Name: isolation and in vitro culture of murine and human alveolar macrophages
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
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Ringraziamo Clare Prendergast per assistenza con il manoscritto di editing. DKN è supportato da una ricerca concedere (n. 2095) della Fondazione di Flinn e TM è supportato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN ha sviluppato i metodi, progettato lo studio e ha scritto il manoscritto; OM assistito con gli studi sugli animali e gli acquisti di campioni clinici; SB assistita con analisi cytometric di flusso e ordinamento delle cellule; TM sotto la supervisione degli studi e il manoscritto è esaminata.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) e Institutional Review Board (IRB) a San Giuseppe Hospital and Medical Center.
1. isolamento di AMs dal fluido murino lavaggio broncoalveolare (BAL)
<ol><li>Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.</li>
	<li>Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con prep tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.</li>
	<li>Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.</li>
	<li>Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.</li>
	<li>Iniettare 10 mL ghiacciata tamponato fosfato salino (PBS) nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Assorbire il flusso di sangue con tamponi di cotone assorbente. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e quindi sono pronti per il lavaggio.</li>
	<li>Delicatamente tagliare aperto la pelle e muscolo del collo per esporre le vie respiratorie. Asportare con cura i muscoli adiacenti, cartilagini e tessuti grassi senza danneggiare la trachea.</li>
	<li>Praticare una piccola incisione (< 2 mm) sulla trachea posteriore alla laringe. Questa incisione deve essere appena sufficiente per inserire un catetere nella mentre la trachea è ancora attaccata alla laringe. Inserire un catetere 22g 1-inch senza ago nella trachea verso i polmoni. Fissare il catetere con una sutura seta intrecciata (4-0; non assorbibili) con un nodo quadrato. Nota: Il catetere deve essere tagliata sulla base delle dimensioni del mouse. Cateteri estremamente brevi o lunghi tendono a fuoriuscire e/o strappare le vie respiratorie durante il lavaggio. Lunghezza catetere deve essere tale che, quando inserito completamente i resti di punta ben all'interno della trachea e non raggiungere i bronchi primari.</li>
	<li>Attaccare una siringa 1 mL riempita con gelida buffer di BAL (Ca2 + e Mg2 + gratis PBS + 1 mM acido etilendiamminotetracetico, EDTA) per il catetere e infondere lentamente il buffer nei polmoni. Questo si gonfia i polmoni. Tenere la siringa collegata al catetere per cinque secondi e quindi aspirare il fluido di lavaggio tirando delicatamente il pistone. Questo si sgonfierà i polmoni. Raccogliere il liquido in una provetta conica da 15 mL posizionato su ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere i passaggio 1.10 per nove volte di più e il fluido di lavaggio della piscina. Non superare 1 mL di tampone per ogni svuotamento, che può superare la capacità polmonare e portare alla sua rottura.</li>
	<li>Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO2 dal protocollo di IACUC approvato.</li>
	<li>Centrifugare il liquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL. Attenzione: Il pellet può essere molto piccolo, quindi prestare attenzione quando aspirare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule di BAL in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato siero bovino fetale (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM acido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)).</li>
	<li>Bloccare il grippaggio non specifico dell'anticorpo al ricevitore di Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme a fluorescenza meno uno (FMO) e single-macchia controlli11,25. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono dall'analisi di citometria a flusso di cella singola da software di analisi appropriato (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>AMs di isolare da una fluorescenza-attivato delle cellule sorter (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, sorta di AMs in 1 mL di tampone di lisi (Vedi Tabella materiali) completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.</li>
</ol>2. isolamento di AMs dal polmone del topo, cella singola sospensione
<ol><li>Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.</li>
	<li>Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.</li>
	<li>Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.</li>
	<li>Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.</li>
	<li>Iniettare 10 mL di PBS ghiacciata nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e sono pronti per il raccolto.</li>
	<li>Sezionare i polmoni da recidere la trachea, vasi sanguigni e legamenti in una provetta conica da 15 mL con 5 mL di freddo esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM). Mantenere il ghiaccio fino al passaggio successivo.</li>
	<li>Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO2 dal protocollo di IACUC approvato.</li>
	<li>Trasferire i polmoni irrorati in una piastra di coltura sterile e apirogeno 60 mm con 3 mL DMEM. Con l'aiuto del forcipe di dissezione tirarne fuori le vie respiratorie e altro materiale di tessuto polmonare non duro, se presente. Tritare il tessuto polmonare con un bisturi per < dimensione di 1 mm.</li>
	<li>Aggiungere 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL dnasi I, Miscelare pipettando e incubare a 37° C in un incubatore per 25 minuti. Mescolare delicatamente una volta pipettando dopo 10 minuti.</li>
	<li>Passare i polmoni dissociati attraverso un colino di cella µm 100 installato in una provetta conica da 50 mL. Utilizzare il retro di uno stantuffo dalla siringa da 1 mL per mash up del cellulare ciuffi sul filtro. Lavare il filtro con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugare a 500 x g a 4 ° C per 5 minuti. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.12 e 2.13 due volte, cambiando il filtro e il tubo ogni volta. Pre-ammollo il filtro nel tampone di lavaggio per più di cinque minuti aumenta il rendimento di AM. Preparare la sospensione unicellulare aggiungendo 100 μL flusso/ordinamento buffer per il pellet cellulare.</li>
	<li>Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme a FMO e singolo-macchia controlli11,25. Valutare il polmone cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.</li>
	<li>AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, è possibile ordinare AMs in 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.</li>
</ol>3. isolamento di AMs da umano liquido di BAL
<ol><li>Organizzare il trasferimento del fluido BAL umano dalla clinica al laboratorio a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugare il liquido di BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL11.</li>
	<li>Lavare la pallina con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA) e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti.</li>
	<li>Risospendere le cellule di BAL sono in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).</li>
	<li>Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo umana Fc blocco (clone di Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme FMO e singolo-macchia controlli11,24. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.</li>
	<li>AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel terreno di coltura umana AM da 1 mL o 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo.</li>
</ol>4. in vitro cultura di AMs
<ol><li>In seguito l'ordinamento delle cellule, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 250 x g a 4 ° C per 10 min.</li>
	<li>Risospendere umano AMs in 1ml terreno di coltura umana AM [Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di fattore (M-CSF), una concentrazione finale di 100 U/mL di stimolazione della Colonia del macrofago), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM acido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicillina/streptomicina (facoltativa)]. Allo stesso modo, risospendere mouse AMs in 1ml mouse AM terreno di coltura [DMEM completati con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di M-CSF, una concentrazione finale di 100 U/mL), 1 mM sodio piruvato, 10 mM HEPES e 1x penicillina/streptomicina (opzionale )].</li>
	<li>Enumerare il trypan blu-escludendo cellule vitali di un contatore di cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali a 1 x 106/ml. Nota: Idealmente, fino a 5 x 105 AMs può essere isolato dal liquido di BAL raccolto da un topo maschio di 8-10 settimane vecchio C57BL/6. La resa di AM dal digest di polmone del mouse è variabile e può essere leggermente inferiore a quella del fluido del mouse BAL. Rendimento AM da umano liquido di BAL dipende dal volume di liquido di BAL, il volume totale di soluzione salina utilizzata per il lavaggio e condizioni cliniche del paziente.</li>
	<li>Basato sul rendimento e sulla necessità sperimentali, seme le cellule in camera diapositive, piastre di coltura o matracci di cultura. Idealmente, seme l'AMs a 1 x 105/ml con 10 mL di terreno in un matraccio di cultura del tessuto T25.</li>
	<li>Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 ambiente. Nota: AMs crescerà come cellule aderenti e sono estremamente a crescita lenta (tempo di raddoppiamento > 7 giorni).</li>
	<li>24 ore post-semina, AMs deve essere aderente e non verranno disconnessi da un delicato cambiamento del terreno di coltura. Rimuovere il supporto dall'aspirazione da un'estremità e saziatevi con medium fresco pre-riscaldato a 37 ° C. Nota: Le cellule possono ora utilizzabile per valutare la fisiologia AM o gli effetti di stimoli. AMs cresciuto nelle diapositive di camera può essere convenientemente macchiato con gli anticorpi adatti e sono ideali per la visualizzazione al microscopio. Per la valutazione cytometric di flusso, AMs vengono raccolte tramite incubazione con non-enzimatica delle cellule dissociazione della soluzione.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura e aggiungere dissociazione soluzione abbastanza per coprire la superficie di cultura (circa 2 mL per fiaschetta T25) e incubare a 37 ° C per 5-10 minuti. Non raschiare sarà necessario, e non è consigliabile per raschiare le cellule meccanicamente. Picchiettare delicatamente i lati, aggiungere 1-2 mL di buffer di flusso/ordinamento e pipettare delicatamente su e giù per staccare la maggior parte delle cellule aderenti.</li>
	<li>Per gli studi di RNA, lisare le cellule direttamente sulla piastra di coltura con l'aggiunta di tampone di lisi.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity.">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction.">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection.">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients.">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li><li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood,+bronchoalveolar+lavage,+and+lung+tissues.">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.

AMs sono longevi polmone residenti macrofagi che popolano i polmoni inizia alla nascita e sopportando sopra l' intero ciclo di vita26. Loro ruolo nella fisiologia polmonare7 e patologia12 e il loro potenziale di prevedere di autoimmunità polmonare24 è stati riconosciuti. Perché AMs hanno una presenza a lungo termine in polmoni11,27 e perché sono coinvolti nell'atti...

Il microambiente polmonare è un ecosistema complesso in modo univoco con un condotto dell'aria elaborata e sistema vascolare. L'aria inalata viaggia attraverso la trachea e numerosi rami di bronchi e bronchioli prima di raggiungere gli alveoli, dove avviene lo scambio di gas del sangue-aria. A causa del contatto diretto con l'atmosfera, la superficie respiratoria richiede protezione dagli effetti potenzialmente nocivi delle particelle e sostanze inquinanti. Un numero di barriere fisiche, chimiche e immunologiche protegge i polmoni. In particolare, la distribuzione dei fagociti in superficie respiratoria serve un sistema di difesa di prima linea importante. I macrofagi alveolari (ma) sono un tipo di polmone-residente fagociti, e che costituiscono la stragrande maggioranza della piscina del macrofago polmonare. Come suggerisce il nome, AMs sono principalmente localizzati al lume del alveolare e si presentano come cellule sessile che costantemente assaggiare l'atmosfera ambiente e comunicano con l' epitelio alveolare1. In stato stazionario polmoni, oltre il 95% dei fagociti nello spazio alveolare sono AMs2, cui composizione può alterare a causa di infiammazione, infezione o l'esposizione cronica alle sostanze inquinanti.
AMs è partecipare a una vasta gamma di funzioni che possono essere locali ai polmoni e/o di importanza sistemica. Ad esempio, AMs sono essenziali per lo sviluppo e il funzionamento ottimale dei polmoni; sorveglianza immune; e liquidazione dei detriti cellulari, invadendo gli agenti patogeni e particelle inalate3,4,5,6,7. Lo svuotamento mirato di AMs è conosciuto per alterare la clearance del virus respiratori e batteri4,8. Oltre il loro ruolo di fagociti e un difensori di prima linea dell'omeostasi polmonare, AMs sono noti per funzionare come cellule presentanti l'antigene in suscitamento T delle cellule dell'immunità9, rafforza l'efficacia del vaccino intranasale10 e influenzare autoimmunità polmone-limitati dopo trapianto del polmone11,12. Carenza nella funzione di AM è stata collegata a proteinosi alveolare polmonare (PAP), una circostanza derivando da una mutazione genetica, la malignità o l'infezione che altera la clearance di surfattanti polmonari13,14. Trapianto di AMs è ora in fase di studio come un approccio terapeutico per il trattamento di PAP 15,16.
AMs sono noti per provenire durante l'embriogenesi e persistono nei polmoni per tutta la vita senza essere sostituiti facendo circolare i leucociti2,17. Sebbene, fatturato AM è rilevabile nei polmoni omeostatici, diversi livelli di fatturato AM sono stati segnalati in determinate condizioni cliniche compresa l'infezione da influenza virus4, myeloablative irradiazione18, esposizione all'endotossina 19e20di vecchiaia. AMs sono creduti per auto-rinnovarsi tramite un basso grado di proliferazione17,21, ma alcuni studi recenti sostengono che i monociti possono dar luogo ad una popolazione di intravascolare polmonare macrofagi22,23 sotto condizioni sperimentali, ma la funzionalità di questi macrofagi polmonari appena convertiti devono ancora essere definiti nelle malattie polmonari. Inoltre, comprendere la soglia di stimolo nel contesto di attivazione è una zona potenzialmente interessante, come il polmone tenta di mantenere un equilibrio tra segnali infiammatori ed il macchinario immunoregulatory.
Le alterazioni fisiologiche o patologiche che portano alla perdita della regolazione immune sono importanti per valutare in varie regolazioni cliniche (ad es., infezioni respiratorie, malattie infiammatorie polmonari e malattia polmonare fibrotica). Tuttavia, AMs sono sempre più riconosciuti come indicatori o anche determinanti di salute polmonare11,24. Attualmente, non esistono Nessun protocollo unificato disponibile per la raccolta, la caratterizzazione, e/o mantenimento AMs da esseri umani e preclinici modelli murini. Mancanza di un consenso sui precursori AM e fenotipi e l'assenza di una metodologia dettagliata era stato l'ostacolo importante nel decifrare uno o più ruoli di AM in malattia e salute polmonare. Il seguente protocollo offre una definitiva identificazione, isolamento e in vitro cultura strategia che permette di avanzare la comprensione del comportamento di AM e facilitare AM-mirati studi diagnostici e terapeutici.

<table><tbody><tr><td>Non-enzymatic cell dissociating solution</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Catheter&amp;nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Non-absorbable silk braided suture&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&amp;nbsp; (Ketathesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&amp;nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>L-929 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC,&amp;nbsp;CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Tissue culture flask</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>60 mm culture dish&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa cell analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Analysis Software</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clone OX-62, BV650 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clone 927, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clone SA011F11, BV785 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Human)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Human)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td></tr></tbody></table>

isolation and in vitro culture of murine and human alveolar macrophages

I macrofagi alveolari sono macrofagi terminalmente differenziati, polmone-residente di origine prenatale. I macrofagi alveolari sono unici nella loro lunga vita e il loro importante ruolo nello sviluppo polmonare e funzione, come pure le loro risposte del polmone localizzato all'infezione ed infiammazione. Ad oggi, non esiste alcun metodo unificato per la gestione dei macrofagi alveolari da esseri umani e topi, isolamento e identificazione. Tale metodo è necessario per gli studi su questi importanti cellule immuni innate nei diversi contesti sperimentali. Il metodo descritto qui, che può facilmente essere adottato da qualsiasi laboratorio, è un approccio semplificato alla raccolta macrofagi alveolari dal fluido di lavaggio broncoalveolare o dal tessuto polmonare e il loro mantenimento in vitro. Poiché i macrofagi alveolari si verificano principalmente come cellule aderenti negli alveoli, il focus di questo metodo è il loro sloggiare prima del raccolto e l'identificazione. Il polmone è un organo altamente vascolarizzato, e vari tipi di cellule di origine mieloide e linfoide abitano, interagiscono e sono influenzati da microambiente polmonare. Utilizzando il set di marcatori di superficie descritto qui, ricercatori possono senza ambiguità e facilmente distinguere macrofagi alveolari da altri leucociti e li purifica per applicazioni a valle. Il metodo di coltura sviluppato nel presente documento supporta sia umane e macrofagi alveolari per la crescita in vitro il mouse ed è compatibile con studi molecolari e cellulari.

L'approccio di cytometric di flusso ad identificare mouse AMs è illustrato nella Figura 1. Questo include l'analisi di un insieme minimo di indicatori della superficie necessari nella distinzione AMs da altri fagociti residenti del polmone o del polmone-infiltrazione. Analisi differenziale è necessaria per identificare positivamente AMs da interstiziali macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, monociti e macrofagi polmonari monocito-derivato che si verif...

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Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

23.5K Views.  St. Joseph's Hospital and Medical Center. La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Bioingegneria

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

Isolamento di sottoinsiemi di macrofaschi e cellule stromali da esemplari di miocardio umano e topo

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolamento e coltura di macrofagi cardiaci residenti dal nodo senoatriale e atrioventricolare murino

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Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

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