Ringraziamo Clare Prendergast per assistenza con il manoscritto di editing. DKN è supportato da una ricerca concedere (n. 2095) della Fondazione di Flinn e TM è supportato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN ha sviluppato i metodi, progettato lo studio e ha scritto il manoscritto; OM assistito con gli studi sugli animali e gli acquisti di campioni clinici; SB assistita con analisi cytometric di flusso e ordinamento delle cellule; TM sotto la supervisione degli studi e il manoscritto è esaminata.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) e Institutional Review Board (IRB) a San Giuseppe Hospital and Medical Center.
1. isolamento di AMs dal fluido murino lavaggio broncoalveolare (BAL)
<ol><li>Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.</li>
	<li>Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con prep tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.</li>
	<li>Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.</li>
	<li>Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.</li>
	<li>Iniettare 10 mL ghiacciata tamponato fosfato salino (PBS) nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Assorbire il flusso di sangue con tamponi di cotone assorbente. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e quindi sono pronti per il lavaggio.</li>
	<li>Delicatamente tagliare aperto la pelle e muscolo del collo per esporre le vie respiratorie. Asportare con cura i muscoli adiacenti, cartilagini e tessuti grassi senza danneggiare la trachea.</li>
	<li>Praticare una piccola incisione (< 2 mm) sulla trachea posteriore alla laringe. Questa incisione deve essere appena sufficiente per inserire un catetere nella mentre la trachea è ancora attaccata alla laringe. Inserire un catetere 22g 1-inch senza ago nella trachea verso i polmoni. Fissare il catetere con una sutura seta intrecciata (4-0; non assorbibili) con un nodo quadrato. Nota: Il catetere deve essere tagliata sulla base delle dimensioni del mouse. Cateteri estremamente brevi o lunghi tendono a fuoriuscire e/o strappare le vie respiratorie durante il lavaggio. Lunghezza catetere deve essere tale che, quando inserito completamente i resti di punta ben all'interno della trachea e non raggiungere i bronchi primari.</li>
	<li>Attaccare una siringa 1 mL riempita con gelida buffer di BAL (Ca2 + e Mg2 + gratis PBS + 1 mM acido etilendiamminotetracetico, EDTA) per il catetere e infondere lentamente il buffer nei polmoni. Questo si gonfia i polmoni. Tenere la siringa collegata al catetere per cinque secondi e quindi aspirare il fluido di lavaggio tirando delicatamente il pistone. Questo si sgonfierà i polmoni. Raccogliere il liquido in una provetta conica da 15 mL posizionato su ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere i passaggio 1.10 per nove volte di più e il fluido di lavaggio della piscina. Non superare 1 mL di tampone per ogni svuotamento, che può superare la capacità polmonare e portare alla sua rottura.</li>
	<li>Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO2 dal protocollo di IACUC approvato.</li>
	<li>Centrifugare il liquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL. Attenzione: Il pellet può essere molto piccolo, quindi prestare attenzione quando aspirare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule di BAL in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato siero bovino fetale (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM acido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)).</li>
	<li>Bloccare il grippaggio non specifico dell'anticorpo al ricevitore di Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme a fluorescenza meno uno (FMO) e single-macchia controlli11,25. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono dall'analisi di citometria a flusso di cella singola da software di analisi appropriato (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>AMs di isolare da una fluorescenza-attivato delle cellule sorter (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, sorta di AMs in 1 mL di tampone di lisi (Vedi Tabella materiali) completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.</li>
</ol>2. isolamento di AMs dal polmone del topo, cella singola sospensione
<ol><li>Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.</li>
	<li>Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.</li>
	<li>Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.</li>
	<li>Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.</li>
	<li>Iniettare 10 mL di PBS ghiacciata nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e sono pronti per il raccolto.</li>
	<li>Sezionare i polmoni da recidere la trachea, vasi sanguigni e legamenti in una provetta conica da 15 mL con 5 mL di freddo esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM). Mantenere il ghiaccio fino al passaggio successivo.</li>
	<li>Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO2 dal protocollo di IACUC approvato.</li>
	<li>Trasferire i polmoni irrorati in una piastra di coltura sterile e apirogeno 60 mm con 3 mL DMEM. Con l'aiuto del forcipe di dissezione tirarne fuori le vie respiratorie e altro materiale di tessuto polmonare non duro, se presente. Tritare il tessuto polmonare con un bisturi per < dimensione di 1 mm.</li>
	<li>Aggiungere 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL dnasi I, Miscelare pipettando e incubare a 37° C in un incubatore per 25 minuti. Mescolare delicatamente una volta pipettando dopo 10 minuti.</li>
	<li>Passare i polmoni dissociati attraverso un colino di cella µm 100 installato in una provetta conica da 50 mL. Utilizzare il retro di uno stantuffo dalla siringa da 1 mL per mash up del cellulare ciuffi sul filtro. Lavare il filtro con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugare a 500 x g a 4 ° C per 5 minuti. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.12 e 2.13 due volte, cambiando il filtro e il tubo ogni volta. Pre-ammollo il filtro nel tampone di lavaggio per più di cinque minuti aumenta il rendimento di AM. Preparare la sospensione unicellulare aggiungendo 100 μL flusso/ordinamento buffer per il pellet cellulare.</li>
	<li>Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme a FMO e singolo-macchia controlli11,25. Valutare il polmone cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.</li>
	<li>AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, è possibile ordinare AMs in 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.</li>
</ol>3. isolamento di AMs da umano liquido di BAL
<ol><li>Organizzare il trasferimento del fluido BAL umano dalla clinica al laboratorio a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugare il liquido di BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL11.</li>
	<li>Lavare la pallina con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA) e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti.</li>
	<li>Risospendere le cellule di BAL sono in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).</li>
	<li>Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo umana Fc blocco (clone di Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme FMO e singolo-macchia controlli11,24. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.</li>
	<li>AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel terreno di coltura umana AM da 1 mL o 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo.</li>
</ol>4. in vitro cultura di AMs
<ol><li>In seguito l'ordinamento delle cellule, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 250 x g a 4 ° C per 10 min.</li>
	<li>Risospendere umano AMs in 1ml terreno di coltura umana AM [Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di fattore (M-CSF), una concentrazione finale di 100 U/mL di stimolazione della Colonia del macrofago), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM acido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicillina/streptomicina (facoltativa)]. Allo stesso modo, risospendere mouse AMs in 1ml mouse AM terreno di coltura [DMEM completati con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di M-CSF, una concentrazione finale di 100 U/mL), 1 mM sodio piruvato, 10 mM HEPES e 1x penicillina/streptomicina (opzionale )].</li>
	<li>Enumerare il trypan blu-escludendo cellule vitali di un contatore di cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali a 1 x 106/ml. Nota: Idealmente, fino a 5 x 105 AMs può essere isolato dal liquido di BAL raccolto da un topo maschio di 8-10 settimane vecchio C57BL/6. La resa di AM dal digest di polmone del mouse è variabile e può essere leggermente inferiore a quella del fluido del mouse BAL. Rendimento AM da umano liquido di BAL dipende dal volume di liquido di BAL, il volume totale di soluzione salina utilizzata per il lavaggio e condizioni cliniche del paziente.</li>
	<li>Basato sul rendimento e sulla necessità sperimentali, seme le cellule in camera diapositive, piastre di coltura o matracci di cultura. Idealmente, seme l'AMs a 1 x 105/ml con 10 mL di terreno in un matraccio di cultura del tessuto T25.</li>
	<li>Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 ambiente. Nota: AMs crescerà come cellule aderenti e sono estremamente a crescita lenta (tempo di raddoppiamento > 7 giorni).</li>
	<li>24 ore post-semina, AMs deve essere aderente e non verranno disconnessi da un delicato cambiamento del terreno di coltura. Rimuovere il supporto dall'aspirazione da un'estremità e saziatevi con medium fresco pre-riscaldato a 37 ° C. Nota: Le cellule possono ora utilizzabile per valutare la fisiologia AM o gli effetti di stimoli. AMs cresciuto nelle diapositive di camera può essere convenientemente macchiato con gli anticorpi adatti e sono ideali per la visualizzazione al microscopio. Per la valutazione cytometric di flusso, AMs vengono raccolte tramite incubazione con non-enzimatica delle cellule dissociazione della soluzione.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura e aggiungere dissociazione soluzione abbastanza per coprire la superficie di cultura (circa 2 mL per fiaschetta T25) e incubare a 37 ° C per 5-10 minuti. Non raschiare sarà necessario, e non è consigliabile per raschiare le cellule meccanicamente. Picchiettare delicatamente i lati, aggiungere 1-2 mL di buffer di flusso/ordinamento e pipettare delicatamente su e giù per staccare la maggior parte delle cellule aderenti.</li>
	<li>Per gli studi di RNA, lisare le cellule direttamente sulla piastra di coltura con l'aggiunta di tampone di lisi.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity.">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells.">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).</li><li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections.">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li><li>MacLean, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequestration+of+inhaled+particulate+antigens+by+lung+phagocytes.+A+mechanism+for+the+effective+inhibition+of+pulmonary+cell-mediated+immunity.">Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung.">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection.">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).</li><li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development.">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li><li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease.">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li><li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses.">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li><li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection:+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha,+T+helper+1/T+helper+2+cytokines,+IgG+subclasses,+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation.">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li><li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li><li>Greenhill, S. R., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+alveolar+proteinosis:+a+bench-to-bedside+story+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+dysfunction.">Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction.</a> Chest. 136 (2), 571-577 (2009).</li><li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy.">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li><li>Hashimoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+self-maintain+locally+throughout+adult+life+with+minimal+contribution+from+circulating+monocytes.">Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes.</a> Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).</li><li>Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prolonged+life-span+of+alveolar+macrophages.">The prolonged life-span of alveolar macrophages.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).</li><li>Maus, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+alveolar+macrophages+are+replaced+by+recruited+monocytes+in+response+to+endotoxin-induced+lung+inflammation.">Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).</li><li>Perdiguero, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung.">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction.">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection.">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients.">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li><li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood,+bronchoalveolar+lavage,+and+lung+tissues.">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.

AMs sono longevi polmone residenti macrofagi che popolano i polmoni inizia alla nascita e sopportando sopra l' intero ciclo di vita26. Loro ruolo nella fisiologia polmonare7 e patologia12 e il loro potenziale di prevedere di autoimmunità polmonare24 è stati riconosciuti. Perché AMs hanno una presenza a lungo termine in polmoni11,27 e perché sono coinvolti nell'atti...

Il microambiente polmonare è un ecosistema complesso in modo univoco con un condotto dell'aria elaborata e sistema vascolare. L'aria inalata viaggia attraverso la trachea e numerosi rami di bronchi e bronchioli prima di raggiungere gli alveoli, dove avviene lo scambio di gas del sangue-aria. A causa del contatto diretto con l'atmosfera, la superficie respiratoria richiede protezione dagli effetti potenzialmente nocivi delle particelle e sostanze inquinanti. Un numero di barriere fisiche, chimiche e immunologiche protegge i polmoni. In particolare, la distribuzione dei fagociti in superficie respiratoria serve un sistema di difesa di prima linea importante. I macrofagi alveolari (ma) sono un tipo di polmone-residente fagociti, e che costituiscono la stragrande maggioranza della piscina del macrofago polmonare. Come suggerisce il nome, AMs sono principalmente localizzati al lume del alveolare e si presentano come cellule sessile che costantemente assaggiare l'atmosfera ambiente e comunicano con l' epitelio alveolare1. In stato stazionario polmoni, oltre il 95% dei fagociti nello spazio alveolare sono AMs2, cui composizione può alterare a causa di infiammazione, infezione o l'esposizione cronica alle sostanze inquinanti.
AMs è partecipare a una vasta gamma di funzioni che possono essere locali ai polmoni e/o di importanza sistemica. Ad esempio, AMs sono essenziali per lo sviluppo e il funzionamento ottimale dei polmoni; sorveglianza immune; e liquidazione dei detriti cellulari, invadendo gli agenti patogeni e particelle inalate3,4,5,6,7. Lo svuotamento mirato di AMs è conosciuto per alterare la clearance del virus respiratori e batteri4,8. Oltre il loro ruolo di fagociti e un difensori di prima linea dell'omeostasi polmonare, AMs sono noti per funzionare come cellule presentanti l'antigene in suscitamento T delle cellule dell'immunità9, rafforza l'efficacia del vaccino intranasale10 e influenzare autoimmunità polmone-limitati dopo trapianto del polmone11,12. Carenza nella funzione di AM è stata collegata a proteinosi alveolare polmonare (PAP), una circostanza derivando da una mutazione genetica, la malignità o l'infezione che altera la clearance di surfattanti polmonari13,14. Trapianto di AMs è ora in fase di studio come un approccio terapeutico per il trattamento di PAP 15,16.
AMs sono noti per provenire durante l'embriogenesi e persistono nei polmoni per tutta la vita senza essere sostituiti facendo circolare i leucociti2,17. Sebbene, fatturato AM è rilevabile nei polmoni omeostatici, diversi livelli di fatturato AM sono stati segnalati in determinate condizioni cliniche compresa l'infezione da influenza virus4, myeloablative irradiazione18, esposizione all'endotossina 19e20di vecchiaia. AMs sono creduti per auto-rinnovarsi tramite un basso grado di proliferazione17,21, ma alcuni studi recenti sostengono che i monociti possono dar luogo ad una popolazione di intravascolare polmonare macrofagi22,23 sotto condizioni sperimentali, ma la funzionalità di questi macrofagi polmonari appena convertiti devono ancora essere definiti nelle malattie polmonari. Inoltre, comprendere la soglia di stimolo nel contesto di attivazione è una zona potenzialmente interessante, come il polmone tenta di mantenere un equilibrio tra segnali infiammatori ed il macchinario immunoregulatory.
Le alterazioni fisiologiche o patologiche che portano alla perdita della regolazione immune sono importanti per valutare in varie regolazioni cliniche (ad es., infezioni respiratorie, malattie infiammatorie polmonari e malattia polmonare fibrotica). Tuttavia, AMs sono sempre più riconosciuti come indicatori o anche determinanti di salute polmonare11,24. Attualmente, non esistono Nessun protocollo unificato disponibile per la raccolta, la caratterizzazione, e/o mantenimento AMs da esseri umani e preclinici modelli murini. Mancanza di un consenso sui precursori AM e fenotipi e l'assenza di una metodologia dettagliata era stato l'ostacolo importante nel decifrare uno o più ruoli di AM in malattia e salute polmonare. Il seguente protocollo offre una definitiva identificazione, isolamento e in vitro cultura strategia che permette di avanzare la comprensione del comportamento di AM e facilitare AM-mirati studi diagnostici e terapeutici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="910">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Non-enzymatic cell dissociating solution</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:220px;">C5789</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puralube Vet Ointment</td>
			<td style="width:223px;">Dechra</td>
			<td>620300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22G Catheter&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Terumo Medical Products</td>
			<td>SR-OX2225CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Non-absorbable silk braided suture&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Kent Scientific</td>
			<td>SUT-15-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Fc block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAria II cell sorter&#160;</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:220px;">644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine&#160; (Ketathesia)</td>
			<td style="width:223px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:220px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine&#160; (AnaSed)</td>
			<td style="width:223px;">Akorn</td>
			<td style="width:220px;">139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">10-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liberase TL&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:220px;">5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100&#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Human Fc block</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">HEPES</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">L-929 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC,&#160;CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm culture dish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>CLS3261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">15 mL Conical tube&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">50 mL Conical tube&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">FlowJo</td>
			<td style="width:223px;">FlowJo</td>
			<td>v10.4</td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD45 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>147709</td>
			<td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11b (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11c (Mouse)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565452</td>
			<td>Clone N418, BV 421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-I-Ab (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>116420</td>
			<td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Siglec-F (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Siglec-H (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>129605</td>
			<td>Clone 551, PE conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-F4/80 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>123118</td>
			<td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Ly-6C (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>128035</td>
			<td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD64 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>139311</td>
			<td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD24 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>563115</td>
			<td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD103 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>745305</td>
			<td>Clone OX-62, BV650 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD317 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>127015</td>
			<td>Clone 927, APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CXCR1 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>149029</td>
			<td>Clone SA011F11, BV785 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD45 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>304017</td>
			<td>Clone HI30, AF488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11b (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-HLA-DR (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>307618</td>
			<td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD169 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>346008</td>
			<td>Clone 7-239, APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD206 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>321106</td>
			<td>Clone 15-2, PE conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD163 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>333612</td>
			<td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and in vitro culture of murine and human alveolar macrophages

I macrofagi alveolari sono macrofagi terminalmente differenziati, polmone-residente di origine prenatale. I macrofagi alveolari sono unici nella loro lunga vita e il loro importante ruolo nello sviluppo polmonare e funzione, come pure le loro risposte del polmone localizzato all'infezione ed infiammazione. Ad oggi, non esiste alcun metodo unificato per la gestione dei macrofagi alveolari da esseri umani e topi, isolamento e identificazione. Tale metodo è necessario per gli studi su questi importanti cellule immuni innate nei diversi contesti sperimentali. Il metodo descritto qui, che può facilmente essere adottato da qualsiasi laboratorio, è un approccio semplificato alla raccolta macrofagi alveolari dal fluido di lavaggio broncoalveolare o dal tessuto polmonare e il loro mantenimento in vitro. Poiché i macrofagi alveolari si verificano principalmente come cellule aderenti negli alveoli, il focus di questo metodo è il loro sloggiare prima del raccolto e l'identificazione. Il polmone è un organo altamente vascolarizzato, e vari tipi di cellule di origine mieloide e linfoide abitano, interagiscono e sono influenzati da microambiente polmonare. Utilizzando il set di marcatori di superficie descritto qui, ricercatori possono senza ambiguità e facilmente distinguere macrofagi alveolari da altri leucociti e li purifica per applicazioni a valle. Il metodo di coltura sviluppato nel presente documento supporta sia umane e macrofagi alveolari per la crescita in vitro il mouse ed è compatibile con studi molecolari e cellulari.

L'approccio di cytometric di flusso ad identificare mouse AMs è illustrato nella Figura 1. Questo include l'analisi di un insieme minimo di indicatori della superficie necessari nella distinzione AMs da altri fagociti residenti del polmone o del polmone-infiltrazione. Analisi differenziale è necessaria per identificare positivamente AMs da interstiziali macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, monociti e macrofagi polmonari monocito-derivato che si verif...

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Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

23.4K Views.  St. Joseph's Hospital and Medical Center. La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

Video: Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Isolamento linfociti T umani, la cultura e l&#39;analisi delle migrazioni In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Istituzione di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In umani THP-1 macrofagi

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

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Isolamento linfociti T umani, la cultura e l'analisi delle migrazioni In Vitro