tempo di esposizione, il frame rate e il numero di immagini per film 10. Mantenere il controllo del riscaldamento / incubatore e la temperatura sempre per evitare derive di temperatura e umidità di condensa. </li><li> Mettere una goccia di olio di immersione sull&#39;obiettivo 100X del microscopio. Posizionare la camera di imaging con le cellule marcate sul supporto esemplare di microscopio, e portare le cellule a fuoco in illuminazione campo chiaro. </li><li> Passare alla illuminazione TIRF. Mantenere potenza del laser più basso possibile per consentire una ricerca per la cella desiderata ma allo stesso tempo minimizzando fotoscolorimento. </li><li> Selezionare la cella desiderata e fine regolare la messa a fuoco. Impostare la potenza del laser ad un livello che permette la visualizzazione di singoli fluorofori. Acquisire sequenza di immagini e salvare file di sequenza di immagini crudo. Tiff. </li></ol> 3. Calibration (Fluorofori singoli su vetro e monomeriche / dimerica controlli Receptor) <ol><li> Assemblare ogni sampl taraturae preparato come descritto in 1.2 nella camera di imaging. Collocare ogni campione sul microscopio e scegliere il campione contenente macchie diffrazione limitata ben separati che candeggina in un unico passaggio. NOTA: Questi punti rappresentano singole molecole del colorante fluorescente. </li><li> Acquisire TIRF sequenze di immagini come descritto al punto 2. Importante: gli stessi parametri di imaging devono essere utilizzati per tutti gli esperimenti, compresi quelli per la calibrazione. </li><li> Eseguire la rilevazione e l&#39;analisi di monitoraggio come indicato in 4,1-4,2. Estrarre l&#39;intensità di ciascuna particella come descritto al punto 4.2.6. Da questi dati, calcolare la media (μ) e la deviazione standard (σ) dell&#39;intensità dei singoli fluorofori. </li><li> Facoltativo: eseguire la stessa analisi su cellule trasfettate con un recettore sulla superficie cellulare monomerica (. Esempio, CD86), N-terminale con etichetta una o due copie di SNAP 10 ed etichettato con il derivato fluoroforo-BG. Follow la procedura sopra descritta per il singolo fluoroforo su vetro. Stimare l&#39;efficienza di etichettatura come descritto in Calebiro, D. et al. 10 </li></ol> 4. Image Analysis <ol><li> Preparazione sequenza di immagini <ol><li> Utilizzare un software di elaborazione delle immagini (ad es., ImageJ) per ritagliare le immagini. </li><li> Salvate singoli fotogrammi come separato. Immagini TIFF in una nuova cartella, indicando su ogni immagine il numero di telaio. </li><li> Misurare la superficie cellulare disegnando una regione di interesse (ROI) lungo il contorno di una cella mediante lo strumento di misura in ImageJ o uno strumento simile in un altro software. Utilizzare questo valore per calcolare la densità delle particelle dividendo il numero totale di particelle all&#39;inizio del film dalla superficie cellulare. </li></ol></li><li> Rivelazione di particelle e di monitoraggio NOTA: Utilizzare un software non commerciali come u-track 13, lavorando in Matlabambiente, per rilevare automaticamente e tenere traccia di particelle recettore singoli. NOTA: L&#39;algoritmo u-track si basa su un approccio di monitoraggio a più ipotesi. Questo approccio unisce le particelle tra i fotogrammi con la costruzione di matrici di costo, in cui vengono assegnati i singoli probabilità che una data particella in un fotogramma corrisponde a una data particella nel frame successivo, appare, scompare o si fonde / divide con / da altre particelle. La soluzione che minimizza globalmente i costi, cioè., Quello con la più alta probabilità, è finalmente selezionato. Questo permette anche di inseguimento una particella scomparire temporaneamente, un fenomeno tipico causato da fluoroforo lampeggiante. L&#39;ultima versione di u-track (2.1.0) dispone di interfacce utente grafiche che facilitano l&#39;esecuzione di queste analisi. <ol><li> Dal prompt dei comandi Matlab, digitare &quot;movieSelectorGUI&quot; per aprire l&#39;interfaccia di selezione di film. Seguire le istruzioni per creare unnuovo database di film a partire dalle immagini separate salvate in precedenza (vedi 4.1.2). </li><li> Fornire la dimensione dei pixel in nm, intervallo di tempo in secondi, apertura numerica, profondità di bit fotocamera e lunghezza d&#39;onda di emissione del fluoroforo, richiesta per il rilevamento di particelle e di inseguimento. Salvare il database di film. </li><li> Dall&#39;interfaccia selezione di film, eseguire l&#39;analisi, la scelta di &quot;particelle singole&quot; come tipo di oggetti. Verrà visualizzata una nuova finestra in cui i parametri utilizzati per il rilevamento di particelle e di monitoraggio possono essere definiti. Inizia con i parametri di default. Più tardi, regolare questi parametri se la qualità della rilevazione e / o di monitoraggio non è soddisfacente (ad esempio, alcune particelle non vengono rilevati o tracce sono frammentati) Facoltativo:. Sotto le impostazioni di rilevamento, selezionare &quot;i risultati di monitoraggio Esportare in formato matrice&quot; per memorizzare le coordinate e le ampiezze delle particelle in una singola matrice (campo denominato &quot;trackedFeaturedInfo&quot;). Per una descrizione dettagliata di questi parametri, fare riferimento alla documentazione u-track. </li><li> Eseguire l&#39;algoritmo di rilevamento. Questo algoritmo determinare automaticamente la posizione e l&#39;intensità sopra sfondo di ogni spot diffrazione limitata (ie., Complessi singoli recettori / recettore), calibrando una funzione gaussiana bidimensionale con deviazione standard pari alla funzione punto diffusione del microscopio intorno massimi di intensità locale . Quindi, eseguire l&#39;algoritmo di tracking. Memorizzare i risultati delle analisi in un file mat.. </li><li> Utilizzare la routine &quot;movieViewer&quot;, contenuto nel pacchetto u-track, o quelli personalizzati simili a visualizzare le tracce e controllare la qualità della rilevazione e di monitoraggio. </li><li> Aprire il file mat. Vedere la posizione e l&#39;ampiezza (cioè., Intensità) delle particelle rilevate ad ogni frame. Dati generati nel passaggio 4.2.4 sono contenuti nel campo tracksCoordAmpCG della ar tracksFinalray e / o in trackedFeaturedInfo. Dal numero totale di particelle rilevato calcolare la densità delle particelle dividendo questo valore per l&#39;area superficiale delle cellule misurata a 4.1.3. </li><li> Facoltativo: utilizzare le coordinate della particella nel tempo (vedere 4.2.6) analizzare il moto delle particelle recettore. Calcolare gli spostamenti medi quadrati (MSD) e coefficienti di diffusione (D) utilizzando Matlab o software simili. Per ogni particella e ogni intervallo di tempo (Δ t) considerato, calcolare lo spostamento quadratico medio (MSD) utilizzando la seguente formula: <img align="middle" alt="Equazione 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" /> dove Δ t è l&#39;intervallo di tempo in fotogrammi, N è il numero di passi analizzati, x ed y sono x della particella e coordinate Y al telaio indicata dall&#39;indice. Utilizzare il MSD su appezzamenti di tempo per valutare il tipo di moto di una data particella: relazioni lineariindicare diffusione gratuita (ie., moto browniano), una curvatura positiva (cioè., la curva appare come una parabola) suggerisce movimento diretto, una curvatura negativa è indicativo del movimento confinato 14. Nel caso di particelle diffondenti banche, calcolare il coefficiente di diffusione (D) di ciascuna particella inserendo i dati MSD ottenuti con la seguente equazione: <img align="middle" alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Calcolo della dimensione delle particelle con il metodo di montaggio gaussiana NOTA: Una volta che la distribuzione di intensità di campioni di taratura (singoli fluorofori su vetro e / o recettori monomerici fluorescente) è noto, eseguire una misura gaussiana mista sulla distribuzione delle intensità delle particelle all&#39;inizio di una sequenza di immagini per determinare la dimensione di complessi recettoriali (cioè., il numero di recettori per particella) 10. Eseguire queste analisi utilizzando Matlab o ssoftware analoghe sui. <ol><li> Calcolare l&#39;intensità di ciascuna particella facendo la media dell&#39;intensità della particella dal primo fotogramma per fotogramma prima della prima variazione di intensità verificato (nella maggior parte dei casi decremento per photobleaching). </li><li> Eseguire un raccordo gaussiana misto secondo la seguente equazione: <img align="middle" alt="Equazione 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" /> dove φ (i) è la frequenza di particelle aventi intensità I, n è il numero dei componenti, α n è un parametro che contribuisce alla altezza del componente n, μ e σ sono la media e la deviazione standard della intensità di riferimento singoli fluorofori . (calcolato come descritto al punto 3) NOTE: Determinare tegli massimo numero di componenti (n max) per ogni sequenza immagine aumentando progressivamente n max finché l&#39;aggiunta di un componente non più produrre un migliore raccordo statisticamente, come giudicato da un F-test. </li><li> Optional: (. Esempio, gli ultimi 60 fotogrammi di una sequenza di 400 telaio) Eseguire un fit gaussiano mista sulla distribuzione dell&#39;intensità ottenuto sugli ultimi fotogrammi del filmato. Sostituire μ e σ con i valori ottenuti dopo il montaggio, che forniscono stime raffinate per tali parametri e ripetere il punto 4.3.2. </li><li> Calcolare l&#39;area sotto la curva (AUC) di ciascun componente del fit gaussiano mista. Calcolare l&#39;abbondanza relativa di particelle recettore di differenti dimensioni (cioè, monomero, dimero, trimero, ecc) dividendo il valore AUC di ogni componente l&#39;AUC dell&#39;intera distribuzione. </li><li>Facoltativo: utilizzare dati provenienti da diverse cellule e le corrispondenti densità di particelle (calcolati come descritto in 4.2.6) per generare trame dove la distribuzione di particelle con dimensioni diverse è correlata con la densità delle particelle 10. </li></ol></li><li> Calcolo della dimensione delle particelle con metodo sagomata passo NOTA: Utilizzare un analisi passo-montaggio come metodo alternativo per determinare la dimensione dei complessi recettoriali 10. La base per questa analisi è che la distruzione indotta dalla luce (photobleaching) di una singola risultati fluoroforo in sua scomparsa istantanea - quindi particelle contenenti n fluorofori dovrebbero progressivamente candeggina produrre un profilo di intensità con n passi. <ol><li> Estrarre i profili di intensità di ogni particella dal file. Mat generato da u-track o simile software di rilevamento / tracking (vedi 4.2.6). </li><li> Utilizzare un algoritmo passo-montaggio, come quello presentatoin rif. 10, per contare il numero di passi sbianca per ogni particella. </li><li> Facoltativo: utilizzare i risultati per generare distribuzioni mostrano l&#39;abbondanza relativa di particelle recettori di diverse dimensioni e correlare con densità di particelle come precedentemente descritto per i risultati del raccordo gaussiana mista (vedi 4.3). </li></ol></li></ol>

<ol>
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J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Il protocollo descritto permette l&#39;analisi della disposizione spaziale, mobilità e dimensioni dei complessi recettore della superficie cellulare a livello di singola molecola. Rispetto all&#39;uso di proteine ​​fluorescenti, etichettatura con piccole fluorofori organici, che sono più luminoso e fotostabile, ha il vantaggio di permettere la visualizzazione estesa del recettore particelle singole. Poiché i livelli di espressione estremamente bassi sono raggiunti (&lt;0,45 particelle recettore / micron 2),<...

Recettori situati sulla superficie cellulare percepire l&#39;ambiente extracellulare e rispondono a una varietà di stimoli, come odoranti, ioni, piccole e grandi neurotrasmettitori ormoni proteici. La fluidità delle membrane cellulari consente movimenti di recettori e altre proteine ​​di membrana. Ciò è essenziale per la formazione di complessi proteici e il verificarsi di interazioni proteina-proteina transitori, come quelli utilizzati da recettori per assemblare in unità funzionali e trasdurre segnali nell&#39;interno delle cellule. Ad esempio, G-proteine-recettori accoppiati (GPCR), che costituiscono la più grande famiglia di recettori di superficie cellulare 1, sono stati proposti per formare di-/oligomers, che sembra essere coinvolto nella regolazione messa a punto di trasduzione del segnale e potrebbe avere importanti conseguenze fisiologiche e farmacologiche 2-5. Microscopia singola molecola ha il grande potenziale di visualizzare direttamente con l&#39;alta spatiotemprisoluzione orale il comportamento dinamico dei singoli recettori situati sulla superficie delle cellule viventi, compresi loro associazione per formare dimeri e complessi molecolari ordine superiore 6-10. Questo offre diversi vantaggi rispetto ai metodi biochimici e microscopia standard, che di solito riportano il comportamento medio di migliaia o milioni di molecole. Etichettatura proteina con un fluoroforo sufficientemente luminoso e fotostabili è essenziale per microscopia singola molecola. Questo protocollo sfrutta il tag SNAP recentemente introdotto 11 per collegare in modo covalente fluorofori organici piccole e luminose ai recettori della superficie cellulare. SNAP è un kD tag 20 proteine ​​derivate da l&#39;enzima O alchiltransferasi umano 6-alkylguanine-DNA riparazione del DNA, che può essere irreversibile etichettato con fluoroforo-coniugato benzylguanine (fluoroforo-BG) derivati. CLIP, un tag ulteriormente ingegnerizzato derivato da SNAP, può essere invece etichettato con fluoroforo-cDerivati ​​benzylcytosine onjugated 12. Il protocollo riportato in questo manoscritto spiega come transfettare e l&#39;etichetta SNAP-tagged 11 recettori con piccole fluorofori organici e utilizzare riflessione interna totale in fluorescenza (TIRF) microscopia a visualizzare singoli recettori o complessi recettore sulla superficie delle cellule viventi 10. I risultati del protocollo riportati in&gt; 90% di efficienza etichettatura di un extracellulare SNAP-tagged proteine ​​della superficie cellulare 10. Ulteriori informazioni su come utilizzare dati singola molecola di analizzare la dimensione e la mobilità dei complessi recettoriali, nonché per catturare le interazioni recettore-recettore transitori, è fornito. Un flusso di lavoro schematicamente l&#39;intero protocollo è data in Figura 1. Come esempio, la trasfezione di ovaio di criceto cinese (CHO) con-G recettori accoppiati alla proteina SNAP-tag (GPCR) seguita da marcatura con un derivato fluoroforo-BG come nonché la sua applicazione alla quantify e il monitor del recettore di-/oligomerization sono descritti. Questo protocollo può essere estesa ad altre proteine ​​della superficie cellulare e tag fluorescenti (ad es., CLIP), così come ad altri metodi di trasfezione e di etichettatura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:259px;">Chloroform</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1585</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">NaOH</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: strong base and highly corrosive reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">32205</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:115px;">111640</td>
			<td style="width:261px;">24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.2 mm sterile filter</td>
			<td style="width:248px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:115px;">83.1826.001</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CHO cells</td>
			<td style="width:248px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:115px;">ATCC CCL-61</td>
			<td style="width:261px;">Chinese hamster ovary cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well cell culture plare</td>
			<td style="width:248px;">Nunc</td>
			<td style="width:115px;">140675</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:248px;">GIBCO, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11039-021</td>
			<td style="width:261px;">Phenol-red free medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Biochrom</td>
			<td style="width:115px;">S 0115</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Penicillin - streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P06-07 100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P10-23100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11668-019</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">31985-047</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorophore-conjugated benzylguanine&#160;</td>
			<td style="width:248px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:115px;">S9136S</td>
			<td style="width:261px;">SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMSO</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1584</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:259px;">Imaging buffer:</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; NaCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1371</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; KCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3582</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; CaCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A2303</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; MgCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3618</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; HEPES</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3724</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:248px;">Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">A-7816</td>
			<td style="width:261px;">Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF-M</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Model: DMI6000B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF objective</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">11 506 249&#160;</td>
			<td style="width:261px;">HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">EM-CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Photometrics Cascade 512B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:248px;">Pecon</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Tempcontrol 37-2 digital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:248px;">NIH, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">u-track software</td>
			<td style="width:248px;">Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Matlab software</td>
			<td style="width:248px;">The MathWorks, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution spatiotemporal analysis of receptor dynamics by single-molecule fluorescence microscopy

Microscopia a singola molecola sta emergendo come un potente approccio per analizzare il comportamento delle molecole di segnalazione, in particolare per quanto riguarda quelli di aspetto (ad es., Cinetica, la coesistenza di diversi stati e popolazioni, interazioni transienti), che sono in genere nascosti nelle misure Ensemble, come quelli ottenuti con metodi biochimici o microscopia standard. Così, eventi dinamici, quali le interazioni recettore-recettore, possono essere seguite in tempo reale in una cellula vivente con alta risoluzione spazio-temporale. Questo protocollo descrive un metodo basato sulla marcatura con fluorofori organici piccoli e luminosi e riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia di visualizzare direttamente singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi. Questo approccio permette di localizzare con precisione i recettori, misurare la dimensione dei complessi recettoriali e catturare gli eventi dinamici come le interazioni recettore-recettore transitori. Il protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come perform un esperimento singola molecola, compresa la preparazione del campione, l&#39;acquisizione delle immagini e l&#39;analisi delle immagini. Come esempio, l&#39;applicazione di questo metodo per analizzare due proteine ​​G recettori, cioè., Β 2-adrenergici e γ-aminobutirrico tipo B acido (GABA B) recettore, viene segnalato. Il protocollo può essere adattato ad altre proteine ​​di membrana e modelli cellulari diversi, metodi di trasfezione e strategie di etichettatura.

Il protocollo descritto può essere applicato ad una varietà di differenti proteine ​​di membrana. Come esempio, risultati rappresentativi ottenuti con β 2-adrenergici e GABA B sono riportati 10. Poiché i segnali fluorescenti da singole molecole sono deboli, minimizzazione di fluorescenza di fondo è il primo passo fondamentale per ottenere buoni risultati. Quindi, è importante utilizzare coprioggetti ampiamente puliti (Figura 2A) così da minimizzare autofluores...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy at JoVE.com

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Views.  University of Würzburg, Germany. This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins. 

Video: High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Ricerca

Bioingegneria

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingegneria fluorescenza 'D'oro' per incorporazione di pressione selettiva di aminoacidi Non canonico e l'analisi della proteina di fluorescenza e di spettrometria di massa

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...