Gli autori desiderano ringraziare Amanda Struckhoff per l&#39;aiuto iniziale con l&#39;esperimento. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio NIH 5RO1CA115706.

1. Preparazione della piastra ricoperta di collagene <ol><li> Diluire collagene ad una concentrazione finale di 10 pg / ml in Opti-Mem media. </li><li> Ricoprire piastre da 6 pozzetti con collagene, con l&#39;aggiunta di 1,5 ml dal passaggio 1 a ciascun pozzetto. Incubare per una notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno seguente, lavare la piastra 2 volte con 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) e memorizzarli in PBS. </li></ol> 2. Preparazione cellulare e Semina su una piastra da 6 pozzetti Nota: Utilizzare i media caldi e PBS per garantire condizioni ottimali per il movimento delle cellule <ol><li> Grow MDA-MB-231 (uno carcinoma invasivo della mammella linea cellulare) scarsamente in Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM) con 10% siero fetale bovino (FBS). In questo esempio, si usa il MDA-MB-231, tuttavia, questo metodo può essere applicato a qualsiasi aderenti linee tumorali e non di cellule cancerose. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS 1x caldo e raccogliere per tripsinizzazione. Controllare cellule sotto il microscopio per fare sunuovamente che le cellule siano staccate con trattamento con tripsina. </li><li> Raccogliere le cellule aggiungendo mezzo DMEM con 10% FBS, dolcemente centrifugare le cellule a 1000 g per 5 minuti. Risospendere il pellet di cellule delicatamente in mezzo con DMEM 10% FBS. </li><li> Rompere il pellet di cellule pipettando su e giù delicatamente. È importante per abbattere cluster cellulari in singole celle per quanto possibile. </li><li> Contare le cellule e diluire ad una concentrazione finale di 50.000 cellule / ml in DMEM media con 10% FBS. Dispensare 2 ml in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore di coltura tissutale notte, fino a partire il time-lapse microscopia. </li><li> Per assicurare un ampio spazio per la migrazione, crea una ferita utilizzando una punta di pipetta, lavare la piastra con 1X PBS per rimuovere i detriti (formata come risultato di ferita) ed aggiungere DMEM con 10% FBS. Controllare sotto il microscopio di cellule galleggianti. Se un gran numero di cellule sono flottanti, ripetere la procedura di lavaggio. Ora, la lastra è pronta per essere configurato sulmicroscopio per l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. </li></ol> 3. Microscopio di installazione e acquisizione di immagini automatica Ci sono diversi pacchetti software di imaging che controllano il microscopio per l&#39;acquisizione automatica di immagini. Qui, usiamo Slidebook 5,0 software di imaging e acquisizioni automatici vengono eseguiti con un microscopio Olympus (Olympus IX81), accoppiato ad un EM-telecamera Hamamatsu C9100, che è eccellente per le applicazioni live-cella in cui la velocità di acquisizione e la fototossicità minima è di primaria importanza. Il sistema comprende un top camera di controllo ambientale, stage (Neue Live Cell) e un sistema automatico di controllo stadio XY (Prior Proscan). Le immagini vengono acquisite con un 10X UPLANFL Ph1/0.30 obiettivo, in modalità campo chiaro, con un intervallo di tempo definito. Il protocollo che segue descrive l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. <ol><li> Accendere il microscopio, macchina fotografica, e live apparecchio imaging cellulare. Posizionare la piastra sopra il palco microscopico. Coprire la piastra da ENVI Neue Live Cellambientale camera di controllo, che è collegato con un rifornimento di CO 2 e sensori di temperatura. Regolare il termostato a 37 ° C e CO 2 al 5%. </li><li> SlideBook software consente la selezione oggettiva completamente automatizzato, la selezione lunghezza d&#39;onda e di passare facilmente tra le tecniche di campo e luminose fluorescenti. Al fine di impostare diversi parametri di controllo messa a fuoco, il software open SlideBook&gt; vai alla barra dei menu di controllo messa a fuoco&gt; selezionare, cliccando&gt; <img alt="Figura 0 Pulsante 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" /> e selezionare i parametri seguenti: <ol><li> Nella &quot;scatola Obiettivo,&quot; definire l&#39;obiettivo a scelta, finestra a discesa. Si noti che stiamo usando un obiettivo di fase e hanno selezionato manualmente l&#39;anello appropriato fase nel condensatore. Se si utilizza un sistema con un condensatore automatizzata, questa verrà automaticamente impostato attraverso il programma software. In alternativa, se non torretta obiettivo, né condensatore sono automatizzati questi dovrebbero essere selezionati ogni manualely. </li><li> Nel campo &quot;Filter Set&quot; box: <ol><li> Selezionare le impostazioni di orientare il percorso della luce né al oculare o la fotocamera dal menu a tendina per visualizzare i filtri disponibili (&quot;Live&quot; per oculare, &quot;widefield&quot; per la Camera nel nostro sistema). </li><li> Selezionare il filtro appropriato per brightfield illuminazione (nel nostro set up, questa opzione è etichettato come &quot;CID&quot;, che rappresenta una posizione aperta per il percorso della luce campo chiaro). </li><li> Selezionare la sorgente di luce facendo clic su &quot;Apri Luminoso&quot; per aprire l&#39;otturatore più luminosa. </li></ol></li></ol></li><li> Per visualizzare l&#39;esempio sotto l&#39;oculare, selezionare il filtro più luminosa (posizione &quot;6&quot; nel nostro sistema) sulla torretta. Dopo aver inizialmente la visualizzazione del campione attraverso l&#39;oculare di trovare campi appropriati e portare il campione a fuoco (punti da 3.2.1 a 3.2.2.3). Spostare la torretta filtro per modificare il percorso della luce per la fotocamera per l&#39;acquisizione di immagini (posizione &quot;1&quot; nel nostro sistema). </li><li> La fase automatizzata consente la selezione di diversi XY coordinamentotes per catturare più campi di interesse durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Nel software SlideBook, passa al controllo di messa a fuoco, selezionare &quot;XY&quot;, selezionare diverse posizioni anche se il pezzo occhio, quindi fare clic su &quot;set point&quot; lock in ogni luogo per l&#39;acquisizione di immagini (Figura 1). </li><li> Affinare la messa a fuoco dell&#39;immagine della telecamera che viene visualizzato sullo schermo. Ciò può essere realizzato o utilizzando i comandi manuali del microscopio o controlli di computer, che può regolare la messa in incrementi più sottili. </li><li> Utilizzando i controlli nella &quot;Focus Controls&quot; finestra, regolare la posizione z del palcoscenico. Per ottenere risultati ottimali, concentrarsi su piani sporgenze cellulari vicino al contatto con la piastra. </li><li> Per aiutare con messa a fuoco utilizzare il cursore per regolare i tempi di esposizione di essere in una gamma appropriata per la messa a fuoco. Se più posizioni XY sono state selezionate, regolare la messa a fuoco per ogni posizione individuale: Sotto il controllo di messa a fuoco&gt; XY visita&gt; punto. Nota: questo viene fatto per assicurarsi che, tha campi sono correttamente focalizzata per una istantanea ottimale. </li><li> Utilizzare il software per impostare i parametri della finestra di acquisizione. In SlideBook, aprire la cattura selezionando <img alt="Figura 0 Pulsante 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" /> dalla barra dei menu. Vedere la Figura 2. Abbiamo quindi i seguenti parametri. <ol><li> Controllare Capture&gt; tipo lasso di tempo. </li><li> Controllo del filtro del set: Wide field: DIC (per l&#39;immagine in campo chiaro). </li><li> &quot;Lapse Time&quot; è il numero di punti temporali che verrà acquisita (può variare, a seconda del tipo di cellula). La durata è la lunghezza totale del tempo per l&#39;esperimento. [Unità di tempo in millisecondi (ms), secondi (s), minuti (m) o ore (h)] può essere selezionato dal menu a discesa. </li><li> &quot;Interval&quot; è il ritardo tra l&#39;inizio di un tempo di valutazione e l&#39;inizio del successivo tempo di valutazione. Come si digita in due di questi valori, il terzo campo viene calcolato automaticamente. </li><li> XY cattura multipla: selezionare &quot;multiPunto di lista &quot;per più di 1 posizione XY. </li><li> Assegnare un nome al file. Nell&#39;esempio riportato, lo abbiamo chiamato &#39;231 &#39;. </li></ol></li><li> Per evitare imprevisti spegnere del computer a causa di immagini multiple, utilizzare l&#39;opzione &quot;spool&quot; per salvare il file. E &#39;facoltativo, ma è altamente consigliato. A tale scopo, sotto la cattura Contro l&gt; selezionare Avanzate&gt; Spool&gt; Cattura alla memoria e salvare file di spool dopo ogni punti temporali. Sfoglia il percorso in cui salvare il file del libro slitta (Figura 3). Il filmato generato può essere importato successivamente dal luogo designato. Passi di installazione microscopio è stato riassunto in <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">file di 3,1</a> . </li></ol> 4. Image Processing e analisi della migrazione: Calcolo della velocità e spostamento In questo esempio, l&#39;elaborazione delle immagini viene fatto SlideBook 5, 6 5,0 software. Ci sono vari altri programmi, come ImageJ 7 per l&#39;elaborazione delle immagini e analisi. <ol><li> SlideBook importare i file generati da immagini di campi diversi in momenti diversi. Vai alla barra dei menu&gt; sotto Immagine&gt; Importa&gt; Presentazione libro di spool&gt; selezionare il file desiderato (Figura 4a). </li><li> Qui il nostro obiettivo è quello di tracciare il movimento delle singole cellule. Esso può essere fatto utilizzando il monitoraggio automatizzato o inseguimento individuale. In questo esempio, abbiamo usato tracciamento manuale, dal momento che questo agevola escludere artefatti facilmente, che è più difficile con il monitoraggio automatizzato. </li><li> Aprire il file SlideBook, in cui dobbiamo effettuare tracking. In menu: Maschera Seleziona&gt; Monitoraggio protocollo Particle protocollo Particle&gt; Manuale di monitoraggio (Figura 4b). Apparirà una finestra con i punti di inizio e la fine (Fig. 4c). </li><li> Begin per seguire il movimento di cellule individuali cliccando il centro di ciascuna cella (nucleo). Traccia circa 10 cellule di ogni film e almeno tre film diversi dovrebbero essere selezionati da diverse posizioni in modo che circa 30 cellule saranno analizzate da un esperimento. Ogni esperimento deve essere ripetuta tre volte. Per consentire un approccio imparziale, selezionare le celle da posizioni diverse, come alcune cellule dalla parte anteriore, centrale, ecc angoli Fare clic su &quot;OK&quot;, una volta che il monitoraggio è fatto. </li><li> Migrazione casuale può essere analizzata misurando i cambiamenti nella velocità e così via, velocità o spostamento Per analizzare i dati, in Menu&gt; maschera selezionare&gt; tracciamento di particelle&gt; protocollo di monitoraggio di particelle. Selezionare i parametri di monitoraggio come descritto, di seguito: (figura 5a): <ol><li> Pista con - Selezionare il parametro che si desidera tenere traccia dal menu a tendina. In questo esempio, abbiamo usato, centro della zona (le coordinate del centro della Obgetto). </li><li> Fare clic su &quot;traccia e continua&quot;. Una volta che il monitoraggio è completo, questo passa automaticamente alla fase successiva. </li></ol></li><li> Scegli le statistiche desiderate per ciascun percorso, come lo spostamento e la velocità media (vedi figura 5b): <ol><li> Velocità media - la distanza totale percorsa divisa per il tempo necessario per percorrere quella distanza. </li><li> Cilindrata totale - la distanza totale percorsa dall&#39;oggetto. </li><li> Fare clic su &quot;Calcola e continua&quot; se si desidera passare al passo successivo, o semplicemente selezionare &quot;Calcola&quot; se si desidera visualizzare le statistiche senza passare alla fase successiva. Un file che verrà generato può essere salvato come file di testo e possono poi essere esportati in Excel. </li></ol></li><li> Al fine di tenere traccia degli oggetti che utilizzano il protocollo automatizzato di monitoraggio, in primo luogo una maschera deve essere creato. <ol><li> Selezionare Maschera Segment&gt; Immagine&gt; una finestra segmento sembrerebbe&gt; selezionare fino a quando si raggiunge la soglia in modo tale che settembrearating un oggetto da altri&gt; fare clic su Applica&gt; OK (vedi Figura 5c). Fase 4.5.1 è la stessa. </li><li> Rimuovere gli oggetti più piccoli - Selezionare questa casella per rimuovere selettivamente gli oggetti più piccolo di una certa dimensione. Inserire la dimensione del campo di modifica e scegliere micron o pixel come unità. Questo viene utilizzato per rimuovere artefatti spesso causati da detriti. </li><li> Movimento minimo - immettere il numero minimo di punti temporali che devono essere monitorati per determinare un percorso. </li><li> Massimo movimento - Inserire il movimento massimo che ci si aspetta da un dato oggetto da un punto temporale a quello successivo. </li><li> Procedura per analizzare i dati sono gli stessi di tracciamento manuale (vedere la procedura 4.5.2 a 4.6.2). </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un esempio di analisi migrazione casuale quantificata in termini di velocità e di spostamento (Figura 6). Dopo aver esportato il file di to excel, i dati vengono stampati utilizzando una scatola e la trama baffi. Analisi statistica confronto spostamento totale e la velocità media tra prova e di controllo viene eseguita utilizzando Mann-Whitney. Il campione di prova mostra un aumento della velocità media rispetto al controllo. Il campione di prova mostra un aumento di cilindrata totale rispetto al controllo. Film di controllo e di prova: controllo MDA-MB-231 e test di MDA-MB-231 cellule sono state seminate su collagene notte. Time-lapse video di microscopia è stata eseguita al microscopio Olympus, accoppiato ad un EM-Hamamatsu fotocamera. Le immagini sono prese in un intervallo di 1 ora per un totale di 18 ore durante la migrazione casuale. Vedere Movie Movie 1 e 2 della migrazione casuale per il controllo e campioni di prova. Microscopio setup: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" /> Figura 1. Costituzione di punti di più per l&#39;immagine<html> catturare. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" /> Figura 2. Piazza raffiguranti il controllo di cattura. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" /> Figura 3. Come salvare più immagini. dflinebreak &quot;&gt; Elaborazione di immagini e l&#39;analisi della migrazione. <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" /> Figura 4A. Passi per importare l&#39;immagine per l&#39;analisi dei dati. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" /> Figura 4b. Fasi per analizzare i dati utilizzando il protocollo di monitoraggio di particelle. <img alt = &quot;Figura 4c&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg&quot; /&gt; Figura 4c. Lunghezza del percorso delle particelle Window raffigurante cingolati. Passi di analisi dei dati. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" /> Figura 5a. Passi che raffigurano i parametri del protocollo di monitoraggio di particelle. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" /> Figura 5b. Selezione di statistiche percorso da analizzare. <img alt="Figura 5c" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" /> Figura 5c. I passaggi per creare la maschera per il protocollo di monitoraggio automatizzato. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" /> Figura 6. Velocità media (Figura6a) e lo spostamento (figura 6b) è tracciata in una trama baffi. Il campione di prova mostra un aumento di velocità e spostamento come confronto al controllo. Film Movie 1. La migrazione di cellule di controllo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il filmato</a> . Movie 2. La migrazione delle cellule di prova. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il filmato</a> . Controllo MDA-MB-231 e test di MDA-MB-231 cellule sono state seminate su scarsamente collagene per una notte. Time-lapse video di microscopia è stata eseguita al microscopio Olympus, accoppiato ad un EM-Hamamatsu fotocamera. Le immagini sono prese in un intervallo di 1 ora per 18 ore durante la migrazione casuale. Si prega di vedere i film della migrazione casuale per il controllo e test.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il vero test di migrazione tempo casuale consente di preciso, sensibile, l&#39;analisi dei parametri di migrazione delle cellule come la velocità e spostamento. Questo metodo non è limitato alla fine misura valore punto, quindi è più quantitativa. Dal momento che, le cellule vengono monitorati nel normale terreno DMEM con siero, ma riduce l&#39;effetto deleterio di incubazione più lungo nel siero dei media liberi. È stato dimostrato che la migrazione delle cellule dipende dalla formattazione e rottura delle cellul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gemini Bio-Prodotti </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-Mem </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Collagene </td><td> BD </td><td> 354231 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio con camera a cella Live &amp; automatizzato di controllo XY </td><td> Olimpo </td><td> Olympus 1X81 </td><td></td></tr><tr><td> Camera di controllo ambientale </td><td> Neue </td><td> Neue live cella Camera </td><td> Il nostro è un personalizzato costruito piano rettangolare lastra di vetro per le ottiche appropriate attraverso la parte superiore della camera. La forma rettangolare ospita multi-pozzetti utilizzati in molti dei nostri sperits. </td></tr><tr><td> Automated XY </td><td> Precedente </td><td> Prima Proscan </td><td> Questo permette di moltiplicare il ritorno precise posizioni XY selezionate durante la microscopia time lapse. </td></tr><tr><td> Macchina fotografica </td><td></td><td> Hamamatsu EM fotocamera C9100 </td><td></td></tr><tr><td> Software </td><td> Tipicamente acquistato tramite vendor microscopio, come Olympus </td><td> Presentazione Libro 5 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of random migration of cells using time-lapse video microscopy

La migrazione delle cellule è un processo dinamico, che è importante per lo sviluppo embrionale, la riparazione dei tessuti, la funzione del sistema immunitario, e l&#39;invasione tumorale 1, 2. Durante la migrazione direzionale, cellule muoversi rapidamente in risposta ad un segnale extracellulare chemiotattica, o in risposta a stimoli intrinseci 3 forniti dalla macchina motilità di base. Migrazione casuale si verifica quando una cellula possiede bassa direzionalità intrinseca, permettendo alle cellule di esplorare il loro ambiente locale. La migrazione cellulare è un processo complesso, nella cella risposta iniziale subisce polarizzazione e sporgenze si estende nella direzione di migrazione 2. I metodi tradizionali per misurare la migrazione quale il saggio Boyden camera di migrazione è un metodo semplice per misurare chemiotassi in vitro, che consente di misurare la migrazione come risultato punto finale. Tuttavia, questo approccio non permette la misurazione di parametri di migrazione singoli, né permette di Visuazazione dei cambiamenti morfologici delle cellule subisce durante la migrazione. Qui vi presentiamo un metodo che ci permette di monitorare le cellule che migrano in tempo reale con video - microscopia lasso di tempo. Poiché la migrazione cellulare e dell&#39;invasione sono le caratteristiche di cancro, questo metodo è applicabile a studiare la migrazione delle cellule del cancro e l&#39;invasione in vitro. Migrazione casuale di piastrine è stato considerato come uno dei parametri di funzionalità piastrinica 4, quindi questo metodo potrebbe anche essere utile nello studio funzioni piastriniche. Questo saggio ha il vantaggio di essere rapida, affidabile, riproducibile, e non richiede l&#39;ottimizzazione del numero di cellule. Al fine di mantenere condizioni fisiologicamente adatte cellule, il microscopio è dotato di CO 2 di alimentazione e termostato. Movimento cellulare viene monitorata da ripresa di immagini con una telecamera montata sul microscopio a intervalli regolari. La migrazione cellulare può essere calcolata misurando la velocità media eMEDIO spostamento, che viene calcolato dal software Slidebook.

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Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Questo metodo permette di monitoraggio delle cellule in tempo reale e misurazioni quantitative dei diversi parametri di migrazione cellulare, quali la velocità, spostamento e velocità. A differenza dei metodi tradizionali, questo approccio in tempo reale non si basa su misurazioni quantitative di migrazione degli endpoint, invece permette di monitorare e calcolare diversi parametri in modo continuo.

Analisi quantitativa della migrazione casuale di celle usando Time-lapse Microscopia Video

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

quantitative-analysis-random-migration-cells-using-time-lapse-video

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16.7K Views.  LSU School of Medicine. Questo metodo permette di monitoraggio delle cellule in tempo reale e misurazioni quantitative dei diversi parametri di migrazione cellulare, quali la velocità, spostamento e velocità. A differenza dei metodi tradizionali, questo approccio in tempo reale non si basa su misurazioni quantitative di migrazione degli endpoint, invece permette di monitorare e calcolare diversi parametri in modo continuo.

Video: Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

Ricerca

Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in<em&gt; C. elegans</em&gt; Embrioni

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Time-Lapse Video Microscopia per la valutazione di EYFP-Parkin aggregazione come marcatore per cellulare Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente-free Video microscopia per la dinamica e analisi quantitativa della coltura delle cellule aderenti

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. Therefore, it is considered a living antibiotic. To apply B. bacteriovorus as a living antibiotic, it is first necessary to understand the major stages of its complex life cycle, particularly its proliferation inside prey. So far, it has been challenging to monitor successive stages of the predatory life cycle in real-time. Presented here is a comprehensive protocol for real-time imaging of the complete life cycle of B. bacteriovorus, especially during its growth inside the host. For this purpose, a system consisting of an agarose pad is used in combination with cell-imaging dishes, in which the predatory cells can move freely beneath the agarose pad while immobilized prey cells are able to form bdelloplasts. The application of a strain producing a fluorescently tagged &#946;-subunit of DNA polymerase III further allows chromosome replication to be monitored during the reproduction phase of the B. bacteriovorus life cycle.

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Presented here is a protocol that describes monitoring of the complete life cycle of predatory bacterium Bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy in combination with an agarose pad and cell-imaging dishes.

Imaging a cellule vive del ciclo di vita del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza Time-Lapse

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...