Il protocollo consente l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive e lo studio quantitativo del loro movimento ad alta risoluzione. L'incubazione con il colorante fluorescente ignora solo la necessità di proteine fluorescenti rispetto all'espressione, evitando artefatti e limitazioni correlati e consentendo l'applicazione del nostro protocollo alle cellule non trasflubili. Per ottenere una colorazione nucleoide preferenziale, si dovrebbe usare SYBR Gold e nient'altro nelle condizioni che abbiamo ottimizzato.
Altrimenti, il DNA cellulare totale potrebbe essere macchiato. Un giorno prima della procedura di etichettatura, coltura quattro volte 10 alla quinta cellule HeLa in due millilitri di mezzo in una piastra di Petri da 35 millimetri. La mattina seguente, lavare le cellule in due millilitri di PBS prima di aggiungere un millilitro di mezzo di coltura privo di fenolo rosso e un millilitro dell'appropriata soluzione di etichettatura 2X.
Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, aspirare accuratamente il colorante contenente supernatante da ogni piastra di Petri di 35 millimetri e lavare le celle con due millilitri di PBS. Quindi nutrire le cellule con un nuovo mezzo di coltura di cellule libere dal fenolo rosso e restituire la coltura all'incubatore di coltura cellulare protetto dalla luce fino all'imaging dal vivo. Per l'imaging a celle vive, almeno un'ora prima della sessione di imaging, posizionare l'incubatore superiore del palco sullo stadio del microscopio ad illuminazione strutturata a super risoluzione e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius e la concentrazione di anidride carbonica al 5%Accendere tutti i componenti del microscopio, compresi i laser, e selezionare un obiettivo di immersione ad alta ingrandimento e ad alta apertura numerica come raccomandato per la microscopia ad illuminazione strutturata a super risoluzione dal produttore del microscopio.
Quando i laser si sono riscaldati, installare la piastra di Petri di 35 millimetri sullo stadio del microscopio e utilizzare l'oculare per individuare un'area di interesse con celle attaccate al fondo del piatto. Per acquisire immagini di microscopia ad illuminazione strutturata ad altissima risoluzione, utilizzare una fotocamera del dispositivo accoppiato a carica accoppiata di carica elettronica di fascia alta back-end. Nel software di acquisizione delle immagini, impostare un elevato guadagno di moltiplicazione degli elettroni come raccomandato per la fotocamera.
Prima di acquisire la serie time lapse per il tracciamento dei nucleoidi, acquisire un'immagine di microscopia ad illuminazione strutturata a due super risoluzione a colori dello stesso campo visivo in un canale per la colorazione mitocondriale e un altro per l'oro SYBR. Impostare il canale di colore dell'immagine mitocondriale sull'eccitazione e l'emissione appropriate per la macchia mitocondriale utilizzata e impostare il filtro di emissione di eccitazione e bang Pass appropriato per il colorante dorato SYBR. Impostare la potenza laser più bassa possibile per entrambi i canali.
Se il microscopio acquisisce canali solo in sequenza, spegnere il canale per il rilevamento delle macchie mitocondriali. deselezionare la casella Z-stack nel software per disattivare l'acquisizione dello Z-stack per impostare l'acquisizione di un singolo piano focale e impostare il tempo di esposizione della fotocamera più breve possibile. Impostare tre rotazioni della rete e acquisire immagini bidimensionali delle celle etichettate a diversi valori di potenza laser e più tempi di esposizione per ottimizzare la potenza laser nel tempo di esposizione della fotocamera.
Selezionare la potenza laser e i tempi di esposizione della fotocamera che producono immagini di microscopia ad illuminazione strutturata con punti luminosi nei mitocondri con artefatti pochi o nessun artefatto e iniziare l'acquisizione della serie time lapse utilizzando le impostazioni ottimizzate. Per l'analisi delle immagini time lapse, aprire le immagini della microscopia ad illuminazione strutturata convertita e un software di analisi delle immagini appropriato che dispone di un modulo di tracciamento dei punti e fare clic su aggiungi nuovi punti per avviare la creazione guidata punti. Nella scheda Crea fare clic su Traccia punti nel tempo e passare al secondo passaggio della procedura guidata.
Impostare il diametro x-y stimato su 0,1 a 0,15 micrometri. Fare clic su sottrazione di sfondo e passare al terzo passaggio della procedura guidata. Trascinare la linea verticale nell'istogramma per regolare la soglia del filtro di qualità fino a quando la maggior parte dei nucleotidi non viene rilevata quando le macchie negli artefatti non vengono rilevate all'interno di ogni fotogramma.
Procedere al quarto e quinto passo della procedura guidata e selezionare l'algoritmo di movimento autoregressivo. Impostare la distanza massima su 0,5 micrometri e la dimensione massima dello spazio su zero. Quando i parametri ottimizzati consentono al software di rilevare correttamente tutti i punti e costruire le tracce, fare clic sul pulsante freccia ora per confermare la creazione delle tracce e fare clic sull'icona delle statistiche per estrarre le statistiche delle tracce.
Selezionare quindi i parametri statistici necessari e fare clic su Salva con nome per esportare i valori come file CSV punto per la quantificazione e la visualizzazione. L'etichettatura con alte concentrazioni di oro SYBR o PicoGreen si traduce in un'abbondante colorazione dei nuclei e della colorazione del punctato all'interno del citoplasma. A concentrazioni più basse, il debole segnale d'oro SYBR appare all'interno dei nuclei in un modello di punti luminosi si osserva all'interno del citoplasma.
L'etichettatura PicoGreen a basse concentrazioni produce principalmente colorazione nucleare. La colorazione simultanea con basse concentrazioni di oro SIBR in un colorante mitocondriale molto rosso rivela che quasi tutta la colorazione dell'oro si bersa si verifica all'interno dei mitocondri mentre l'etichettatura ad alte concentrazioni si traduce in una colorazione significativa dei nuclei e del citoplasma. L'imaging time-lapse rivela che dopo 45 minuti la colorazione nucleoide è vicina alla saturazione.
La fissazione provoca una leggera ridistribuzione del colorante al nucleo, mentre la permeablizzazione delle cellule fisse elimina il modello di colorazione punteggiata dei mitocondri e migliora la colorazione nucleare. Se l'oro SYBR viene aggiunto alle cellule dopo la fissazione e la permeablizzazione, il colorante viene distribuito uniformemente attraverso il citoplasma e il nucleo con conseguente perdita della specificità della colorazione. L'imaging 3D a cellule vive mediante microscopio ad illuminazione strutturata a super risoluzione rivela il nucleoide mitocondriale come punti luminosi all'interno dei mitocondri.
Tracciare le posizioni del nucleoide ad una risoluzione oltre il limite di diffrazione dimostra che la maggior parte dei nucleoidi mostra movimenti casuali a breve distanza che sono probabilmente confinati alla rete mitocondriale. È importante notare che questo protocollo non è compatibile con la fissazione del campione. Tuttavia, il nostro protocollo dovrebbe essere compatibile con un'ampia gamma di saggi basati sull'imaging di cellule vive per lo studio della morfologia, della dinamica e delle attività di molecole e organelli.
Il nostro studio illustra i vantaggi del retargeting dei coloranti non organici per le tecniche a base cellulare. Può ispirare l'esplorazione di altri coloranti fluorescenti per la loro applicazione negli studi cellulari.
