1. Prima del processo, preparare e raccogliere i seguenti elementi <ol><li> Si prega di fare riferimento all&#39;immagine della Figura 1a) e 1b) per la costruzione di una piattaforma di legno per trattenere il mouse durante la procedura. </li><li> Mix di digestione per linfonodi - HBSS + 1.25mg/ml Collagenasi TypeIV o 2,5 mg / ml Collagenasi D </li><li> Mix di digestione per i polmoni - HBSS + 1 mg / ml Collagenasi </li><li> Diluire sfere di lattice (1:20) in PBS per iniezione intraperitoneale di visualizzare i LDLNs </li></ol> Nota: LDLNs sono piccoli e difficili da trovare. Per informazioni su come trovarli, iniettare 200μl della diluito 1:20 sfere di lattice rosso fluorescente ip nel topo. Il peritoneo fognature a questi LDLNs 8. 24 HPI, esporre la cavità toracica del mouse come descritto sopra. Il LDLNs apparirà rosa le perline che drenato dalla cavità peritoneale. <ol start="5"><li> Globuli rossi (RBC) Lysis Buffer - 0,15 m NH 4 Cl, 10mM KHCO 3, 0.1 mM Na 2 EDTA in 1L dH 2 0. Regolare il pH a 7,2-7,4 e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Cellula filtro 70μm o 100μm </li><li> Soluzione madre di 0.5M EDTA, pH = 8.0 </li><li> HBSS senza CaCl 2 e MgCl 2 </li><li> Forbici e blunt-ended forcipe </li><li> Laringoscopio </li><li> Gavage ago (22 gauge) piegato ad angolo (Figura 2) </li><li> Styrofoam bordo e perni per la diffusione del mouse </li><li> Bilancia a due piatti in alto </li><li> Anilina blu Soluzione - 10 mg in H 2 O </li></ol> Nota: Useremo questa soluzione per la dimostrazione di esso tecnica di iniezione. 2. Preparazione e la somministrazione di anestetici del mouse <ol><li> Preparare una miscela di xylazina e ketamina in PBS sterile in modo che le concentrazioni finali sono 2mg/ml e 10mg/ml rispettivamente. </li><li> Pesare il mouse su un equilibrio pan superiore. </li><li> Calcolare la dose richiesta per ogni mouse. Dose alla xylazina (2-4 mg / kg) e ketamina (70-80 mg / kg) di peso corporeo in giusto volume della miscela preparata e iniettare intaperitoneally. Ogni ceppo di topi può richiedere l&#39;ottimizzazione di anestetico. Topi riceve troppo anestetico può avere un tasso ridotto respirazione che potrebbe essere fatale dopo inoculo viene instillata nei polmoni. </li><li> Dopo 3-5 minuti, osservare il mouse per gli effetti degli anestetici. Controllare i seguenti segni per confermare che il mouse è completamente anestetizzato: <ol><li> Il tasso di respirazione dovrebbe rallentare. </li><li> Il mouse non dovrebbe allungare il suo braccio quando preso per il collo. </li><li> Non ci dovrebbe essere alcuna risposta quando gli arti posteriori sono stimolati. Se questi criteri non sono soddisfatti, attendere per qualche minuto e controllare di nuovo prima di procedere alla fase successiva. </li></ol></li></ol> 3. Iniezione intratracheale <ol><li> Preparare il innoculum in soluzione salina 50μl. Riempire una siringa da 1ml con ago sterile sonda gastrica piegato con il innoculum. La siringa deve essere caricata con una tasca d&#39;aria 100μl dietro la innoculum per assicurare che tutto il fluido è instillato nei polmoni. </li><li> Posizionare il mouse sulla piattaforma inclinata di legno appeso dai suoi incisivi sul filo e delicatamente trattenere sul posto con un pezzo di nastro. </li><li> Accendere il laringoscopio con la mano sinistra (destra se siete mancini) e prendere un paio di pinze smussato finita. Utilizzare la punta del laringoscopio e pinza per sollevare delicatamente aprire la bocca. </li><li> Con la pinza, tirare la lingua fuori e tenerlo da parte. Guida la lama laringoscopio verso la parte posteriore della bocca. Tenere il laringoscopio premuto molto delicatamente in un angolo di 90 ° fino a vedere l&#39;apertura della trachea. Tenere il laringoscopio a posto. Si deve prestare attenzione quando si tira la lingua dalla bocca e questo dovrebbe essere fatto con delicatezza in modo che nessun danno tissutale si verifica. </li><li> Con l&#39;altra mano, prendere la siringa da 1 ml contenente il innoculum, dotato di sonda gastrica l&#39;ago piegato con le mani a destra e inserire l&#39;ago nella trachea fino a quando la curva è l&#39;ago dalla incisivi davanti. Spingere il pistone in modo uniforme di consegnare il innoculum. Il innoculum non bolla. Estrarre l&#39;ago della trachea nel più breve tempo possibile. I topi si soffoca e muore, se la trachea è bloccata per troppo tempo. Tenere il mouse in posizione verticale per qualche secondo per permettere innoculum di essere inalate nei polmoni. </li><li> Prendete il mouse fuori della piattaforma e vicino ad una lampada riscaldante. Non lasciare i topi sotto il fuoco diretto per lunghi periodi di tempo. Il mouse dovrebbe essere pienamente sveglio entro 30 minuti dopo la procedura (tempi di recupero possono variare in base ceppi). I topi devono essere osservati diligentemente durante questo tempo e non deve essere consentito di avere troppo caldo o troppo freddo, potrebbe anche mettere i topi in distress respiratorio che portano alla morte. </li></ol> 4. La raccolta e la lavorazione del polmone linfonodi drenanti e polmoni per citometria a flusso<ol><li> Sacrificio topo, utilizzando il metodo desiderato secondo le linee guida del AVMA eutanasia. Questo può variare a seconda dei risultati raccolti individuali. Somministrazione di un letale non di sodio pentobarbital è un esempio di una procedura di eutanasia appropriata. Non abbiamo visto gli effetti negativi polmonare di eutanasia da parte di CO 2. </li><li> Pin le braccia e le gambe su una tavola di dissezione. Fare un&#39;incisione lungo il centro del lato ventrale con le forbici. Tirare delicatamente la pelle ed esporre i muscoli della parete toracica. </li><li> Praticare incisioni attraverso i muscoli della parete toracica per esporre gli organi addominali. </li><li> Tenere la punta dello sterno, con la pinza e perforare la membrana. Tagliare la membrana lungo i lati della gabbia toracica. </li><li> Con le forbici parallele alla superficie della scheda dissezione, tagliare la cavità toracica lungo il dorso-ventrale linea su entrambi i lati. </li><li> Sollevare leggermente la gabbia toracica in su. Sul lato destro del cuore, proprio sotto il timo, cercare due linfonodi. Un nodo leggermente più grande linfa terzo si trovano sotto un piccolo vaso arterioso che corre perpendicolare alla trachea. Linfonodi raccolta in 1 ml di mix di digestione dei linfonodi. </li><li> Dopo la raccolta i linfonodi, tenere il cuore con un paio di pinze e afferrare i polmoni con un altro. Polmoni raccolta in 3 ml di ghiaccio PBS freddo in un 6-pozzetti. </li><li> Separare i lobi dei polmoni, aspirare PBS e tagliare i lobi in piccoli pezzi con pinze e forbici. Aggiungere 3 ml della miscela di digestione per i polmoni. Tenere il 6 pozzetti sul ghiaccio durante questa fase. </li><li> Incubare i linfonodi per 25-30 min e polmoni per 30 minuti a 37 ° C. Aggiungi EDTA a una concentrazione finale di 10mM a ciascuna delle miscele di digestione per bloccare la reazione e il luogo sul ghiaccio. </li><li> Utilizzando una siringa da 3 ml, passare i pezzi di polmoni attraverso un ago 18GA 3 volte. Mash i pezzi dei polmoni e il LNs attraverso 70-100μm filtri cellulare utilizzando il back-end di un stantuffo della siringa da 1 ml. Lavare i filtri cella con 10 ml di HBSS senza Ca 2 + e Mg 2 +. Centrifugare a 500 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di tampone di lisi e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 ml di HBSS senza Ca 2 + e Mg 2 + per placare la lisi. Centrifugare a 500 xg per 5 min. Portare il polmone e sospensioni cellulari LDLN singola 10ml e 5 ml, rispettivamente. Contare le cellule vive usando un emocitometro per esclusione trypan blu. Le cellule sono ora pronti a macchia di citometria a flusso. 1 lobo del polmone potrebbe essere sufficiente per la citometria a flusso. Lobi altri possono essere utilizzati per altre questioni sperimentali all&#39;interno del mouse stesso, come omogenati di citochine o di tessuto per esame istologico. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: PMA e macrofagi alveolari dei polmoni acquisire antigene dagli spazi alveolari dei polmoni immediatamente dopo l&#39;iniezione. La figura 3 mostra la percentuale di CD11c + (espresso sulla PMA e macrofagi alveolari), le cellule che sono positivi per spore di Bacillus anthracis fluorescente, 30 minuti dopo che l&#39;iniezione. In questo momento, ~ 15,9% di CD45 + + CD11c cellule nella sospensione singola cellula del polmone nutrito spore Bacillus anthracis (Figura 3, pannelli inferiori). Per un&#39;ulteriore caratterizzazione di cellule CD11c + nei polmoni, fare riferimento a Kim e Braciale 4. Perline fluorescente sono normalmente utilizzati per valutare il traffico di antigeni particolato LDLNs 9. Per valutare questo trasporto dai polmoni al LDLNs, fluorescente sfere di lattice che sono stati iniettati con LPS e LDLNs sono stati analizzati a 24 HPI. Circa il 4% delle cellule CD11c hi nel LDLNs ospitava perline fluorescenti a 24hpi (Figura 4). Questi esperimenti dimostrano che questo rappresentante protocollo può essere efficacemente utilizzato per tenere traccia delle cellule che acquisiscono antigeni particelle inalate nei polmoni e, successivamente, li il traffico verso il LDLNs. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Piattaforma di legno per immobilizzare i topi durante lo iniezione. Un blocco di legno è stato tagliato in un angolo e barre di metallo sono stati montati, la facciata figura 1a) e 1b vista laterale figura). Un piccolo pezzo di filo era avvolto intorno alla barra di metallo per ancorare gli incisivi davanti al mouse. Un pezzo di nastro è stato fissato alla piattaforma di legare attorno al mouse per mantenere in posizione durante la procedura. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Aghi sonda gastrica per esso iniezione. Un ago sonda gastrica (a destra) è stato piegato ad un angolo di ~ 135 ° (a sinistra) per lo iniezione. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Percentuale di tutte le cellule + CD11c nei polmoni che lo porto GFP iniettato esprimere Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), sfida dopo 5 ore. AJ topi sono stati sfida con 1x10 8 GFP-spore di Bacillus anthracis ei polmoni sono stati analizzati presso l&#39;infezione dopo 5 ore. I grafici mostrano punto percentuale di CD11c + cellule dei polmoni che sono positivi per il Bacillus anthracis. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Rilevamento di perline fluorescenti (giallo / verde) nel polmone linfonodo drenante 24 ore successive i. Iniezione t. AJ topi sono stati trattati con PBS (pannello di sinistra) o 5x10 9 Fluoresbrite YG Microsfere (0.5μm) con 10μg LPS (pannello di destra) sono stati analizzati e LDLNs 24hpi. Rappresentante trame dot mostrare la percentuale di cellule CD11c hi nel LDLNs che porto perline fluorescenti tramato contro un canale vuoto.

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	<li>Grayson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+lung+dendritic+cell+maturation+and+migration+during+respiratory+viral+infection.">Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection.</a> J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).</li><li>GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8++T+cell+responses.">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li><li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity.">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li><li>Thomas, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transoral+tracheal+intubation+of+rodents+using+a+fiberoptic+laryngoscope.">Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope.</a> Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).</li><li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat.">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li><li>Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo utilizzato questo protocollo per studiare il traffico di spore di Bacillus anthracis dai polmoni al LDLNs. Per le applicazioni simili, il numero di particelle consegnato ai polmoni dovrebbero essere scelti con cura in modo che il materiale iniettato può essere rilevato nel LDLNs mediante citometria di flusso. Abbiamo anche utilizzato con successo questo metodo per il trasferimento adottivo di cellule e l&#39;etichettatura delle popolazioni specifiche cellule del polmone utilizzando anticorpi fluorescen...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Cella stariner 70μm </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anilina blu </td><td> Pescatore </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;alimentazione degli animali ago </td><td> Popper e Sons Inc </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi TypeIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG Microsfere (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laringoscopio Lama </td><td> PennCentury, Inc </td><td> Per il modello LS-1 </td><td> Fare riferimento a <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Leggero laringoscopio a fibre ottiche </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso Perline fluorescente (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Per l&#39;iniezione ip </td></tr><tr><td> Xylazina (100mg/ml) </td><td> Lloyd Laboratori </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry

Fagociti come i macrofagi alveolari e le cellule dendritiche del polmone (PMA) in continuo campione antigeni dagli spazi alveolari dei polmoni. PMA, in particolare, sono noti a migrare verso i nodi polmone drenaggio linfatico (LDLNs) dove sono presenti gli antigeni inalati alle cellule T di avviare un&#39;adeguata risposta immunitaria a una varietà di immunogeni 1,2. Alle interazioni modello tra i polmoni e gli antigeni aeree nei topi, gli antigeni può essere somministrato per via intranasale 1,3,4, intratracheally 5 o sotto forma di aerosol 6. Consegna da ogni tracciato prevede distinte competenze tecniche e limitazioni che devono essere considerati prima di progettare un esperimento. Per esempio, l&#39;esposizione intranasale e aerosol antigeni offre ad entrambi i polmoni e il tratto respiratorio superiore. Quindi antigeni possono accedere al tessuto linfoide associato nasale (NALT) 7, potenzialmente complicare l&#39;interpretazione dei risultati. Inoltre, la deglutizione, lo starnuto e la frequenza respiratoria del mouse può anche portare a incongruenze nelle dosi consegnate. Anche se il coinvolgimento del tratto respiratorio superiore può essere preferito per alcuni studi, può complicare esperimenti concentrandosi sugli eventi specificamente avviata nei polmoni. In questa impostazione, il intratracheale (it) percorso è preferibile in quanto offre materiali di prova direttamente nei polmoni e ignora il NALT. Molti protocolli di iniezione coinvolgere l&#39;intubazione sia cieco della trachea attraverso la cavità orale o esposizione chirurgica della trachea per accedere ai polmoni. Qui, descriviamo un semplice, coerente, metodo non chirurgico per esso l&#39;instillazione. L&#39;apertura della trachea è visualizzata utilizzando un laringoscopio e un ago piegato sonda viene quindi inserito direttamente nella trachea di consegnare il innoculum. Abbiamo anche descrivere le procedure per la raccolta ed elaborazione dei LDLNs e polmoni per l&#39;analisi del traffico di antigeni in citometria a flusso.

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Illustriamo non chirurgica consegna dei materiali di prova nei polmoni di topi anestetizzati attraverso la trachea. Questo metodo permette l&#39;esposizione dei polmoni a patogeni batterici e virali, citochine, anticorpi, perline, prodotti chimici o coloranti. Approfondiremo la raccolta ed elaborazione dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante (LDLNs) per la citometria a flusso.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

57.1K Views.  University of Colorado School of Medicine. Illustriamo non chirurgica consegna dei materiali di prova nei polmoni di topi anestetizzati attraverso la trachea. Questo metodo permette l'esposizione dei polmoni a patogeni batterici e virali, citochine, anticorpi, perline, prodotti chimici o coloranti. Approfondiremo la raccolta ed elaborazione dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante (LDLNs) per la citometria a flusso.

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Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Lo studio delle interazioni di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Un test CFSE-based per studiare la migrazione delle cellule dendritiche murini della pelle in drenanti linfonodi durante l&#39;infezione con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l&#39;identificazione dei linfociti sottoinsiemi all&#39;interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic findings similar to human acute respiratory distress syndrome (ARDS). The resulting alveolar edema, alveolar-capillary barrier damage, and leukocyte infiltration predominantly affect the left lung, preserving the right lung as an uninjured control and allowing animals to survive. This model of self-limited acute lung injury enables investigation of tissue resolution mechanisms, such as macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils and restitution of alveolar-capillary barrier integrity. This model has helped identify important roles for resolution agonists, including specialized pro-resolving mediators (SPMs), providing a foundation for the development of new therapeutic approaches for patients with ARDS.

Selective intra-bronchial acid instillation to the left lung in mice results in unilateral and self-limited acute lung injury that models human acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by gastric acid aspiration.

Un modello di lesione polmonare acuta autolimitata dall'instillazione unilaterale dell'acido intra-bronchiale

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...