Questo lavoro è stato sostenuto dal Massachusetts General Hospital Dipartimento di Medicina fondi interni (JMT, MKM, MLC, JMV), National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria concedere T32EB006348 (CEC), Center del Massachusetts General Hospital per finanziare Biologia Computazionale e Integrative sviluppo e AI062773 ( RJH), borse di studio AI062773, DK83756, e DK 043351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) e Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) AI057999 (JMV ). Ringraziamo Nicola C. Yoder per le discussioni utili, e Feltri Carlo (RPI, Inc.) per l&#39;assistenza tecnica.

1. Condizioni di coltura di agenti patogeni per l&#39;intrappolamento ottico <ol><li> Crescere A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) su un semi-solido agar contenente SBD (Sabouraud destrosio) 30 ° C per 3 giorni. </li><li> Crescere C. albicans (SC5314) in YPD (Lievito peptone destrosio) coltura liquida contenente 100 mg / ml ampicillina notte in un incubatore shaker a 30 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di agenti patogeni per l&#39;etichettatura fluorescente <ol><li> Raccolta desiderata quantità di agenti patogeni e trasferire in una provetta 1,5 ml di reazione. </li><li> Aggiungere 300 ml di tampone fosfato (PBS) al tubo di reazione. </li><li> Sonicare miscela per 30 secondi. </li><li> Centrifugare a 4000 rpm per 1 minuto. </li><li> Aspirare il surnatante, lasciando pellet indisturbato. </li><li> Ripetere (2,4) e (2,5) altre due volte. </li><li> Risospendere in 500μL di PBS. </li></ol> 3. L&#39;etichettatura dei patogeni con colorante fluorescente <ol><li> Sciogliere 1 mg di colorante di interesse (ad esempio Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) in 100 microlitri dimetilformammide (DMF) (concentrazione di 10 mg / mL). </li><li> Aggiungere 3 ml di miscela colorante di provette contenenti agenti patogeni lavato. </li><li> Ruotare o scuotere campione a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Lavare campione con PBS 3X per centrifugazione a 4000 rpm per 1 minuto. </li><li> Risospendere in 300 ml di PBS. </li></ol> 4. Raccolta di cellule T da sangue intero <ol><li> Ottenere sangue intero (fresco). </li><li> Sangue caldo, PBS + 2% di siero fetale bovino (FBS), e HISTOPAQUE a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungi CD4 + Cocktail RosetteSep umani cellule T di arricchimento a 50 microlitri / ml di sangue intero. </li><li> Ruotare il campione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Diluire il campione con un uguale volume di PBS + 2% FBS e mescolare delicatamente. </li><li> Strato diluito campione in cima HISTOPAQUE, riducendo al minimo la miscelazione </li><li> Centrifugare per 20 minuti a 1200 xg a temperatura ambiente con il freno. </li><li> Rimuovere le cellule arricchito. </li><li> Lavare le cellule con PBS arricchito 2x soluzione + 2% FBS. </li><li> Lisare i globuli rossi per 2 minuti con il rosso del buffer di lisi dei globuli </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS + 2% FBS e centrifugare cellule lisate rossi del sangue a 1500 rpm per 5 minuti </li><li> Aspirare il surnatante, attenti a non disturbare il pellet </li><li> Risospendere in mezzi IMDM contenente il 10% di siero fetale bovino </li></ol> 5. Preparazione dei macrofagi RAW 264.7 in camera di diapositive <ol><li> Preparare DMEM (Dulbecco modificato medio di Eagle) per contenere il 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e 1% di L-glutammina. </li><li> Mezzi di caldo, tripsina, e PBS in bagno caldo a 37 ° C. </li><li> Lavare 2x piastra con PBS </li><li> Aspirare il PBS tra ogni lavaggio. </li><li> Aggiungere 5 ml di tripsina piastra a copertura della superficie (per una tavola 10 coltura di tessuti cm). </li><li> Incubare per 5 min a 37 ° C. </li><li> Bussare dolcemente lato della piastra di staccare le cellule dalla superficie della piastra. Fare attenzione a non spruzzi tripsina al di fuori della piastra. </li><li> Aggiungere 5 ml o quantità equivalente di media tripsina. </li><li> Aspirare miscela in un tubo di reazione. </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 3 minuti. </li><li> Mezzi di aspirare, attento a non disturbare il pellet. </li><li> Risospendere in 10 ml di media. </li><li> Aggiungere 400 l di media per ciascuna camera della diapositiva camera. </li><li> Aggiungere 5 ml di sospensione cellulare per ogni camera. </li><li> Crescere durante la notte in incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 6. L&#39;aggiunta di agenti patogeni a campione <ol><li> Pipettare 5-10 microlitri di agenti patogeni etichetta di interesse (dai passi 1-3) nella camera. </li><li> Mescolare accuratamente pipeting su e giù, attenzione a non toccare il fondo della camera di disturbare i macrofagi aderito. </li></ol> 7. Caricamento dei campioni sul filatura microscopio confocale disco (in video, scorrere i componenti) <ol><li> Accendere tutti i componenti di filatura microscopio confocale disco. </li><li> Allineare microscopio per l&#39;imaging DIC. </li><li> Rimuovere il vetrino della camera da incubatrice. </li><li> Inserire scivolare in camera fase specializzati. </li><li> Rimuovere superiore della slitta da camera (necessario per l&#39;imaging DIC). </li></ol> 8. Preparazione per la cattura ottico (in video, scorrere componenti e come è integrata nel microscopio) <ol><li> Attivare otturatore per trappola ottica. </li><li> Accendere il laser a infrarossi. </li><li> Otturatore aperto (il laser) a trappola ottica. </li><li> Conferma di scatto di fronte a laser IR è chiusa da verificare con la carta di IR. </li></ol> 9. La selezione e la manipolazione di agenti patogeni con trappola ottica <ol><li> Focus su macrofagi su vetrino aderito. </li><li> Trova patogeni liberamente fluttuanti in soluzione adiacente al macrofagi. </li><li> Spostare stadio tale che l&#39;agente patogeno è in prossimità della trappola. </li><li> Otturatore aperto e coinvolgere la trappola. </li><li> Spostare campione di portare macrofagi in contatto con la trappola stazionarioped patogeno. </li><li> Immagine con microscopio confocale filatura del disco, sia in DIC, fluorescenza, o combinazione di entrambi. Tipicamente, cattura avviene in DIC, e imaging in tempo reale si fa con fluorescenza. </li></ol> 10. Rappresentante dei risultati: Per esercitare il pieno controllo spaziale e temporale dei patogeni e perline in una in vivo e in vitro l&#39;ambiente, abbiamo progettato una custom-built apparato cattura integrato su un disco rotante microscopio confocale (schema mostrato in fig. 1). A piena forza, il laser fornito 350 mW di potenza e dopo l&#39;accoppiamento della luce con le diverse componenti ottici nell&#39;apparato trappola ottica, ~ 80 mW di energia a scopo TIRF, misurata con un misuratore di potenza, è stato utilizzato per formare la trappola nella camera. Al fine di posizionare un oggetto nella camera relativa all&#39;oggetto in trappola, il palco è stato spostato mentre si tiene l&#39;oggetto intrappolato fermo con il laser cattura. Il palco è stato spostato a velocità abbastanza lento, in modo che la forza di trascinamento sulla particella intrappolata non superare il valore massimo di cattura. Popolazioni separate di C. albicans (tipico dimensioni - ~ 5 micron) sono stati etichettati con ciascuno dei tre colori (AF488, AF568 e AF647, corrispondenti a verde, blu e rosso in figura, rispettivamente) per illustrare l&#39;imaging con più canali di fluorescenza allo stesso tempo otticamente cattura l&#39;agente patogeno. Un singolo C. albicans era intrappolato e si trasferì in un modello quadrato con un gruppo di lievito altre, come indicato dalle frecce grigie, dimostrando la capacità di catturare e manipolare la posizione specifica di un agente patogeno single scelto dall&#39;operatore anche in un ambiente affollato (Fig. 2A) . Per illustrare ulteriormente la versatilità di questo sistema per intrappolare le morfologie forma diversa esposti da parte di organismi patogeni, la pinzetta ottica è stato anche in grado di contenere e di situare una C. particelle albicans con un pseudoife. Il C. albicans etichettati con AF647 (rosso) è stato spostato lungo una traiettoria, come indicato dalla freccia bianca e posto accanto alle cellule GFP-LC3-RAW fluorescenti (Fig. 2B). La parte di lievito di C. albicans è stato intrappolato come pseudoife trainati lungo. Abbiamo anche posizionato Aspergillus fumigatus accanto a una cella RAW macrofagi del mouse in modo da analizzare il quadro tempo assoluto della fagocitosi con questa linea cellulare particolare e patogeno (Fig. 3A). Una volta che il patogeno entra in contatto con la cellula, la trappola è spento, e time-lapse imaging è impiegato per osservare gli eventi successivi cellulare (Fig. 3B). La trappola ottica è stato utilizzato anche per catturare primarie T-cellule isolate dal sangue e diretto adiacente perle rivestite con anticorpi anti-CD3 in modo che il T-cellule a formare una sinapsi immunologica con il tallone (Fig. 4), mostrano le ulteriori versatilità per intrappolare e manipolare direttamente le cellule immunitarie. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Panoramica e schematica unita trappola ottica e filatura di configurazione disco microscopio confocale. Strumento di layout che mostra il fascio di cattura (viola), campo chiaro percorso di illuminazione per imaging (arancione), fascio di eccitazione di fluorescenza (rosso), emissione di fluorescenza (verde), charge-coupled device (CCD) videocamera, moltiplicando elettrone-Charge Coupled Device (EM- CCD) fotocamera, specchi dicroici (D1 e D2), specchi (M1 e M2) e lenti (L1, L2, L3, L4). Tutti gli altri componenti del sistema-trappola microscopio confocale sono etichettati in figura. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) le immagini di fluorescenza intrappolati e manipolati C. albicans. Un intrappolato fluorescenza marcata (Alexa Fluor 488 (AF488), blu), organismo in un campo di altri fluorescenza marcata C. albicans (AF568, AF647 e verde, rosso). Il palco viene spostato tutto il intrappolato, particella blu CA come indicato dalle frecce grigie. (B) Trapped pseudo-ife forma di C. albicans accanto alla GFP-LC3 cellule RAW. Fluorescente forma psuedohyphal di CA (rosso, AF647) otticamente intrappolati e si è trasferito adiacente alla GFP-LC3 espresso macrofagi RAW. L&#39;organismo di certificazione è spostata lungo la traiettoria, come indicato dalla freccia bianca. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Cattura e il posizionamento di A. fumigatus accanto a una cellula fagocitaria RAW. (A) le immagini di un campo chiaro A. intrappolato fumigatus, come indicato dalla freccia bianca, spostati e posizionati lungo il percorso come indicato dalla freccia rossa. L&#39;agente patogeno intrappolati è leggermente fuori fuoco a causa della trappola spingendo l&#39;organismo leggermente al di sopra del piano focale. A. fumigatus è spostato fino a quando non viene inserito adiacente alla cella desiderata RAW. (B) Flul&#39;imaging orescence di fagocitosi di A. fumigatus da cellule RAW. Dopo che il patogeno intrappolati è collocato accanto a una cella RAW, il processo di fagocitosi è attivato. Al 30 s, la membrana della cellula RAW inizia a cambiare e formare una coppa intorno alla particella. A 60 s, la coppa è completamente formato. Dal &#39;90 al 150s, A. fumigatus è inghiottito, e di 180 s, la particella è completamente interiorizzato <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Intrappolando primario delle cellule T per formare sinapsi con perline rivestito anti-CD3. DIC immagini di un primario delle cellule T mosso dalla trappola ottica ad una posizione vicino ad un tallone rivestito con anticorpi anti-CD3. La cella costituisce quindi una sinapsi immunologica, che non può essere facilmente individuabile nelle immagini.

<ol>
	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+Learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers.">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure.">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science.">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching.">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin's+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force.">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers.">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;&#946;+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor.">The &#945;&#946; T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li><li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers.">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li><li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions.">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+Systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li><li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay.">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo lavoro si usa una trappola ottica di catturare patogeni con dimensioni tra i 3 micron - 5 micron. Anche se gli agenti patogeni di interesse al nostro laboratorio hanno tipicamente queste dimensioni, il sistema di pinzetta ottica qui descritto è flessibile per intrappolare una vasta gamma di formati. In realtà le trappole ottiche sono stati utilizzati per catturare le particelle che vanno da singoli atomi alle cellule di circa 10 micron di diametro. Inoltre, questo sistema di intrappolamento ottico è in grad...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> Ceppo albino, B-5233/RGD12-8, dono di KJ Kwon-Chung, NIH </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B mutante, dono di Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 ceppo, dono di Gerald Fink, Whitehead Institute </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimetilformammide </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Sangue fresco </td><td></td><td></td><td> Dono di RJW Heath, MGH, HMS </td></tr><tr><td> Nikon microscopio invertito </td><td> Nikon </td><td></td><td> Modello Ti-E </td></tr><tr><td> Laser trapping, ChromaLase </td><td> Blue Sky di ricerca </td><td> CLAS-106-STF02-02 </td><td></td></tr><tr><td> Eccitazione laser a fluorescenza </td><td> Coerente </td><td></td><td> Modello Innova 70C </td></tr><tr><td> Basette per i componenti cattura </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> Ottica aria tavolo </td><td> Tecnico Manufacturing Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Otturatore elettronico con comando a pedale </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> Acquistato da Associates Vincent, Rochester, NY </td></tr><tr><td> Fibra ottica monomodale </td><td> Oz Ottica </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra posizionatore </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> Fibra collimatore </td><td> Oz Ottica </td><td> HPUCO-23-1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> Lenti per telescopio </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> Lunghezza focale di 150 mm </td></tr><tr><td> Fasi di traduzione (x, y, z) </td><td> Newport </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR specchio dicroico </td><td> Chroma </td><td> ET750-sp-2P8 </td><td></td></tr><tr><td> Della lente dell&#39;obiettivo (100X) </td><td> Nikon </td><td></td><td> NA = 1.49, immersione in olio, obiettivo TIRF </td></tr><tr><td> Testa confocale </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> Polarizzatore </td><td> Nikon </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> Prisma Wollaston </td><td> Nikon </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> Ruota portafiltri </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> Ruota portafiltri </td><td> Sutter </td><td> LB10-NWE </td><td></td></tr><tr><td> Chambered coprioggetti </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> Rivestiti con anti-CD3 </td></tr><tr><td> Medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (Hyclone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

Immagini dinamiche delle cellule vive permette la visualizzazione diretta in tempo reale delle interazioni tra le cellule del sistema immunitario 1, 2, tuttavia la mancanza di controllo spaziale e temporale tra la cellula fagocitica e microbo ha reso focalizzato osservazioni sulle interazioni iniziale di risposta dell&#39;ospite ad agenti patogeni difficili. Storicamente, gli eventi di contatto intercellulare come la fagocitosi 3 sono stati ripreso miscelando due tipi di cellule, e poi continuo la scansione del campo visivo per trovare serendipitous contatti intercellulari nella fase appropriata di interazione. La natura stocastica di questi eventi rende questo processo noioso, ed è difficile osservare gli eventi in anticipo o in fugace contatto cellula-cellula da questo approccio. Questo metodo richiede trovando le coppie di cellule che sono sul punto di contatto, e osservando loro fino a quando consumato il loro contatto, o non. Per far fronte a queste limitazioni, usiamo trapping ottico come un non-invasivo, il metodo non distruttivo, ma veloce ed efficace per posizionare le cellule in coltura. Trappole ottiche o pinzette ottiche, sono sempre più utilizzati nella ricerca biologica per catturare e manipolare le cellule fisicamente e altri micron di particelle di dimensioni in tre dimensioni 4. Pressione di radiazione è stato osservato e applicato ai sistemi pinzetta ottica nel 1970 5, 6, e fu usato per controllare campioni biologici nel 1987 7. Da allora, pinzette ottiche hanno maturato in una tecnologia per sondare una varietà di fenomeni biologici 8-13. Descriviamo un metodo 14 che avanza dal vivo imaging cellulare, integrando una trappola ottica con la filatura microscopia confocale disco con controllo di temperatura e umidità per fornire squisita controllo spaziale e temporale di organismi patogeni in un ambiente fisiologico per facilitare le interazioni con le cellule ospiti, come determinato dal operatore. Live, gli organismi patogeni come Candida albicans e Aspergillus fumigatus, che può causare potenzialmente letale, infezioni invasive nei soggetti immunocompromessi 15, 16 (ad esempio l&#39;AIDS, chemioterapia, pazienti e organo trapianto), erano intrappolati otticamente con tecniche non distruttive intensità laser e si è trasferito adiacente al macrofagi, in grado di fagocitare l&#39;agente patogeno. Alta risoluzione, filmati luce trasmessa e fluorescenza basato stabilito la capacità di osservare gli eventi iniziali della fagocitosi nelle cellule viventi. Per dimostrare l&#39;applicabilità ampio in immunologia, primario cellule T sono stati intrappolati e manipolati per formare sinapsi con anti-CD3 microsfere rivestite in vivo, e time-lapse imaging di formazione di sinapsi è stato ottenuto. Fornendo un metodo per esercitare avere un controllo spaziale di agenti patogeni vivono rispetto alle cellule immunitarie, le interazioni cellulari possono essere catturate al microscopio a fluorescenza con perturbazione minima di cellule e può produrre una potente visione prime risposte dell&#39;immunità innata e adattativa.

Watch this Scientific Journal Video about Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging at JoVE.com

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Un metodo è descritto per selezionare individualmente, manipolare e agenti patogeni immagine dal vivo utilizzando una trappola ottica accoppiato ad un microscopio a disco rotante. La trappola ottica fornisce il controllo spaziale e temporale di organismi e li adiacenti alle cellule ospite. Microscopia a fluorescenza cattura le interazioni intercellulare perturbazione con minimo di cellule.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

use-an-optical-trap-for-study-host-pathogen-interactions-for-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Un metodo è descritto per selezionare individualmente, manipolare e agenti patogeni immagine dal vivo utilizzando una trappola ottica accoppiato ad un microscopio a disco rotante. La trappola ottica fornisce il controllo spaziale e temporale di organismi e li adiacenti alle cellule ospite. Microscopia a fluorescenza cattura le interazioni intercellulare perturbazione con minimo di cellule.

Video: Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

Realizzazione di superfici di vetro di qualità ottica per studiare macrofago Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infezione delle larve di zebrafish con spore di Aspergillus per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...