Questo lavoro è supportato da FIBR National Science Foundation (NSF EF-0623664) e IDBR (NSF DBI-0754570). Questo lavoro è stato parzialmente supportato da un finanziamento della National Science Foundation FIBR sovvenzione 0623664 gestito dal Centro per Biofotonica, un NSF Science and Technology Center, gestito dalla University of California, Davis, ai sensi del Contratto Cooperative PHY 0120999. La ricerca di Lisa Lapidus, Ph.D. è sostenuto in parte da un premio alla carriera a livello di interfaccia scientifico del Fondo Burroughs Welcome.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Rapid miscelazione è stato un obiettivo di sviluppo per il settore della ripiegamento delle proteine ​​per molti anni perché è da tempo riconosciuto che i processi molecolari di biomolecole si verificano su scale temporali che variano dai picosecondi ai secondi. Convenzionali stopped-flow miscelatori hanno tempi morti di 1-5 ms, che è sostanzialmente limitato dalla turbolenza. Turbolenti miscelatori a flusso continuo con i tempi di miscelazione 30-300 ms sono stati sviluppati nel corso degli ultimi 15 anni da un piccolo numero di gruppi, ma in genere richiedono portate elevate per raggiungere questi tempi di miscelazione e quindi utilizzare un sacco di campione 6-8. Questo protocollo descrive l&#39;uso di chip microfluidica miscelazione per ottenere una rapida diluizione nel regime di flusso laminare. Esistono molteplici vantaggi a lavorare in questo regime, ma una primaria è la possibilità di simulare l&#39;intero processo di miscelazione con alta precisione che permette di modificare la risposta di miscelazione. T-miscelatori sviluppati da altri gruppi con semplice geometries hanno dimostrato tempi di miscelazione di 100-200 ms che sono stati limitati principalmente dalle dimensioni dei canali 9-10. Con scalare le dimensioni dei canali a 10 um cavaliere ridotto il tempo di miscelazione di ~ 10 ms 11. Yao e Bakajin hanno mostrato che piccole variazioni nella geometria potrebbe portare a miglioramenti significativi nel tempo di miscelazione 4. Tuttavia, tale lavoro ha dimostrato che l&#39;accelerazione di miscelazione può anche portare a lente fasi pure. Il disegno usato in questo lavoro 12-13 è un compromesso tra i due migliori disegni in riferimento 4 per minimizzare il lento decadimento esponenziale in concentrazione di denaturante e anche la funzione di rendere più riproducibile in DRIE incisione. Ci sono state delle controversie nel campo di miscelazione ultrarapido per la definizione del tempo di miscelazione. E &#39;importante riconoscere la differenza tra &quot;tempo di miscelazione&quot; e &quot;tempi morti&quot;. Il tempo morto è definito in un miscelatore turbolento il tempo durante il quale un MISUREt non possono essere realizzati e possono in effetti essere significativamente più lungo del tempo effettivo di miscelazione. Esso è tipicamente determinata effettuando diverse misurazioni di pseudo primo ordine reazione biomolecolare (come quenching di fluorescenza di triptofano N bromosuccinate) a varie concentrazioni. I decadimenti esponenziali osservati sono montati a convergere ad un singolo valore assunto da t = 0 s e il tempo tra quel punto e il primo punto misurato è il tempo morto. Per miscelatori a flusso laminare, le misurazioni possono essere effettuate durante il processo di miscelazione quindi non c&#39;è il tempo morto, solo un tempo di miscelazione. Il tempo di miscelazione è semplicemente il tempo di combinare due soluzioni fino a raggiungere una sufficiente omogeneità. Abbiamo precedentemente definito il tempo di miscelazione di un 90/10 tempo, il tempo per la concentrazione di denaturante a diminuire dal 90% al 10% del valore non miscelato. Tuttavia, la forma della curva di miscelazione non è perfettamente simmetrica con la coda del decadimento avente un componente piccolo esponenziale. Inoltre, dispone di un ripiegamento delle proteinealtamente non lineare dipendenza concentrazione denaturante modo che spesso pieghevole può iniziare anche se il denaturante viene ridotta solo di due volte. Abbiamo quindi più recentemente definito il tempo di miscelazione come il tempo per ridurre la concentrazione di denaturante da 80%. Certamente altre definizioni possono essere utilizzati a seconda delle esigenze dell&#39;esperimento. L&#39;uso di questo mixer per studiare il ripiegamento delle proteine ​​costante rivelato risultati sorprendenti. Piegatura del citocromo c e apomyoglobin sono stati a lungo studiati per avere più fasi di piegatura ed i primi risultati con miscelatori a flusso continuo hanno mostrato il collasso che si verifichi sul ~ 100 ms tempi 10,14-15. Le nostre misurazioni con questo mixer ha mostrato l&#39;esistenza di almeno 2 punti su questa scala temporale, molto veloce, probabilmente non specifico, il collasso (come misurato dal cambiamento Trp fluorescenza spettrale) entro il tempo di miscelazione del miscelatore seguita da una fase più lenta (come misurata la tempra di emissione totale Trp) che è probabile la first formazione della struttura nativa 5. Abbiamo anche osservato un processo di 50 ms nel dominio B1 di L proteina, rovesciando l&#39;interpretazione convenzionale che questa proteina è un 2-stato cartella 13. Un vantaggio di questo miscelatore veloce è che può sondare il ripiegamento delle proteine ​​più veloci pieghevoli che sono solitamente soltanto stati misurabile nanosecondi da T-salto strumenti. T-salto richiede tipicamente osservazione di chiusura / apertura rilassamento vicino alla temperatura di fusione della proteina e quindi non segue il ripiegamento dell&#39;intera popolazione. Con questo mixer abbiamo esaminato il ripiegamento della γ-repressore (λ 6-86) sia con le emissioni totali Trp e lo spostamento spettrale e hanno trovato la prova che la proteina non ha alcun ostacolo alla piegatura in condizioni fortemente pieghevoli che non erano accessibili a T precedenti -saltare le misurazioni 12. Infine, abbiamo misurato la piegatura della testata villin HP-35, uno dei tha più veloci le cartelle ancora misurato e trovato che il tasso di piegatura misurata dopo la miscelazione è ~ 5 volte più lento rispetto misurata da T-jump nelle stesse condizioni 16. Questo suggerisce che la cinetica di piegatura dipende dalle condizioni di partenza, ribaltando un presupposto importante nel campo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> AZ P4110 Photoresist </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K Developer </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baker PRS 2000 photoresist stripper </td><td> Avantor Performance Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aquabond </td><td> Aquabond Technologies </td><td> Aquabond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 wafer copertura pm </td><td> SENSORE Prep Servizi </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Spessore: 0.5 mm ± 0.025 mm Tolleranze standard (salvo precisazioni) Finitura superficiale: SI: 4-8a; SII: 8-12A Appartamenti: Una primaria SEMI-STD; One Scribe Pulito e lucido, entrambe i lati </td></tr><tr><td> 170 wafer copertura micron </td><td> SENSORE Prep Servizi </td><td> 7980 2G Wafer </td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Spessore: 0,17 mm ± 0,025 millimetri Tolleranze standard (salvo precisazioni) Finitura di superficie: SI: 4-8a; SII: 8-12A Appartamenti: Una primaria SEMI-STD; One Scribe Pulito e lucido, entrambe i lati </td></tr><tr><td> Profondo incisore ioni reattivi per gli ossidi di </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Laser a ioni argon </td><td> Laser Cambridge Laboratories </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> l = 258 nm </td></tr><tr><td> Laser a ioni argon </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> À = 488 nm </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Obiettivo Microscopio </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0,5 NA </td><td> l = 258 nm </td></tr><tr><td> Obiettivo Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> À = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Traduzione stage motorizzato </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-12-6436 Series </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Photon contatore </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochrometer </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD della fotocamera </td><td> Andor Tecnologia </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Guanidina cloridrato (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic mixers for studying protein folding

Il processo attraverso il quale una proteina piega nella sua conformazione nativa è molto importante per la biologia e la salute umana ma ancora poco conosciuta. Una ragione di ciò è che piegatura avviene in un ampio intervallo di tempi, di nanosecondi per secondi o più, a seconda della proteina 1. Convenzionali stopped-flow mixer hanno permesso la misura della cinetica di piegatura a partire da circa 1 ms. Abbiamo recentemente sviluppato un mixer microfluidico che diluisce denaturante ~ 100 volte in ~ 8 ms 2. A differenza di un miscelatore stopped-flow, questo mixer opera in regime di flusso laminare in cui turbolenza non si verifica. L&#39;assenza di turbolenza permette una precisa simulazione numerica di tutti i flussi all&#39;interno del mixer con l&#39;accordo eccellente per sperimentare 3-4. Flusso laminare si ottiene per numeri di Reynolds Re ≤ 100. Per le soluzioni acquose, ciò richiede geometrie scala micron. Usiamo un substrato rigido, come il silicio fuso o silica, per rendere i canali 5-10 micron di larghezza e 10 micron profondo (vedi figura 1). Le piccole dimensioni, all&#39;ingresso della zona di mescolamento, sono dell&#39;ordine di 1 micron di dimensione. Il chip è sigillata con un vetro sottile o coprioggetto silice fusa per l&#39;accesso ottico. Tipici i tassi di flusso totale lineari sono ~ 1 m / s, ottenendo Re ~ 10, ma il consumo di proteine ​​è solo ~ 0,5 Nl / s o 1,8 microlitri / hr. La concentrazione proteica dipende dal metodo di rivelazione: Per la fluorescenza del triptofano concentrazione tipica è di 100 pM (Trp per 1 / proteina) e per FRET la concentrazione tipica ~ 100 nM. Il procedimento di piegatura viene avviata mediante rapida diluizione di denaturante da 6 M a 0,06 M guanidina cloridrato. La proteina in denaturante alta scorre lungo un canale centrale ed è soddisfatta su entrambi i lati in corrispondenza della zona di miscelazione da buffer senza denaturante spostare circa 100 volte più veloce (vedi Figura 2). Questa geometria provoca restringimento rapido del flusso proteina in una strettajet ~ 100 nm di larghezza. La diffusione delle molecole di luce denaturante è molto rapida, mentre la diffusione delle molecole proteiche pesanti è molto più lenta, diffondendo minore di 1 um in 1 ms. La differenza in costante diffusione del denaturante e le proteine ​​risultati in rapida diluizione del denaturante dal flusso proteina, riducendo la concentrazione efficace del denaturante attorno alla proteina. Il getto proteina scorre a velocità costante lungo il canale di osservazione e fluorescenza della proteina durante la piegatura possono essere osservati con un microscopio confocale a scansione 5.

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Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

In questo lavoro si spiega la fabbricazione e l&#39;uso di un mixer microfluidico in grado di miscelare due soluzioni in ~ 8 ms. Abbiamo anche l&#39;uso di questi miscelatori con rivelazione a fluorescenza usando spettroscopia UV e trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).

Miscelatori per lo studio microfluidici Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

microfluidic-mixers-for-studying-protein-folding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Views.  Michigan State University. In questo lavoro si spiega la fabbricazione e l'uso di un mixer microfluidico in grado di miscelare due soluzioni in ~ 8 ms. Abbiamo anche l'uso di questi miscelatori con rivelazione a fluorescenza usando spettroscopia UV e trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).