La microscopia a dispersione Raman stimolata è una tecnologia di imaging chimico che consente il rilevamento rapido e quantitativo dei lipidi e consente il tracciamento dei lipidi negli animali vivi in modo privo di etichette. Il vantaggio più importante della microscopia SRS rispetto alle tradizionali tecniche di rilevamento lipidico è che è privo di etichette e quindi non è sostenibile per lo sbiancamento fotografico come altre questioni di fluorescenza e colorazione. L'uso della microscopia SRS in combinazione con gli strumenti genetici e biochimici disponibili per gli organismi modello, in particolare Caenorhabditis elegans fornisce un potente quadro per lo studio dei normali regolatori della biologia lipidica e del metabolismo.
Per alimentare i raggi laser nel microscopio SRS, in primo luogo, impostare il periscopio per sollevare il fascio da un'uscita sorgente luminosa picoseconda alla porta di ingresso laser a infrarossi sullo scanner del microscopio e aprire il software di controllo laser per avviare i laser. Abbassare la potenza laser della pompa a 50 milliwatt e impostare il segnale della pompa su 750 nanometri. Utilizzare un espansore di travi per regolare il diametro del fascio per adattarsi all'apertura posteriore degli obiettivi del microscopio.
Utilizzare due specchi a relè, M1 e M2, per guidare il raggio laser verso il periscopio e impostare i cenni del periscopio al centro della gamma di sintonizzazione. Selezionare la posizione iniziale e l'angolo di ogni specchio in modo che il raggio laser colpisca approssimativamente il centro dello specchio per lanciare il fascio al microscopio e utilizzare una porta vuota sulla torretta oggettiva del microscopio per eseguire l'allineamento del percorso. Posizionare la sonda del misuratore di potenza sulla porta obiettivo per misurare la potenza della luce trasmessa e impostare lo scanner del microscopio allo zoom più alto, 50X.
Misurare la potenza della luce trasmessa con il punto del raggio laser focalizzato e ottimizzare le manopole degli specchi M1 e M2 in modo iterativo per ottenere la massima potenza laser trasmessa. Utilizzare lo strumento di allineamento per eseguire l'allineamento fine della luce trasmessa per assicurarsi che la luce passi attraverso il centro dell'obiettivo e posizionare il tappo di allineamento del bersaglio a fluorescenza sul sedile obiettivo vuoto. Regolare le manopole del primo specchio sterzante, M1, per centrare il punto del raggio laser e introdurre il tubo di estensione con il tappo di allineamento sull'altra estremità a un sedile obiettivo vuoto per il monitoraggio del punto del raggio laser.
Quindi, sintonizzare le manopole del secondo specchio sterzante, M2, per centrare nuovamente il punto del raggio laser sull'altra estremità del tubo di estensione. Per impostare il modulo di rilevamento SRS, posizionare un cubo di splitter del fascio dopo il condensatore per dirigere il laser trasmesso al modulo diodo fotografico. Per impostare la connessione elettronica, utilizzare un modulatore elettroottico integrato a 20 megahertz all'interno del laser sintonizzabile picosecondo per modulare l'intensità del fascio Stokes e alimentare il segnale di uscita del diodo fotografico nell'amplificatore lock-in per la demodulazione della perdita raman stimolata.
Quindi, alimentare l'uscita dell'amplificatore lock-in nella scatola analogica del microscopio per convertire il segnale analogico elettrico in un segnale digitale. Per ottimizzare le condizioni di imaging, aggiungere cinque microlitri di acido oleico a una camera scorrevole mini microscopio e coprire il campione con uno slittamento di copertura. Posizionare il campione sullo stadio del microscopio e utilizzare il bordo del pad per individuare e mettere a fuoco la goccia.
Regolare il condensatore per l'illuminazione Kohler e utilizzare una scheda sensore a infrarossi e un visualizzatore a infrarossi per verificare se il percorso del fascio della pompa è ancora corretto. Verificare che lo stadio di ritardo sia impostato su zero femtosecondi e impostare la lunghezza d'onda del fascio della pompa su 795,8 nanometri. Impostare la potenza del fascio della pompa su 50 milliwatt e impostare il fascio stoke su 100 milliwatt.
Aprire l'otturatore sia per le travi, sia per l'otturatore principale del laser. Scansiona l'esempio e controlla l'immagine sullo schermo del computer. Modificare la modalità di visualizzazione su alta bassa e regolare l'intervallo per visualizzare una saturazione di circa il 50%.
Verificare se la saturazione è centrata nell'immagine, regolando attentamente gli specchietti retrovisori all'interno del sistema laser sintonizzabile picosecondi per una sovrapposizione ottimizzata della pompa e dello Stokes per massimizzare l'intensità dell'immagine e centrare l'intensità di picco se necessario. Prima di ogni sessione di imaging, aggiungere 100 microlitri di agarosio caldo al 2% a uno scivolo di vetro pulito posizionato tra diapositive di supporto con due strati di nastro da laboratorio e posizionare rapidamente una seconda diapositiva sopra la prima diapositiva. Pressato delicatamente per creare un tampone di agarosio sottile, uniforme e lasciare raffreddare l'agarosio.
Per montare i vermi per l'imaging, posizionare una goccia da quattro a cinque microliter di agente anestetico per 10-20 vermi su uno slittamento di copertura e utilizzare un microscopio a dissezione per raccogliere i vermi da immaginare, posizionando i vermi sulla goccia di anestesia mentre vengono raccolti. Quando tutti i vermi sono stati raccolti, coprire i vermi con lo scivolo di vetro con il tampone di agarosio. Per l'imaging, montare il campione di verme con lo slittamento di copertura rivolto verso l'obiettivo e dirigere la sorgente luminosa di luce sul campo verso l'oculare per individuare i vermi.
Portare i vermi a fuoco e regolare la posizione del condensatore di conseguenza. Regola i poteri laser impostando la potenza laser della pompa su 200 milliwatt e la potenza IR a 400 milliwatt. Impostare l'amplificatore lock-in per la demodulazione del segnale SRS del worm.
Inizia a scansionare il primo worm a una velocità di scansione rapida, regolando la messa a fuoco fine per trovare l'area di interesse. Quando il segnale è stato ottimizzato, passare a una velocità di scansione più lenta e a una risoluzione dei pixel più elevata per ottenere l'immagine SRS e salvare l'immagine in un formato che consente un'alta risoluzione. Una volta che tutti i campioni sono stati vengono vengono
Per analizzare le immagini, aprite i file in ImageJ e selezionate analizza e impostate le misure per selezionare le proprietà da analizzare. Utilizzare lo strumento di selezione poligonale per delineare la regione dell'intestino verme da quantificare e fare clic su analizza e misura di nuovo. Le misurazioni appariranno nella finestra dei risultati.
Una volta delineati tutti i worm, copiare e incollare le misure per ciascuno dei worm in un determinato genotipo in un foglio di calcolo. Per il valore di misurazione dello sfondo, selezionare un'area in prossimità del worm che non dispone di alcun segnale SRS e sottrarre il valore grigio medio di sfondo dalla misurazione per ogni singolo worm per calcolare la deviazione media e standard dello sfondo sottratto valori grigi medi da tutti i worm in un determinato genotipo o gruppo di test. Questi valori possono quindi essere normalizzati alla media del gruppo di controllo.
In questa analisi rappresentativa, i livelli lipidici intestinali nei vermi di tipo selvatico sincronizzati con l'età e nei mutanti daf-2 privi del recettore dell'insulina sono stati quantificati durante l'età adulta. Come previsto, si osserva un calo dei livelli lipidici nei vermi di tipo selvatico, a partire dal primo giorno e continuando fino al primo giorno di età adulta. I livelli lipidici nei mutanti daf-2, tuttavia, aumentano fino a quando non hanno cinque giorni, a quel punto rimangono costanti a circa 2,5-tre volte più alti del tipo selvatico.
L'inattivazione daf-16 sopprime l'aumento dei livelli lipidici dei mutanti daf-2. Espressione dell'isoforma daf-16a a o daf-16b nei daf-2, i doppi mutanti daf-16 non ripristinano i livelli lipidici. L'espressione dell'isoforma daf-16d/f/h, tuttavia, è sufficiente per ripristinare i livelli lipidici nei singoli mutanti daf-2, daf-16 ai livelli osservati nei singoli mutanti daf-2.
Questi risultati indicano che l'isoforma daf-16d/f/h modula specificamente il metabolismo lipidico nei vermi mutanti daf-2. È importante utilizzare la stessa potenza laser per i raggi pompa e Stokes durante la sessione di imaging e includere un gruppo di controllo ogni sei e quattro quantificazione coerente. Oltre a quantificare lo stoccaggio lipidico, la microscopia SRS può essere accoppiata con tag bioorthogonali, come il deuterio, e implementata per visualizzare la dinamica dell'incorporazione lipidica, della sintesi e della degradazione.
La microscopia SRS consente il multiplexing e può essere implementata per l'immagine di più biomolecole in diversi compartimenti subcellulari. La cosiddetta microscopia iperspettrale SRS ha un grande futuro nell'esplorazione delle dinamiche metaboliche.
