Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia. Gli autori vorrebbero riconoscere Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Germania) per la sponsorizzazione di questo manoscritto, Dott. Paolo Petrucciani (Dipartimento di Immuno-ematologia e Servizio Trasfusionale, Ospedale Lotti Pontedera, Pisa, Italia) per la fornitura di buffy coats umane e Prof. Massimo Pasqualetti (Dipartimento di Biologia - Unità di Biologia Cellulare e dello Sviluppo, Università di Pisa, Pisa, Italia) per l&#39;alloggiamento della colonia mouse.

DICHIARAZIONE ETICA Campioni umani e animali sono stati trattati seguendo le linee guida del Ministero della Salute italiano, la legge 116/92 e della Direttiva Comunità Europea del Consiglio 86/609/CEE. 1. Culture Monocita cellulari <ol><li> Cultura umana THP-1 in cellule T-75 beute contenenti terreno RPMI-1640 integrato con 10% di siero umano, 50 U / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanolo a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Culture Split quando confluenti (ogni 3-5 giorni). </li></ol> 2. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da Buffy Coats <ol><li> Prima di iniziare il protocollo di isolamento, preparare una soluzione di tampone fosfato (PBS) pH 7,2, 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5% di siero albumina bovina (BSA), aggiungendo 5 ml BSA Stock Solution a 95 ml di risciacquo tampone (1: 20 diluizione). Degassarla buffer e mantenerlo freddo (2-8° C). IMPORTANTE: la mancata Degas buffer può provocare in meno rispetto ottimali risultati perché bolle possono bloccare la colonna di isolamento (vedere il punto 3.2). Nota: anticoagulante citrato destrosio formula-A (ACD-A) o destrosio fosfato citrato (CPD) può essere utilizzato in alternativa. Al contrario, altre proteine ​​albumina o sieri ottenuti da altre specie possono sostituire BSA. Non usare tamponi contenenti Ca 2 + o Mg 2 +. </li><li> Ottenere buffy coats da donatori sani (età 20-60 anni). </li><li> Preparare 50 ml provette coniche per la densità centrifugazione in gradiente. Determinare il numero di tubi necessari per l&#39;elaborazione del sangue (ogni tubo può elaborare 35 ml di sangue diluito) e aggiungere 15 ml di Ficoll-Paque a ciascuna provetta vuota. </li><li> Diluire 8 ml di sangue con 24 ml di PBS / BSA soluzione / EDTA (1:4 diluizione). </li><li> Strato accuratamente la soluzione diluita in cima Ficoll-Paque (densità = 1.077 g / ml) in ciascuna delle 50 ml provette coniche. Non mescolareil sangue e Ficoll-Paque. IMPORTANTE: Per evitare la miscelazione del sangue e Ficoll-Paque, tenere il tubo ad angolo di 45 ° e sovrapporre la miscela sangue lentamente. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 30 min a 4 ° C. Le cellule mononucleate (MNC) rimarranno all&#39;interfaccia plasma Ficoll-Paque, considerando che i granulociti ed eritrociti sedimenti a causa della maggiore densità alla pressione osmotica del Ficoll-Paque. </li><li> Trasferire le cellule in interfase (Le cellule mononucleate del sangue, PBMC) in un tubo da 50 ml riempito con PBS / BSA / EDTA e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Lavare il pellet due volte con PBS / BSA / EDTA per rimuovere le piastrine. Spin a 200 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Cultura le cellule in completo RPMI-1640 con siero e antibiotici umano 10% o procedi alla monociti depurazione. </li></ol> 3. Purificazione di primaria monociti da PBMC <ol><li> Isolare monociti da PBMC mediante separazione magnetica tallone utilizzando Humun Pan Kit di isolamento dei monociti: <ol><li> Passare cellule attraverso una maglia di 30 micron di nylon (filtri preseparazione, 30 micron) per rimuovere eventuali grumi di cellule. </li><li> Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Sospensione cellulare centrifugare a 300 xg per 10 min a temperatura ambiente (RT). Aspirare il surnatante completamente. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 30 ml di tampone PBS / EDTA / BSA per 10 7 cellule totali. </li><li> Aggiungere 10 ml FcR Reagente Bloccante per 10 7 cellule totali. </li><li> Aggiungere 10 ml di cocktail biotina-anticorpo per 10 7 cellule totali. </li><li> Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 2-8 ° C. </li><li> Aggiungere 30 ml di tampone per 10 7 cellule totali. </li><li> Aggiungere 20 ml di anti-biotina microsfere per 10 7 cellule totali. </li><li> Mescolare bene e incubare per 10 minuti a 2-8 ° C. </li><li> Risospendere fino a 10 8 cellule in 500 microlitri di tampone PBS / EDTA / BSA. </li></ol></li><li> SEPAR magneticazione <ol><li> Di conseguenza il numero totale delle cellule, scegliere una colonna MACS appropriato e MACS separatore (vedi MACS colonna datasheet). </li><li> Posizionare la colonna nel campo magnetico del separatore MACS. </li><li> Preparare colonna sciacquando con la giusta quantità di tampone PBS / EDTA / BSA (colonne MS: 500 microlitri; colonne LS: 3 ml). Nota: Le colonne sono &quot;Arresto flow&quot; e non funzionare a secco. </li><li> Applicare sospensione cellulare sulla colonna. Raccogliere flow-through contenente cellule senza etichetta, che rappresenta la frazione di monociti arricchito. </li><li> Lavare colonna 3x con tampone PBS / EDTA / BSA (500 microlitri per MS e 3 ml per LS a lavaggio). </li><li> Raccogliere le cellule senza etichetta che passano attraverso, in rappresentanza dei monociti arricchiti, e aggiungere al flusso continuo dalla sezione 3.2.4. Nota: Lavare la colonna con l&#39;aggiunta di PBS / EDTA / BSA aliquote tampone solo quando il serbatoio colonna è vuota. </li><li> (Facoltativo) Elimina colonna dalseparatore e posizionarlo su un tubo di raccolta adatto. Pipettare il tampone nella colonna (colonne MS: 1 ml; colonne LS: 5 ml). Sciacquare immediatamente le cellule nonmonocyte marcate magneticamente saldamente spingendo lo stantuffo nella colonna. </li><li> Culture purificato monociti in completo RPMI-1640 con siero e antibiotici umano 10%. </li></ol></li></ol> 4. Purificazione di primaria monociti da sangue intero <ol><li> Purificare monociti dal sangue intero utilizzando intero kit di isolamento dei monociti di sangue seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5. Nanoparticelle internalizzazione nel sangue leucociti e purificata monociti <ol><li> Tavola 5 x 10 5 cellule / ml (1 ml / pozzetto) dei PBMC isolati o le purificati monociti CD14 positivi in un 12-pozzetti. </li><li> Vortex FITC-SiO soluzione stock 2 nanoparticelle e risospendere in mezzo completo ad una concentrazione di lavoro di 100 nm. </li><li> Aggiungere 10 ml di nanop lavoraresospensione articolo (100 nM) per i campioni trattati per raggiungere una nanoparticella concentrazione finale di 1 nm. Aggiungere lo stesso volume di terreno completo per controlli non trattati in ciascun pozzetto. </li><li> Dopo 1 ora internalizzazione raccogliere i campioni in una provetta di polipropilene da 1,5 ml e si centrifuga per 3 min a 6000 xga RT. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di tampone di corsa 3 min a 6000 xga RT. </li><li> Risospendere il pellet in 200 ml di tampone di corsa. Le cellule sono ora pronti per la lettura mediante citometria di flusso. </li></ol> 6. Isolamento dei primari Culture gliali miste (Vedi Bertero et al. 7) 7. Replating una cultura cellule gliali Confluent misto <ol><li> Lavare un pallone T-75 una volta con 10 ml di PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), quindi aggiungere 10 ml di Versene e incubare a 37 ° C per 5-7 min. </li><li> Pipettare il supernatante su e giù diverse volte per staccare le cellule dalla superficie T-75 e sciogliereaggregati cellulari. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di polipropilene da 15 ml. Raccogliere una piccola quantità di sospensione cellulare per contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Centrifugare la sospensione di cellule per 5 minuti a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet ad una concentrazione finale di 5 x 10 5 cellule / ml in terreno di coltura completo gliale. </li><li> Piatto 0,5 ml / pozzetto in una piastra a 24 pozzetti e lasciare che le cellule accontentarsi di 2-4 ore prima del trattamento delle nanoparticelle. </li></ol> 8. Nanoparticelle internalizzazione in Microglia <ol><li> Aggiungere 500 ml di mezzo completo di coltura gliale (per controlli non trattati) o 500 ml di una sospensione 2x rodamina-SiO 2 nanoparticelle in mezzo completo di coltura gliale (per campioni trattati) a ciascun pozzetto. </li><li> Pipettare le cellule per permettere il distacco delle cellule nonrapid-aderente ai punti di tempo prescelti e raccoglierli in tubi di polipropilene 2 ml. </li><li> Aggiungere 500 microlitridi Versene a ciascun pozzetto ed incubare la piastra a 37 ° C per 5 min, quindi staccare la frazione di cellule rimanenti e raccogliere ogni campione con le corrispondenti cellule nonadhering del passo precedente. </li><li> Centrifugare i campioni per 3 min a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet in 100 ml di AutoMACS tampone di corsa. </li></ol> 9. Colorazione con CD11b-VioBlue <ol><li> Aggiungere 10 ml di VioBlue-CD11b anticorpo umano / mouse per 100 ml di sospensione cellulare (01:11 ratio) in tampone di corsa e incubare 10 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di corsa e miscelare la sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare ogni campione per 3 min a 300 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 100-150 ml di tampone di corsa. </li><li> Leggere i campioni al citometro (conservare i campioni a 4 ° C tra gli ultimi due passaggi). IMPORTANTE: prima di analizzare i campioni, procedere alla compensazione dei segnali sovrapposti iGli spettri di emissione n osservata tra i diversi fluorocromi (nanoparticelle o anticorpi fluorocromo coniugato). </li></ol> 10. Spill Spectral Oltre Compensation <ol><li> Aprire il dialogo &quot;Impostazioni dello strumento&quot; (presente in tutti i programmi software strumento). Nota: Se si utilizza uno strumento diverso da quello riportato nella tabella Materiale, fare riferimento al manuale specifico strumento per i particolari di acquisizione. </li><li> Acquisire campione non trattato (senza nanoparticelle) a bassa velocità fluido (se consentito dallo strumento). Durante l&#39;acquisizione, regolare manualmente l&#39;ora e la dispersione laterale (FSC e SSC, rispettivamente) regolando i canali di tensione. Nota: Modificare le scale degli assi SSC e FSC per visualizzare al meglio la popolazione cellulare completo nella trama. Una impostazione di template per ogni tipo di cellula di interesse strumento può essere creato, salvata e utilizzata per future acquisizioni. </li><li> Aprire la specificaScheda &quot;regione&quot; nel software. Disegnare una regione grande appropriata (&quot;gate&quot;) in giro per la popolazione desiderata. Nota: internalizzazione delle nanoparticelle induce uno spostamento SSC delle cellule. Se il cancello è troppo strettamente limitato intorno alla popolazione di cellule, i dati acquisiti saranno probabilmente perdere parte delle cellule da rilevare. </li><li> Utilizzare due campioni non colorati, uno per l&#39;uso come campione in bianco e una per risarcimento contro PI colorazione (opzionale), un campione unico tinto con il fluorocromo appropriata per ogni canale di fluorescenza di essere risarciti. Nota: utilizzare un diverso tubo campione 1,5 ml per ciascuna di anticorpi coniugati da utilizzare nell&#39;etichettatura esperimento. </li><li> Aprire la scheda &quot;compensazione&quot; nella casella &quot;Impostazioni strumento&quot;. Aumentare o diminuire il fattore di compensazione in sede di acquisizione fino a quando l&#39;intensità di fluorescenza nel canale spillover è più o meno lo stesso per la pos fluorocromoitive e la popolazione negativo. </li><li> Acquisire campioni di nanoparticelle trattati dopo la compensazione è stata regolata. </li></ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano che Miltenyi Biotech GmbH ha sponsorizzato la presentazione di questo manoscritto. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) è una nanotecnologia spin off azienda nata da IIT.

Il protocollo sperimentale presenta punti molto importanti da prendere in considerazione. E &#39;molto importante lavorare a 4 ° C (su ghiaccio) e possibilmente al buio durante tutte le fasi di colorazione, in quanto temperature più elevate e le luci possono influenzare negativamente la resa colorazione. Le nanoparticelle potrebbero essere sonicati essere meglio risospeso prima dell&#39;uso. Una corretta analisi di citometria a flusso richiede una corretta calibrazione dei diversi canali. La calibrazione dello strumento deve essere eseguita prima di ogni sessione sperimentale. Oltre a problemi tecnici con la strumentazione, ci possono essere anche problemi con l&#39;etichettatura degli anticorpi. È obbligatorio utilizzare l&#39;anticorpo in una concentrazione appropriata. Se la concentrazione è troppo alta o troppo bassa, intensità di segnale insoddisfacenti possono essere la conseguenza. Gli svantaggi di questa tecnica riguardano la necessità di lavorare con campioni monodispersi, l&#39;impossibilità di localizzare ilsito di origine del segnale (cioè differenti compartimenti cellulari). Ci sono anche alcuni limiti nella scelta di fluorocromi da utilizzare in combinazione: la lunghezza d&#39;onda di eccitazione e le bande di emissione deve essere separato misura sufficiente a consentire la loro misurazione appropriata. Se gli spettri anticorpo utilizzato sovrappongono, è necessaria una corretta compensazione. La citometria a flusso è un metodo efficace per l&#39;analisi di cellule in presenza o assenza di nanoparticelle. Questa tecnica permette uno studio multiparametrica di una cella, un elevato numero di eventi esaminati, rapidità di analisi (cellule oltre 1.000 / sec), riproducibilità e letture statistici. I campioni possono essere trattati senza perdere la vitalità cellulare. Utilizzando nanoparticelle fluorescente è possibile qualificare e quantificare la loro internalizzazione in sottopopolazioni di cellule, che sono identificati dai marcatori specifici esposti sulla membrana cellulare. Parametri di cella possono cambiare in presenza di s<html> nanoparticelle specifici applicabili. A seconda dello scopo della ricerca, queste variazioni possono essere usate per identificare un fenomeno specifico, come dispersione laterale di cellule che aumenta proporzionalmente con l&#39;aumentare tasso internalizzazione delle nanoparticelle. Modifiche nanoparticelle indotta di superficie cellulare possono anche rappresentare una limitazione della tecnica. Per questo motivo, recettori di membrana fatturato deve essere sempre preso in considerazione ed eventualmente noto in anticipo per caratterizzare con precisione la popolazione di cellule. Menomazioni estreme di membrana ad osmosi in campioni di nanoparticelle sovraccarico può portare alla morte delle cellule. Nanomateriale tossicità dose-dipendente deve essere empiricamente testato per ciascuna popolazione cellulare. Le cellule morte chiaramente definite devono essere esclusi dalla quantificazione della fluorescenza. Per esempio, annessina V / PI colorazione è uno dei diversi metodi generalmente utilizzati per rilevare le cellule sia necrotiche e apoptotici. &quot;&gt; Cellule primarie-GFP che esprimono sono anche un potente strumento per selezionare una determinata sottopopolazione di cellule e raccogliere dati senza prelabeling. L&#39;abbinamento con nanoparticelle fluorescenti complementari permette una quantificazione molto veloce e preciso di interazione cellule-nanoparticelle. Consegna della droga o il gene è pensato per essere migliorata in futuro mediante l&#39;applicazione di nanoparticelle in grado di rilasciare un carico specifico farmaco nei tessuti selezionati. Impiego di nanoparticelle come modulatori specifici vettori di consegna e / o del sistema immunitario per la farmaceutica richiede la conoscenza del contesto biologico (ad esempio attraverso citometria a flusso) per studiare le interazioni cellula-nanoparticelle.

Nanomateriali ingegnerizzati sono oggi ispirano l&#39;interesse degli scienziati di vita per le potenziali applicazioni alla biomedicina 1. Un&#39;ampia varietà di materiali inorganici e organici può essere usato per produrre nanostrutture con differenti forme, fisiche e le caratteristiche chimiche. Tra queste strutture, le nanoparticelle ingegnerizzate di forma sferica hanno dimostrato un grande potenziale per la diagnostica e la medicina traslazionale 2. Il loro core e disegno di superficie sono guidati da una possibile applicazione ed implica un profondo studio delle risposte delle cellule bersaglio in seguito a contatto delle nanoparticelle e l&#39;interazione. Nanoparticelle che si pensa siano deliberatamente somministrato a soggetti umani entreranno in contatto diretto con diversi tipi di cellule immunitarie. La loro responsabilità di mantenere l&#39;integrità del corpo li un tema cruciale di ricerca in nanomedicina 3 fa. La parte cellulare del sistema immunitario innato è rappresentato principalmente da phagociti. Tra questi, il lignaggio monociti / macrofagi cellule derivate, comprese le microglia residenti del sistema nervoso centrale, gioca un ruolo chiave nella difesa immunitaria 4,5. Essi sono in grado di attivare risposte protettive entro poche ore dopo l&#39;incontro con corpi estranei. Inoltre, coordinare le cellule monociti e istruiscono la risposta immunitaria adattativa attraverso il rilascio di citochine. Tutti questi eventi si verificano anche in presenza di materiali ingegnerizzati, ampiamente percepite come &quot;non-sé&quot; dal sistema immunitario 6. Tra i metodi storicamente utilizzati in immunologia per l&#39;analisi cellulare, citometria a flusso rappresenta uno degli strumenti più potenti. Inoltre, la disponibilità di tecnologie per l&#39;identificazione o purificazione di una sottopopolazione immunitaria specifica (spesso sfruttando l&#39;esclusione o la presenza di una proteina di membrana singola) consente un&#39;indagine precisa degli effetti di una certa nanoparticella su quel particolare ce primarioTipo ll 7. Tuttavia, le cellule possono presentare alterazioni fisiologiche e morfologiche dopo l&#39;esposizione alle nanoparticelle. Così, le nanoparticelle possono interferire con parametri ottici specifici, come l&#39;assorbimento o di emissione di luce a lunghezze d&#39;onda definite, influenzando i risultati ottenuti 8. Quindi, devono essere considerati i limiti di impiego e di eventuali adattamenti di classici saggi immunologici per lo studio di nuovi materiali. Questo lavoro riguarda la rilevazione delle interazioni delle nanoparticelle con cellule immunitarie primarie di citometria a flusso. Per risolvere questo problema, 50 nm FITC-SiO 2 nanoparticelle sono stati impiegati come modello nanomateriale per descrivere il metodo. Particelle di silice possono essere prodotti in modo molto preciso nella scala nanometrica. Dimensione, forma, superficie e proprietà, come carica o idrofobia, possono essere finemente sintonizzati per aumentare la loro biocompatibilità 9. Molte caratteristiche di SiO 2 nanoparticelle consentono loro di essere utilizzati comemodello per la consegna della droga particelle 10. Inoltre, tinture fluorescenti o punti quantici possono essere intrappolati o legati a queste particelle che offrono utili nano-strumenti per scopi di imaging 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

Nanoparticelle ingegnerizzate sono dotate di proprietà molto promettenti per fini terapeutici e diagnostici. Questo lavoro descrive un metodo veloce e affidabile di analisi mediante citometria a flusso per studiare l&#39;interazione delle nanoparticelle con cellule immunitarie. Cellule immunitarie primarie possono essere facilmente purificati da tessuti umani o di topo da isolamento magnetico mediata da anticorpi. In primo luogo, le varie popolazioni cellulari che funzionano in un citometro di flusso possono essere distinti dalla luce avanti sparsi (FSC), che è proporzionale alla dimensione della cella, e la luce laterale diffusa (SSC), in relazione alla cella complessità interna. Inoltre, fluorescente anticorpi contro specifici recettori di superficie consentono l&#39;identificazione di diverse sottopopolazioni all&#39;interno dello stesso campione. Spesso, tutte queste caratteristiche variano a quando le cellule sono potenziati da stimoli esterni che cambiano il loro stato fisiologico e morfologica. Qui, 50 nm FITC-SiO 2 nanoparticelle sono usati come modello per identificare the internalizzazione dei materiali nanostrutturati nelle cellule immunitarie del sangue umano. La fluorescenza delle cellule e l&#39;aumento della luce laterale dispersa dopo incubazione con nanoparticelle ha permesso di definire il tempo e la dipendenza dalla concentrazione di interazione nanoparticelle-cell. Inoltre, tale protocollo può essere esteso per indagare rodamina-SiO 2 nanoparticella interazione con microglia primaria, le cellule nervoso centrale residenti sistema immunitario, isolati da topi mutanti che specificamente esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) nel lignaggio monociti / macrofagi. Infine, citofluorimetria dati relativi a nanoparticelle internalizzazione nelle cellule sono state confermate mediante microscopia confocale.

Citometria a flusso è uno strumento utile per identificare e caratterizzare cellule differenti ed è la tecnica di scelta per identificare le cellule immunitarie specifiche, come monociti, granulociti, cellule T, cellule B, natural killer (NK), cellule dendritiche (DC), e altre sottopopolazioni di leucociti. Nel tentativo di meglio caratterizzare il comportamento globuli bianchi in risposta alle nanoparticelle, abbiamo effettuato saggi di internalizzazione con leucociti primari isolati dal sangue di donatori sani (Figure 1 e 2) e con la linea cellulare di monociti umani (cellule THP-1, Figura 3) . Come riportato in Figura 1, le tre principali sottopopolazioni di leucociti nel sangue sono stati chiaramente identificati da avanti e dispersione laterale dopo l&#39;isolamento PBMC. Inoltre, dopo FITC-SiO 2 trattamento, i linfociti (grigio), monociti (blu) e granulociti (rossi) hanno un diverso nanoparticle tasso di internalizzazione come dimostrato da verde intensità di fluorescenza (Figura 1B). Il protocollo descritto consente la purificazione di CD14 primarie monociti positivi da PBMC. Figura 2A riporta la citometria a flusso dot plot di monociti CD14 + in presenza di FITC-SiO 2. Figura 2B mostra FITC-SiO 2 internalizzazione quantificato nelle stesse cellule ed espressa in istogramma scala logaritmica. Esperimenti di internalizzazione simili sono stati eseguiti su THP-1 monociti trattate con concentrazioni crescenti di FITC-SiO 2 nanoparticelle. Cellule non trattate sono state usate come controllo negativo. Figura 3A mostra un aumento dose-dipendente della dispersione laterale con una dispersione in avanti invariato THP-1 linea cellulare. Nella Figura 3B, insieme con gli istogrammi di SSC e FSC per ogni FITC-SiO 2 nanoparticella concentrazione testata, intensità media di fluorescenza (MFI) quantificazione è presentato. Questi dati suggeriscono che il trattamento con FITC-SiO 2 nanoparticelle induce una interiorizzazione dose-dipendente in monociti evidenziati dalla valorizzazione di granularità intracellulare (scattering laterale) e fluorescenza (canale verde). Per ottenere ulteriori approfondimenti nel tipo di interazione tra cellule immunitarie e nanoparticelle, colture gliali miste primarie sono stati isolati e microglia, le cellule nervoso centrale residenti del sistema immunitario, è stato purificato. L&#39;uso di un modello di topo transgenico che esprime microglia fluorescente verde permette la visualizzazione di diversi meccanismi neuro-infiammatoria. Il topo transgenico B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J utilizzata in questo lavoro esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore CX3CR1 12. Dopo 7 giorni in vitro (DIV), microscopia a fluorescenza mostra una cultura gliale primario mescolato con un gran numero di astrociti (GFP cellule aderenti negativos) e alcune cellule verdi (GFP positive, Figura 5A). In questo modello di topo, tre sottopopolazioni gliali possono distinguere mediante citometria a flusso con una sola colorazione CD11b-anticorpo: il primo CD11b - GFP - (astrociti e altre cellule gliali), un secondo gruppo distinto di cellule microgliali CD11b + + GFP, e un terzo CD11b + GFP - sottopopolazione (Figura 4A). Questi ultimi due sottopopolazioni sono entrambi in grado di interiorizzare le nanoparticelle con un lieve aumento di efficienza della GFP + di popolazione (che rappresenta il pattugliamento microglia immaturo per la trascrizione di CX3CR1 promotore), come dimostrato da analisi di citometria a flusso (Figura 4B). L&#39;internalizzazione verificato può essere ulteriormente verificata mediante microscopia confocale utilizzando la stessa concentrazione finale di rodamina-SiO 2 nanoparticelle come illustrato nella Figura 5B. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Figura 1. FITC-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione in isolati leucociti del sangue. A) in avanti rappresentativa di scattering (FSC) contro la dispersione laterale (SSC) citometria a flusso dot plot di Ficoll-Paque isolati leucociti del sangue. B) Fluorescenza verde sovrapposizione istogramma trama dei tre principali leucociti del sangue sottopopolazioni cellulari in presenza di 1 nM FITC-SiO 2 nanoparticelle (+45 mV) per 1 ora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. FITC-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione in CD14 + monociti purificati. A) in avanti rappresentativa di scattering (FSC) contro la dispersione laterale (SSC) citometria a flusso dot plot di purificate monociti CD14 positivi. B) Verde fluorescenza istogramma trama della sottopopolazione di monociti purificato in presenza di 1nM FITC-SiO 2 nanoparticelle (+45 mV) per 1 ora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> Figura 3. Effetti di FITC-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione su cellule THP-1. A) in avanti rappresentativa di scattering (FSC) rispetto scatterin latog (SSC) citometria a flusso dot plot di THP-1 linea di cellule monociti, dopo 1 ora di esposizione di FITC-SiO 2 nanoparticelle crescente concentrazione. B) Variazione concentrazione-dipendente della dispersione laterale (SSC), avanti di scattering (FSC) e verde fluorescenza in presenza di FITC-SiO 2 nanoparticelle (+45 mV) per 1 ora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> Figura 4. Rhodamine-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione in microglia primaria isolato dal B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J topi. A) Verde proteina fluorescente (GFP) rispetto CD11b-VioBlue citometria a flusso dot plot di primary glia mista isolato da B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J topi. CD11b + GFP + e CD11b + GFP - le popolazioni sono riportati in alto a destra e inferiore quadranti di destra, rispettivamente, B) fluorescenza rossa sovrapposizione istogramma terreno di sottopopolazioni microglia in presenza di 1 nm Rhodamine-SiO 2 nanoparticelle (+45 mV) per il 30. min (istogramma rosso) rispetto al controllo (istogramma grigio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> Figura 5. Visualizzazione della GFP +-microglia. (A) microscopia a fluorescenza a 7 DIV e (B) Microscopia confocaledi Rhodamine-SiO 2 nanoparticelle internalizzazione (frecce rosse) in GFP +-microglia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Analisi delle interazioni delle nanoparticelle con sottopopolazioni di cellule immunitarie definite mediante citometria di flusso.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.4K Views.  Istituto Italiano di Tecnologia.  Analisi delle interazioni delle nanoparticelle con sottopopolazioni di cellule immunitarie definite mediante citometria di flusso. 

Video: Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

La valutazione quantitativa delle cellule immunitarie nel tessuto danneggiato del midollo spinale mediante citometria di flusso: un nuovo uso per un metodo di purificazione cellulare

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Lo studio delle interazioni di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

rilevamento di<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...