Il metodo intrabronchiale selettivo è significativo perché offre agli investigatori un modello riproducibile e non letale per lo studio della lesione polmonare acuta, una delle principali cause della sindrome da distress respiratorio acuto nell'uomo. Il vantaggio della tecnica intrabronchiale selettiva è la localizzazione della risposta infiammatoria al polmone sinistro offrendo il polmone destro come controllo illeso e riducendo al minimo il disagio animale. A dimostrare questa procedura sarà Alexander Tavares, tecnico e studente laureato nel nostro laboratorio.
Per preparare 0,1 acido cloridrico normale, aggiungere 11 millilitri di acqua distillata doppia a una bottiglia di vetro ambrato, seguita dalla lenta aggiunta di un millilitro del 37%12 di acido normale. Successivamente, aggiungere lentamente quattro millilitri di un normale stock di lavoro acido in 35 millilitri doppie acque distillate in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi utilizzare una sonda elettronica per pH per misurare il pH della soluzione di stock normale 0.1, titrando a un pH di 1,1 usando idrossido di sodio o soluzione di stock acido secondo necessità per un volume finale di 40 millilitri.
Prima di iniziare la procedura, filtrare da uno a due millilitri della soluzione acida attraverso un filtro sterile da 0,22 microlitri in un tubo di microcentrifugo sterile e confermare una mancanza di risposta al riflesso del dolore in un topo anestetizzato. L'uso di tosatrici elettriche in colpi lenti verso il basso rade delicatamente l'area chirurgica sulla superficie ventrale del topo sotto il mento nella regione cervicale della gola. Rimuovere i capelli sciolti e tamponare la pelle esposta con tre soluzioni consecutive di povidone-iodio e tamponi di alcol isopropile al 70%.
Una volta che la pelle è stata predisposta, posizionare il mouse in posizione supina su una tavola chirurgica pulita e coprire l'animale con un drappo chirurgico sterile. Fare un'apertura longitudinale di 0,5 centimetri nella pelle sopra la trachea e le ghiandole salivari e utilizzare forcep seghettate leggermente curve per ritrarre attentamente la pelle. Separare delicatamente le ghiandole salivari per esporre i muscoli tracheali e utilizzare forcep seghettate leggermente curve per allontanare delicatamente i muscoli paratracheali.
Prendere in giro la fascia che circonda la trachea fino a quando gli anelli cartilaginei della trachea sono completamente esposti e utilizzare forcelle seghettate completamente curve per lavorare via il tessuto connettivo tra la retrotrachea e la retrofascia. Far scorrere le forcep seghettate completamente curve dietro la trachea e sollevare la trachea. Una volta che la punta delle forcep è dietro la trachea, afferrare un pezzo da 10 a 15 centimetri di sutura di seta intrecciata 4-0 con le punte delle forcep e tirare la sutura dietro la trachea in modo che ci sia una lunghezza uniforme su entrambi i lati.
La tavola chirurgica può essere girata per avvicinare l'area chirurgica alla mano dominante per i passaggi successivi. Quindi tirare delicatamente le estremità della sutura verso la parte anteriore del mouse e tenere le estremità in posizione. Per la cannulazione del bronco del mainstem sinistro, esporre l'ago di un angiocatetere da 24 calibri da 3/4 pollici e inserire il lato smussato dell'ago nella regione interna della trachea tra il primo e il secondo anello tracheale.
Quando la punta dell'ago può essere visualizzato all'interno del lume tracheale, rilasciare la sutura e far avanzare la cannula sopra l'ago nella trachea che penzola verso il lato posteriore sinistro del mouse. Quando si incontrano resistenze, ritirare l'ago. Una volta che la cannula è in posizione, afferrare saldamente la porta di iniezione per evitare che il catetere si sposti e fissare una punta in micropipetta P-200 all'interno della porta.
Quindi infondere 50 microlitri della soluzione acida normale filtrata 0.1 nel catetere, seguiti da un volume uguale di aria. Questo passaggio richiede una manipolazione precisa della cannula, mentre le vie aeree sono ostrute, e deve essere completato rapidamente e senza intoppi per ripristinare il corretto flusso d'aria e ridurre al minimo i danni alle vie aeree. Ritirare rapidamente il catetere e inclinare la tavola chirurgica con un angolo di 60 gradi.
Dopo 30 secondi, posare la tavola chirurgica piatta e rimuovere la sutura da dietro la trachea. Quindi utilizzare una sutura di seta intrecciata rivestita di cera 4-0 per chiudere l'incisione cutanea con due o tre punti. La lesione polmonare acuta derivante dall'instillazione dell'acido intrabronchiale coinvolge l'intero polmone sinistro.
Infatti, in seguito alla somministrazione endovenosa di colorante blu Evans e perfusione polmonare, il colorante viene rilevato solo all'interno del polmone sinistro. La quantificazione dell'estravasazione del colorante nel polmone sinistro è significativamente aumentata rispetto all'instillazione selettiva fittizia. I neutrofili interstiziali si accumulano nel polmone sinistro 24 ore dopo l'instillazione acida in contrasto con il polmone destro in cui si osservano pochi neutrofili interstiziali.
L'istologia polmonare rivela lesioni tissutali e infiammazione a livello dell'organo e cellulare con infiammazione essudativa 24 ore dopo la lesione, caratterizzata da marcato edema alveolare e infiltrazione neutrofila all'interno del polmone sinistro. Si noti che la mancanza di lesioni significative o l'afflusso di leucociti nel polmone destro di controllo illeso. 72 ore dopo l'infortunio l'edema e gli infiltrati cellulari sono sostanzialmente diminuiti rappresentando una fase essudativa risolutiva.
Come valutato dalla citometria del flusso, i neutrofili alveolari aumentano nel polmone sinistro 24 ore dopo la lesione iniziale e diminuiscono sostanzialmente a 48 e 72 ore. È importante visualizzare il catetere nella trachea prima di avanzare. Inclinare la cannula verso il bronco del mainstem sinistro durante l'inserimento e seguire l'instillazione acida con 50 microlitri d'aria.
L'analisi dei fluidi lavage broncoalveolari, l'istologia polmonare, la fenotipizzazione delle cellule immunitarie mediante citometria a flusso, l'imaging vivo del topo e il test della funzione polmonare possono essere eseguiti per valutare l'infiammazione e la risoluzione. Lo sviluppo di questo modello auto-limitato di lesione polmonare acuta ha permesso ai ricercatori di dare contributi significativi al campo della biologia della risoluzione. Ricorda che l'acido cloridrico concentrato è pericoloso e che dovrebbe essere maneggiato in una cappa chimica che indossa i dispositivi di protezione individuale appropriati.
