Vorremmo ringraziare i finanziamenti del National Institutes of Health (R15-03 GM065444 a LB) e il programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health (NIH) e l&#39;Istituto Nazionale del Diabete e digestivi e malattie del rene (KO). Un premio NSF (DBI-0923402) finanziato l&#39;acquisto del microscopio confocale LSM700. Vorremmo inoltre ringraziare l&#39;assistenza generale e utili commenti sul manoscritto del Dr. Andy d&#39;Oro. Merito va a tutta la C. elegans comunità per la condivisione di risorse, i protocolli e le idee.

1. Nematode culture <ol><li> Ottenere l&#39;appropriato C. elegans ceppo dal Genetics Caenorhabditis archivi Center (CGC) o da un collega. </li><li> Nematodi crescere su piastre di agar NGM seminato con prato OP50 batterica (3). Per l&#39;analisi della crescita GFP ceppi a 25 ° C è raccomandato. </li><li> Il giorno prima l&#39;esperimento microscopia, raccogliere almeno 40 L4 su piastre seminate e posizionare le piastre a 25 ° C durante la notte. Questi worm saranno giovani adulti per l&#39;esperimento. </li></ol> 2. Iniezioni Se è auspicabile per visualizzare le strutture come i lisosomi e dei mitocondri, gli adulti possono essere iniettati con colorante fluorescente prima della visualizzazione. <ol><li> Preparare secca pastiglie iniezione agarosio. (Questo può essere fatto da uno a molti giorni prima) <ol><li> Preparare fuso agarosio al 2% in acqua. Con una pipetta Pasteur mettere 2 gocce su un vetrino coprioggetti 22X54 millimetri. Posto un altro coprioggetti trasversale sulla parte superiore della goccia. Al fine di raggiungere lo spessore giusto, premere sul coprioggetti superiore fino al diametro del pad è di circa 1,5 cm. Lasciate riposare per 5-10 minuti. </li><li> Rimuovere coprioggetti superiore. Disidratare il pad agarosio mettendolo in un forno a 80 ° C per 1 ora o consentire di sedersi sul banco durante la notte. </li></ol></li><li> Preparare Mitotracker o soluzione Lysotracker. <ol><li> Diluire l&#39;agente fluorescente nel tampone Egg. Noi di solito utilizzare una diluizione 1:10 di Mitotracker o Lysotracker. </li><li> L&#39;ago d&#39;iniezione è costituito da un vetro 1,2 OD capillare. Tirare l&#39;ago di iniezione con un estrattore ago. </li><li> Utilizzare una pipetta Pastuer tirato a riempire di nuovo l&#39;ago con il colorante diluito. </li><li> L&#39;ago posto in una luce-free, camera umidificata fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Pre-Iniezione: Impostazione del microscopio e ago. <ol><li> Monte ago per l&#39;iniezione su apparati di iniezione. Il nostro apparato è un disco diretto micromanipolatore Narishige montato sul palco di un microscopio invertito Nikon TE200 dotato di capacità di imaging DIC. </li><li> Collegare l&#39;ago in una provetta da 1,2 millimetri ID che è collegato al regolatore di pressione. Sia aria compressa o azoto può essere utilizzato come una sorgente di pressione esterna. Impostare il regolatore a 20-25 psi. </li><li> Mettere 2 gocce di olio minerale pesante (olio di paraffina) sul pad iniezione. </li><li> Posizionare il pad iniezione sul microscopio e abbassare l&#39;ago nel petrolio. Controllare che il fluido che liberamente dall&#39;ago quando la pressione è applicata. Applicare una pressione di iniezione e osservare se esce del liquido l&#39;ago. In caso contrario, sarà necessario rompere delicatamente la fine dell&#39;ago. L&#39;ago può essere rotto con delicatezza la punta di guida in un piccolo pezzo di coprioggetti rotto immessi sul pad di iniezione. Dopo che l&#39;ago è scorrevole, passare alla fase successiva. </li></ol></li><li> Iniezione. <ol><li> Circa 1 ora prima di embrioni di visualizzazione, il trasferimento di vermi adulti giovani nella goccia di olio sulla rampa di iniezione. Effettuare questo trasferimento usando il microscopio da dissezione. Utilizzare un filo di platino raccogliere verme con una punta per il trasferimento di vermi. </li><li> Disporre 3-10 vermi in modo che essi giacciono direttamente sul pad. Per l&#39;iniezione, è più facile se i vermi sono allineati parallelamente l&#39;uno all&#39;altro e un po &#39;meno di un verme lunghezza di distanza. Una volta che i vermi sono sulla rampa di iniezione è importante lavorare velocemente e completare il processo di iniezione prima che i vermi muoiono di disidratazione. </li><li> Posizionare il coprioggetti con i vermi sul palco microscopio del microscopio iniezione. Messa a fuoco nella parte centrale (rachide) del tubo gonade distale. Quindi utilizzare il micromanipolatore per spostare la punta dell&#39;ago nello stesso piano focale. Spostare lo stadio orizzontalmente in modo che il worm viene forato con l&#39;ago. Una volta che la punta dell&#39;ago è all&#39;interno del rachide, applicare la pressione e consentire la gonade da riempire con il composto colorante. Iniettare entrambe le braccia gonade di tutti i vermi sulla rampa di iniezione. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, usare una pipetta Pasteur tirato per fornire circa 0,5 ml di tampone Egg per i vermi. Questo li non morire di disidratazione e permettere loro di riprendersi dalla procedura di iniezione. </li><li> Lasciare che il worm di recuperare per 1-2 ore a temperatura ambiente in una luce priva di camera umidificata. </li></ol></li></ol> 3. Agarosio pad per la visualizzazione di embrioni <ol><li> Preparare fuso agarosio al 2% in tampone di Egg. </li><li> Con una pipetta Pasteur, mettere 3 gocce di fuso agarosio su un vetrino da microscopio pulito. </li><li> Scivolo tra due vetrini altri che hanno uno strato di etichettatura nastro che li copre. Queste servono come distanziatori che farà in modo che il vostro pad agarosio è lo spessore giusto. </li><li> Posizionare un vetrino da microscopio pulito secondo perpendicolarmente verso il basso sulla gocce agarosio. Premere verso il basso fino a far scorrere in alto poggia su nastro da diapositive guida. </li><li> Poco prima si è pronti per il montaggio degli embrioni per l&#39;osservazione, rimuovere la slitta superiore. </li></ol><ol><li> Se i vermi non sono state iniettate, seguire i due passaggi successivi. In caso contrario, li salta. <ol><li> Scegli vermi adulti giovani dalla piastra che è stato preparato il giorno prima. Dovreste essere in grado di vedere gli embrioni all&#39;interno gli adulti giovani. </li><li> Scegli 5-20 vermi su una piastra di NGM testa di serie. Lasciare i vermi a strisciare sul piatto testa di serie per alcuni minuti in modo che il worm perderà la maggior parte dei batteri che è attaccato a loro. </li></ol></li><li> Ottenere embrioni giovani vermi adulti <ol><li> Inserire una goccia 5-20 ml di tampone uovo nel mezzo di mm 18 2 coprioggetti vetro (uno spessore di 1,5 coprioggetti è preferibile). </li><li> Spostare i vermi dalla piastra di testa di serie o pad iniezione nel goccia di tampone Egg. </li><li> Tagliare worm apre con un ago ipodermico calibro 26. Taglio aperto il verme vicino alla vulva. Dovreste vedere embrioni fuoriuscita del worm. </li></ol></li><li> Montaggio su vetrino da microscopio <ol><li> Invertire il vetrino da microscopio che è stato preparato con il pad agarosio e abbassarlo sulla coprioggetti con embrioni. </li><li> Se il lasso di tempo prolungato è necessario, usare la vaselina per sigillare i bordi del coprioggetti per evitare essiccazione. </li></ol></li></ol> 5. Microscopia <ol><li> Trovare gli embrioni appropriato. <ol><li> Porre il vetrino sul microscopio palco. Scansione con obiettivo 10X per trovare gli embrioni. </li><li> Per trovare gli embrioni prima fase, la ricerca di embrioni che sono in procinto di completare la meiosi materna. Meiotico embrioni possono essere distinti dagli embrioni in seguito, perché non hanno subito un accorciamento. (Dopo che gli embrioni hanno completato la meiosi, si può vedere un divario significativo tra la membrana cellulare e il guscio d&#39;uovo alla fine anteriore.) </li><li> Una volta identificato un embrione opportunamente messo in scena, spostarsi in una lente di ingrandimento superiore per la registrazione di embriogenesi. </li></ol></li><li> Imaging <ol><li> In questo esempio, stiamo immaginando embrioni che esprimono la mCherry:: H2B e GFP:: Ub proteine ​​marcate. Stiamo usando il Zeiss LSM700 convenzionale microscopio a scansione laser. </li><li> Le immagini sono raccolti con la lente 63x 1.4NA. La 488 e 555 laser sono utilizzati con potenza laser minimo e massimo guadagno. Pila AZ vengono raccolti ogni 10-15 secondi. A seconda del grado di photobleaching, 30-60 punti di tempo sono raccolti. Immagini pila Z sono crollate in un&#39;immagine sporgenza massima per l&#39;ultimo time-lapse video. </li></ol></li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fecondazione a prima mitosi in C. elegans. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Procedura di microiniezione. Video supplementare 1 Time-lapse video della GFP:.. Blu ubiquitina più Lysotracker in un embrione meiotica <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">Clicca qui per visualizzare il video.</a>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Dopo la fusione con lo spermatozoo, lo zigote subisce una serie di eventi dinamici. Questi eventi trasformare l&#39;ovocita da una cella relativamente statico in un embrione in rapido sviluppo. In molti organismi, riarrangiamenti citoplasmatiche sono fondamentali per stabilire la polarità embrionale e per l&#39;attivazione uovo. Il C. embrione elegans rappresenta un&#39;opportunità eccellente per l&#39;osservazione di questi primi eventi di attivazione uovo e l&#39;embriogenesi. L&#39;embrione è trasparente e presto gli eventi si verificano in modo relativamente rapido sviluppo dopo la fecondazione. C. elegans ricercatori hanno generato molti ceppi utili transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti etichettati coinvolto nello sviluppo precoce. L&#39;utilizzo di questi ceppi con RNAi o mutanti fornisce un sistema potente per sezionare le vie molecolari che sono alla base dello sviluppo di un organismo multicellulare (5, 6, 7, 8). In questo articolo video presenta un approccio pratico per utilizzare questi strumenti e le tecniche per registrare gli eventi durante l&#39;embriogenesi precoce in C. elegans. Il maturo C. ovocita elegans è arrestato in profase della meiosi I e viene fecondato nella spermateca della ermafrodita adulto. Dopo la fecondazione, l&#39;ovocita procede attraverso il resto della meiosi I e II. Queste fasi possono essere osservate con fluorescente istone H2B (5). Durante il completamento della meiosi materna, il DNA dello sperma rimane condensata (vedi Figura 1). Dopo il completamento della meiosi, il DNA materno e paterno diventa decondensed e le due pronuclei forma. Il pronucleo materno migra verso il pronucleo paterno e si uniscono vicino al centro dell&#39;embrione. Mitosi Segue subito dopo l&#39;incontro con pronucleo. Tutti questi eventi si verificano in meno di un&#39;ora. Così, time-lapse microscopia di questa sequenza di eventi può essere facilmente realizzato. L&#39;esecuzione di questa tecnica richiede una certa facilità in coltura nematodi così come le abilità di base in microscopia oltre all&#39;accesso a un microscopio confocale. L&#39;esempio qui presentato utilizza un transgenico C. ceppo elegans che esprime due proteine ​​fluorescenti, GFP:: ubiquitina e mCherry:: H2B. Un microscopio confocale a scansione laser è utilizzato per osservare la localizzazione dinamica di queste due proteine. Inoltre, abbiamo dimostrato che l&#39;iniezione di Lysotracker fluorescente può essere usato per seguire il destino dei lisosomi nell&#39;embrione dopo la fecondazione. L&#39;iniezione di un tracker etichetta può essere eseguita anche per la visualizzazione delle concentrazioni di calcio mitocondri o locale (9). In teoria, il protocollo di iniezione potrebbe essere usato per visualizzare qualsiasi tipo di molecola fluorescente negli embrioni. Ciò potrebbe includere l&#39;etichetta piccole molecole, proteine, lipidi, ecc In alcuni casi, potrebbe non essere necessario iniettare effettivamente inseguitori etichettati come i vermi prontamente assorbimento alcuni coloranti come mitotracker (10). Tuttavia, abbiamo provato sia ammollo e iniezione di lysotracker e hanno trovato risultati molto migliori con l&#39;iniezione per la visualizzazione in embrioni. Considerazioni tecniche: Le sfide tecniche presentate con questa procedura sono la tecnica di microiniezione come pure la difficoltà nella diagnostica per immagini embrioni molto presto. Per quanto riguarda microiniezioni, lo spessore del pad iniezione agarosio è un fattore critico di successo per preparazioni iniettabili. Se il pad è troppo spesso, il worm si Dessicate e muoiono rapidamente. Se il pad è troppo sottile, il worm non si attacca al pad durante il processo di iniezione. Gli embrioni precoce può essere sensibile alle condizioni ambientali quali la temperatura e le condizioni di buffer. Embrioni di tipo selvaggio dovrebbe avviare decondensazione del DNA dello sperma e la migrazione pronucleo entro un minuto o così di completare la meiosi II (4). In 20 minuti, la citodieresi primo dovrebbe iniziare. Se gli embrioni sono esposti a intensità del laser molto alta o sono surriscaldati o schiacciati durante il montaggio, questo processo può essere interrotto. Tali embrioni saranno arresto dello sviluppo. In questo caso, l&#39;esperimento dovrebbe essere ripetuto con la potenza del laser diminuzione o un pad più spessa agarosio. C. elegans embrioni non secernono il loro guscio d&#39;uovo fino a poco dopo la fecondazione. Durante il breve periodo di tempo tra la fecondazione e la secrezione del guscio d&#39;uovo, gli embrioni non sono vitali al di fuori della madre (11). Alcuni laboratori hanno evitato questa sfida embrioni in utero di imaging (5, 12). In utero di imaging offre alcuni vantaggi come la possibilità di catturare gli eventi che si verificano durante o subito dopo la fecondazione. Tuttavia, questa tecnica richiede l&#39;utilizzo di un sistema di microscopia che permette l&#39;imaging dei tessuti profondi. Sistemi come due fotoni o multi-fotone sono particolarmente adatti per questo (13, 14). Quando si utilizza un tradizionale scansione laser o spinning microscopio confocale disco, le migliori immagini sono ottenute da embrioni, che hasono già stati tagliati fuori dal verme adulto come descritto qui. Sistema di imaging Considerazioni: Il tipo di sistema di imaging confocale utilizzato dipende esigenze degli utenti &#39;. In generale, i sistemi di scansione laser sono consigliate se si vogliono acquisire le immagini con la più alta risoluzione possibile. D&#39;altra parte, sistemi a disco rotante sono più adatti per i processi di imaging altamente dinamici, come l&#39;acquisizione di immagini è relativamente rapido e photobleaching / fototossicità è ridotta. I parametri di imaging specifiche variano a seconda del disegno sperimentale e il sistema di imaging confocale impiegato. In multidimensionale di imaging, bisogna considerare il numero di canali, piani focali, e ora i punti raccolti. A causa degli effetti della limitazione photobleaching e fototossicità, un numero finito di immagini possono essere acquisite in un dato esperimento. Quindi, se si sceglie di aumentare il numero di canali da acquisire, è probabile che sia necessario ridurre il numero di piani focali e / o punti di tempo e viceversa. Il numero totale di immagini che possono essere acquisite sarà influenzato dall&#39;intensità del fluoroforo viene esposta così come la sensibilità del microscopio confocale in uso. Fluorofori più intenso e più strumenti sensibili richiede tempi di esposizione più brevi e quindi producono meno photobleaching e fototossicità. Un gran numero o sistemi di imaging sono disponibili. Daremo i dettagli sui sistemi che sono stati utilizzati nei nostri laboratori. Per gli embrioni di imaging verme dal giro microscopia confocale disco, usiamo un microscopio invertito Nikon TE2000U dotato di un Piano 60X/1.4 NA obiettivo Apo. Il microscopio è collegato ad una unità disco CSU10 Yokogawa spinning, una Hamamatsu C9100-13 EM CCD, e una spettrale Ricerca Applicata LMM5 laser modulo unione contenente quattro laser a stato solido con uscita a 405, 491, 561 e 655 nm. Utilizzando questo sistema siamo in grado di catturare uno o due canali, 6-12 piani focali, e 25-50 timepoints (tra i 30 ei 60 secondi). Un tipico tempo di esposizione è di 100 a 200 millisecondi. Per gli embrioni di imaging con microscopia confocale a scansione laser, si utilizza un obiettivo Zeiss LSM700 dotata di 2 canali e quattro laser a stato solido (405, 488, 555 e 635 nm). Questo sistema è collegato a un microscopio Zeiss Observer Axio invertita con un piano-Apo obiettivo 63X/1.4NA utilizzato per l&#39;imaging embrione. Il sistema utilizza il software Zeiss ZEN per l&#39;acquisizione di immagini che fornisce anche l&#39;elaborazione limitata delle immagini e analisi. Quando l&#39;imaging con due fluorocromi, di solito si riuniscono 1-5 piani focali (~ 0.5 micron a parte) e raccogliere una pila Z ogni 15 secondi. Le collezioni sono continuò fino photobleaching di notevole gravità. Per generare la finale time-lapse video, immagini pila Z sono consolidate con il massimo strumento di proiezione nel software ZEN. I video sono esportati dal software come file avi.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Composizione </th></tr><tr><td> Uovo Buffer </td><td></td><td></td><td> 5mM Hepes pH 7,2, NaCl 110 mm, 4mm KCl, Acetato Mg 5mM, 5mm CaCl 2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettare iniezione capillare </td><td> Harvard Apparatus, Kent, Regno Unito </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ago Puller </td><td> Kopf </td><td> Modello 700C </td><td></td></tr><tr><td> Microinjector Apparatus </td><td> Tritech di ricerca </td><td> Minj-1 microiniezione regolatore </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans è stato spesso utilizzato come sistema modello negli studi dei primi processi di sviluppo. La trasparenza degli embrioni, le risorse genetiche, e la relativa facilità di trasformazione sono qualità che rendono C. elegans, un modello eccellente per embriogenesi precoce. Laser a base di microscopia confocale e tag fluorescente permetterà ai ricercatori di seguire specifiche strutture cellulari e le proteine ​​di un embrione in via di sviluppo. Per esempio, si può seguire organelli specifici, come i lisosomi o mitocondri, utilizzando coloranti fluorescente. Questi coloranti possono essere consegnato l&#39;embrione precoce mediante microiniezione nella gonade adulti. Inoltre, la localizzazione di specifiche proteine ​​può essere seguita usando i tag proteina fluorescente. Gli esempi sono qui presentati dimostrano l&#39;uso di un colorante fluorescente lisosomiale e fluorescente tag proteine ​​istoniche e ubiquitina. L&#39;istone etichettato è usato per visualizzare il DNA e quindi identificare la fase del ciclo cellulare. GFP-tagged ubiquitina rivela la dinamica delle vescicole ubiquinate nell&#39;embrione precoce. Le osservazioni dei lisosomi etichettati e GFP:: ubiquitina può essere usato per determinare se vi è colocalizzazione tra vescicole ubiquitinate e lisosomi. Una tecnica per la microiniezione del colorante lisosomiale è presentato. Tecniche per la generazione di ceppi transgenenic sono presentati altrove (1, 2). Per l&#39;imaging, gli embrioni sono tagliati fuori per adulti nematodi ermafroditi, montato su cuscinetti di agarosio 2% seguito dal time-lapse microscopia a scansione laser standard microscopio confocale o di un microscopio confocale disco rotante. Questa metodologia prevede la visualizzazione ad alta risoluzione di embriogenesi precoce.

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Questo articolo descrive una tecnica per la visualizzazione degli eventi precoci dell&#39;embriogenesi nel nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.8K Views.  University of Alabama in Huntsville. Questo articolo descrive una tecnica per la visualizzazione degli eventi precoci dell'embriogenesi nel nematode Caenorhabditis elegans.

Video: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

Ricerca

Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro Attivazione di Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Analisi quantitativa della migrazione casuale di celle usando Time-lapse Microscopia Video

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in<em&gt; C. elegans</em&gt; Embrioni

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...