Questo lavoro è stato sostenuto dalla &quot;Agence Nationale de la Recherche&quot; concedere ANR-09-JCJC-0117-01 e &quot;Neuropôle de Recherche Francilien-NERF&quot; sovvenzione per Romain Chery. Ringraziamo Françoise Lefebvre per lo sviluppo software in C + + / Qt, e Laurent Pinot e Battista Janvier per contribuire allo sviluppo della configurazione di imaging ottico.

1. Preparare l&#39;animale per l&#39;imaging (in conformità alle raccomandazioni europee per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, direttiva 86/609/CEE) <ol><li> 6 a 8 settimane vecchia C57BL6 topi maschi sono anestetizzati con un cocktail di ketamina (10mg/kg) e xilazina (100mg/kg) iniettato intraperitonealy. Chirurgia inizia quando il mouse non risponde più alle hindpaw pizzico. Durante l&#39;esperimento tutto l&#39;animale è collocato su una piastra elettrica. La temperatura corporea viene continuamente monitorata e mantenuta a 37 ° C. Profondità dell&#39;anestesia è mantenuta per tutta la chirurgia e la sessione di imaging, consulta l&#39;assenza di arto ritirarsi. Una iniezione sottocutanea di 20% del cocktail iniziale anestetico somministrato in caso contrario. </li><li> Utilizzando Clippers, togliere i capelli dal cuoio capelluto. Pulire la pelle esposta dai capelli residui utilizzando una garza sterile imbevuta con soluzione fisiologica. </li><li> Posizionare il mouse nel frame stereotassico. Il muso deve essere sullo stesso piano, come la parte posteriore della testa,al fine di impostare la superficie del bulbo olfattivo rispetto al piano orizzontale. Fissare saldamente l&#39;orecchio e naso bar al fine di evitare movimenti durante l&#39;imaging. </li><li> Applicare una pomata oftalmica sugli occhi dell&#39;animale per evitare l&#39;essiccazione e il dolore. </li><li> Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici con 70 etanolo ° e la zona del cuoio capelluto con spazza successivi di Betadine. </li><li> Per rimuovere la pelle che ricopre il cranio, inizia facendo un&#39;incisione nella pelle con le forbici nella parte posteriore della testa tra le orecchie. Poi tagliate in entrambi i lati verso la base dell&#39;orecchio e in direzione antero-posteriore verso la fronte lungo le palpebre. Completare la rimozione del cuoio capelluto, tagliando la pelle sulla parte superiore del muso vicino al bar naso. </li><li> Sotto osservazione binoculare, utilizzare un tampone di cotone imbevuto con soluzione salina per staccare delicatamente il periostio sulla parte superiore del cranio. Usare un paio di pinze per rimuovere il tessuto residuo e grattare la superficie del cranio con un bisturi ad avere una preparazione pulita. </li><li>L&#39;OB è una struttura simmetrica composta da due hemibulbs che si trovano tra le palpebre. Essi sono limitati nel rostrale e nella direzione caudale di un seno venoso, e separato dalla sutura sagittale. Posizionare un pezzo di spugna di gelatina assorbibile imbevuto di acqua distillata con l&#39;osso al di sopra della OB. E &#39;importante mantenere questa zona dell&#39;osso umida tutto l&#39;esperimento. </li></ol> 2. Preparazione della finestra del cranio <ol><li> Rimuovere la spugna di gelatina e iniziare a raschiare delicatamente l&#39;osso con n ° 10 bisturi. Mantenere un angolo costante di 45 ° tra la lama e l&#39;osso, e spostare la lama dalle palpebre al lato sagittale della zona dei tulipani. Non applicare una pressione verticale sull&#39;osso o graffiare l&#39;osso al di sopra del seno venoso. </li><li> Durante il processo di assottigliamento, fermano ogni 5 minuti e posto una spugna di gelatina idratata con l&#39;osso per raffreddare la preparazione. Tampone del cranio con la spugna per rimuovere la polvere ossea. </li><li> Tenere spazzamento eraffreddamento in alternativa fino a visualizzare il trabecole, lo strato di osso spugnoso. La vascolarizzazione fine della OB deve essere visibile in questa fase. Smettere di graffiare l&#39;osso, e iniziare a usare il bisturi di punta perpendicolarmente a &quot;disegnare&quot; un&#39;area rettangolare che racchiude la OB. In questa fase n ° 11 bisturi può essere utilizzato. Mantenere l&#39;intervento entro i limiti dei seni venosi che dovrebbe essere sicuro di ictus bisturi. </li><li> Scavare la trincea formata a poco a poco rettangolare con movimenti successivi del bisturi. Pulire la punta del bisturi periodicamente per pulirla e mantenerla forte. Prestare estrema attenzione la profondità della punta per evitare di toccare la superficie dura. </li><li> Per avere un&#39;idea dello spessore dell&#39;osso residuo, spingerlo delicatamente con la punta di un paio di pinze. Se le pieghe lembo osseo sotto pressione, passare alla fase successiva. </li><li> Sotto una goccia di soluzione salina, utilizzare la punta del bisturi orientata orizzontalmente per sollevare il lembo osseo. La rimozione del lembo deve essere fatto carefully per evitare di strappare fuori l&#39;osso residuo. </li><li> Una volta che la superficie della OB è esposto, per verificare l&#39;assenza di sanguinamento o di anastomosi vasi sanguigni. Ferendo la durata o la superficie del tessuto ridurrà la possibilità di ottenere segnali ottici. Pulire l&#39;area con una spugna di gelatina imbevute di soluzione salina in modo da mantenere umido il bulbo. </li><li> Applicare poliacrilato cemento dentale per formare un pozzo con l&#39;osso intorno alla finestra. </li><li> Mettere una goccia di agarosio a basso punto di fusione (1,2%) rispetto al Dura, e mettere un bicchiere sterile coprire le dimensioni della finestra. Durante la sessione di imaging, una piccola quantità di agarosio possono essere aggiunti al fine di compensare l&#39;essiccazione. Agarosio impedirà l&#39;OB di muoversi con la respirazione e fornirà una superficie piana per l&#39;imaging ottico. </li></ol> 3. L&#39;imaging ottico di configurazione per la mappatura attività olfattiva <ol><li> La stimolazione olfattiva deve essere definita con precisione nel tempo e l&#39;intensità con l&#39;uso di un olfattometro. Noi usiamo una versione personalizzata modificata del sistema di perfusione multivial Valvebank 8II da automatizzare scientifico associato ad una base compressore d&#39;aria (aria compressa respirabile sarebbe adatta pure). Questo sistema consente una accurata e veloce controllo della valvola esterna. Le soluzioni di odorizzante puri sono diluiti in olio minerale alla concentrazione scelto. Per attivare le aldeidi dorsale OB come esanale sono comunemente usati. Un volume preciso di odorizzante diluito (20 a 50μl) viene caricato su una carta da filtro e posto in un serbatoio siringa. Attraverso il sistema di perfusione, l&#39;aria a pressione controllata viene consegnato al sistema, garantendo una velocità costante di consegna odorizzato flusso d&#39;aria al naso degli animali durante l&#39;apertura della valvola. Odorizzante viene fornito attraverso un tubo Tygon R-3603 vuoto (Saint-Gobain Corporation) che trasportano l&#39;aria ad un flusso di ~ 1000ml/min. Evitare la contaminazione tra odoranti e quantità residue di odorizzante nel tubo. Se disponibile, la riproducibilità dello stimolo odorizzante può essere Controriempito attraverso l&#39;utilizzo di un rilevatore a ionizzazione di fiamma (microFID Photovac 2020). </li><li> La configurazione ottica è acceso. Si tratta di una raffreddata interlacciata 12 bit CCD (ORCA Hamamatsu AG) associato ad un stereomicroscopio a fluorescenza (Leica MZ16), un olfattometro controllato dal computer e le lampade eccitazione stabilizzata con opportuni filtri passa-banda interferenze. Uno schema che descrive la nostra impostazione è fornito in figura 2. Per intrinseca segnali ottici Imaging (IOSI), una lampada alogena da 200W tungsteno (Oriel QTH) accoppiato con un leggero anello in fibra (Schott) inserito intorno all&#39;obiettivo del microscopio sono utilizzati per fornire un&#39;illuminazione stabile e uniforme. Per flavoproteina autofluorescenza Segnali Imaging (FASI), una lampada a ioduri metallici da 150W (Leica) con un 5 millimetri guida luce liquida core forniscono anche l&#39;eccitazione della fluorescenza localizzata attraverso l&#39;epi-illuminazione porta dello stereomicroscopio. Acquisizione delle immagini e la sincronizzazione hardware sono realizzati da software personalizzato. L&#39;open source Micromanager software può essere utilizzato anche per controllare la configurazione ottica e l&#39;acquisizione. </li></ol> 4. Imaging ottico <ol><li> Collocare il telaio stereotassico con lo stereomicroscopio, la finestra del cranio centrato nel campo visivo (vedi fig. 2A per uno schema del setup ottico). </li><li> Tune il microscopio per concentrarsi sui capillari. Prima di prove di stimolazione (vedi descrizione in 5) l&#39;immagine della lampadina è adottata ai sensi 560nm (verde) luce (anello in fibra), che fornisce un buon contrasto per l&#39;imaging dei vasi sanguigni. Questa immagine è usata come controllo anatomico per verificare lo stato della preparazione e viene acquisita più volte durante l&#39;esperimento. </li><li> IOS per l&#39;imaging, l&#39;intensità della luce riflessa viene registrata dalla telecamera CCD con 630 + / -10 nm (rosso) illuminazione. Le immagini sono acquisite al full frame (senza binning) a 5 fotogrammi al secondo, che corrispondono ad un tempo di esposizione di circa 150ms. Potenza della sorgente luminosa deve essere regolata di nuovo<html> gni livelli di grigio di almeno ~ 3000 sull&#39;area OB, vicino alla saturazione dei pixel del CCD pozzi. In questo modo permette di sfruttare le dinamiche 12bits del CCD per catturare i cambiamenti di intensità debole durante l&#39;attivazione. Massimo IOS raggiungere ampiezze ~ 1%. </li><li> FAS per imaging di fluorescenza è acquisito in virtù di eccitazione di 480nm + /-20 nm (blu) luce epiflurorescence. Un filtro passa-alto a 515 Nm è impostato per catturare la luce. Le immagini sono acquisite a 5 fotogrammi al secondo con un binning di 4 per 4 per massimizzare la sensibilità. Luce potenza di eccitazione viene regolata in modo simile a IOS con livelli di grigio di 3000 sull&#39;area OB. Massime ampiezze FAS raggiungere ~ 3%. Per entrambe le modalità di imaging, la profondità di campo nel piano soggetto è lo stesso ed è stata misurata a 0,5 mm per un ingrandimento di circa 4 volte. </li><li> La luce deve essere spenta tra le prove di imaging per evitare il riscaldamento e photobleaching della preparazione. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Imaging prove <ol><li> Sessione di imaging standard incluso una base di 5 a 10 secondi in cui viene consegnata solo aria, seguita dalla stimolazione odore per 3 a 10s a seconda della concentrazione di odore scelto, e 70 a 82s sono ulteriormente registrati con un flusso d&#39;aria costante per il recupero di base (Fig. 2A). Al termine della prova, la luce si spegne e l&#39;aria pura viene consegnato per la durata tra l&#39;intervallo di prova (da 1 a 3 minuti) per lavare le molecole degli odori residui ed evitare assuefazione sensoriale. Prove degli odori sono alternate a prove vuoto (portata d&#39;aria). </li><li> Odori evocati zone attivate sono visualizzati come aree grosso modo sferica sulle mappe e corrispondono alle dimensioni dei singoli glomeruli (80 per 200μm di diametro 9). L&#39;elaborazione delle immagini è spiegato in figura 2B. Mappe olfattive sono presentati in Figura 3. Contrariamente a qualsiasi altro sistema sensoriale, il rapporto segnale-rumore in OB è stato sufficiente a risolvere odori evocati risposte in studi singoli (Fig. 3B per IOS e fig. 3D per FAS). </li><li> I topi sono eutanasia immediatamente al termine della sessione di imaging con metodi in accordo alle raccomandazioni europee per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. </li></ol> 6. Risultati rappresentante (vedi mappe olfattive in figura 3): <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" /> Figura 1 L&#39;organizzazione strutturale del bulbo olfattivo principale nei roditori. Neuroni sensoriali olfattivi, le cellule sensoriali primarie trova nell&#39;epitelio olfattivo principale, esprimono lo stesso recettore olfattivo e convergono sullo stesso glomeruli nel OB. Glomeruli olfattivi, la forma circolare neuropils (cerchi tratteggiata), si trovano sulla superficie della OB. Si noti che una rete molto fitta e complessa vascolare è presente a livello glomerulare. Abbreviazioni (top / down): ONL: strato nervo olfattivo; GL: strato glomerulare, EPL: strato esterno plessiforme; MCL:cellula mitrale strato; GCL: strato di cellule dei granuli. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" /> Figura 2 Riflettanza e segnali di fluorescenza di registrazione in vivo. A. grandangolari configurazione imaging ottico. Il cervello di un topo anestetizzato è esposto a uno rosso (IOS) o blu (FAS), sia la luce attraverso un anello in fibra anulare attaccato alla lente ottica o un epi-illuminazione porta di un microscopio. Gli odori vengono caricati in fiale sigillate e odorizzato aria è consegnato al naso animale (verde chiaro: aprire la valvola). B. Registrazione di protocollo e l&#39;elaborazione dei dati. IOS e FAS vengono registrati come serie di prove individuali (anni 90 di durata). Il grafico mostra la linea temporale di un singolo trial: linea di base varia da 5 a 10 s, la stimolazione da 3 a 10 s, e ritornano ai valori basali da 70 a 82s. Elaborazione di immagini richiede pixel per pixel sottrazione di valori di intensità durante la linea di base di valori di intensità durante i periodi di stimolazione (per il FAS) or stimolazione più ritornano ai valori basali (per IOS). Questa differenza viene poi divisa per valori di base per ottenere una variazione% (vedi immagini risultanti in fig. 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" /> Figura 3 Odor-evocata mappe attività nel OB con IOS e FAS imaging. A. vascolarizzazione della dorsale OB visualizzati sotto la luce verde. AC. IOS ripreso (prova unica o tre prove rispettivamente in media) per una presentazione 10s del 20% esanale. Frecce bianche indicano le regioni sferiche di interesse attivati ​​da questo odore. Queste mappe di attivazione sono stati ottenuti utilizzando le cornici media durante il primo secondo dopo la fine della stimolazione odore (massimo di variazione riflettanza -0,63% a -0,52% A e in B). Nota le zone nere dell&#39;assorbanza in cui attivazione odore si è verificato. CD. FAS ha acquisito in modo sequenziale nel topo lo stesso per l&#39;odorizzante stesso (prova unica o tre prove media rispettivaly). Queste mappe di attivazione sono stati ottenuti utilizzando le cornici media durante il primo secondo dopo l&#39;inizio della stimolazione odore (massimo di fluorescenza variazione 0,72% in D e 0,66% di E). Si noti che le zone bianche di emissione autofluorescenza indicato da frecce nere corrispondono alle zone in nero IOS. L&#39;aspetto granuloso visto nella mappa FAS è dovuto alle 4 di 4 binning necessari per il miglioramento della sensibilità. Immagini FAS non sono stati corretti da autofluorescenza sbiancamento. Dimensioni effettive delle immagini ESSERE: 0,7 mm di larghezza x 1,2 mm di lunghezza.

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	<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb.">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li><li>Chance, B., Cohen, P., J&amp;246, b. s. i. s., &amp;amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo.">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li><li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence.">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. 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Lett. 28, 28-30 (2003).</li><li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain:+insights+from+Monte+Carlo+simulations.">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).</li><li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+the+olfactory+bulb+activation:+influence+of+realistic+differential+pathlength+correction+factors+on+the+derivation+of+oxygenation+and+total+hemoglobin+concentration+maps+(Proceedings+Paper).">Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper).</a> , (2011).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo articolo presentiamo IOS e FAS per le tecniche di imaging nelle registrazioni in vivo di odori evocati attività nel OB mouse. Per raggiungere questo obiettivo relativamente semplice ed economico a grande campo di impostazione imaging ottico è necessario. L&#39;acquisizione dei dati di imaging richiede una formazione di eseguire le procedure chirurgiche multa ed evitare qualsiasi danno alla dura madre o tessuto cerebrale. In particolare, le emorragie maggiori in grado di assorbire fotoni registrato per l&#39;imaging e alla fine dell&#39;esperimento. Uno dei vantaggi di IOS e FAS di imaging è quello di evitare l&#39;iniezione di traccianti fluorescenti che potrebbero causare tossicità cellulare o effetti collaterali indesiderati. Essi permettono di affrontare le questioni sulle mappe olfattive così codifica spaziale di stimoli sensoriali. Contrariamente a 2-desossiglucosio imaging, che forniscono la possibilità di odori immagini diverse in un singolo animale. Tuttavia, poiché la penetrazione PM è limitata nel tessuto, IOS e FAS sono limitati alla parte dorsale del OBe non possono essere registrate dalle regioni ventrale. Endogena di imaging segnale ottico offre un eccellente risoluzione spaziale per imaging in vivo. Tecnico calcoli riguardare il miglioramento quantitativo dei componenti vascolari nella riflettanza segnali 8,9 così come dinamica di ossigenazione del sangue e del volume durante l&#39;attivazione sensoriale 10. Lunghezza d&#39;onda multipla di immagini di IOS approcci di imaging sono attualmente sviluppate nel nostro laboratorio per quantificare completamente concentrazione totale di emoglobina e l&#39;ossigenazione nel OB durante l&#39;attivazione sensoriale. Queste misurazioni spettroscopiche ottiche aggiunto al FAS immagini daranno la possibilità di rispondere il rapporto irrisolto tra la dinamica vascolare e intracellulari durante l&#39;attivazione sensoriale 11,12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di The Regent </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Imalgene </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio, tipo III-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9793-50G </td></tr><tr><td> Esanale 98% </td><td> Aldrich </td><td> 115606-100ML </td></tr></tbody></table>

imaging odor-evoked activities in the mouse olfactory bulb using optical reflectance and autofluorescence signals

Nel cervello, la stimolazione sensoriale attiva distribuite popolazioni di neuroni tra i moduli funzionali che partecipano alla codifica dello stimolo. Funzionali tecniche di imaging ottico sono vantaggiose per visualizzare l&#39;attivazione di questi moduli in cortecce sensoriali ad alta risoluzione spaziale. In questo contesto, endogene segnali ottici che derivano da meccanismi molecolari legati alla neuroenergetics sono fonti preziose di contrasto per registrare le mappe spaziali degli stimoli sensoriali sui campi largo nel cervello dei roditori. Qui vi presentiamo due tecniche in base alle modifiche del endogena proprietà ottiche del tessuto cerebrale durante l&#39;attivazione. In primo luogo i segnali intrinseci ottico (IOS) sono prodotte da una alterazione locale di riflessione della luce rossa a causa di: (i) l&#39;assorbimento da cambiamenti nel livello di ossigenazione del sangue e del volume del sangue (ii) scattering fotone. L&#39;uso di IOS in vivo per registrare le mappe spaziali iniziato a metà degli anni 1980 con la observatiin ottica di mappe di barili baffi nel ratto e le colonne orientamento nel gatto corteccia visiva 1. Immagini IOS della superficie del bulbo olfattivo principale roditori (OB) in risposta alla odori fu poi dimostrato dal gruppo di Larry Katz 2. Il secondo approccio si basa su segnali di autofluorescenza flavoproteina (FAS) a causa di cambiamenti nello stato redox di questi intermedi del metabolismo mitocondriale. Più precisamente, la tecnica si basa sulla fluorescenza verde a causa dello stato ossidato di flavoproteine ​​quando il tessuto è eccitata con luce blu. Anche se questi segnali erano probabilmente tra le prime molecole fluorescenti registrato per lo studio dell&#39;attività cerebrale dagli studi pioniere della probabilità Britton e colleghi 3, non è stato fino a poco tempo che sono stati utilizzati per la mappatura di attivazione cerebrale in vivo. FAS di imaging per la prima volta applicato alla corteccia somatosensoriale nei roditori in risposta alla stimolazione hindpaw dal gruppo Katsuei Shibuki 4. Il sistema olfattivo è di fondamentale importanza per la sopravvivenza della stragrande maggioranza delle specie viventi perché permette di rilevazione efficiente e l&#39;identificazione delle sostanze chimiche nell&#39;ambiente (cibo, predatori). L&#39;OB è il primo relè di elaborazione delle informazioni olfattivo nel cervello. Riceve proiezioni afferenti dai neuroni olfattivi sensoriali primarie che consentono di rilevare le molecole odoranti volatili. Ogni neurone sensoriale esprime un solo tipo di recettore olfattivo e dei neuroni che trasportano lo stesso tipo di recettore inviano i loro processi nervosi allo stesso ben definito microregioni di ~ 100μm 3 costituito da neuropilo discreto, il glomerulo olfattivo (Fig. 1). Negli ultimi dieci anni, IOS di imaging ha favorito l&#39;esplorazione funzionale del OB 5, 6, 7, che è diventato una delle strutture più studiati sensoriale. La mappatura delle attività di OB con FAS di imaging non è stata ancora eseguita. Qui, we mostrano i passi successivi di un protocollo efficace per IOS e FAS di imaging per mappare odori evocati attività nel OB mouse.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Questo articolo presenta i protocolli di intrinseca segnali ottici e flavoproteine ​​autofluorescenza di imaging per mappare segnali odori evocati attività sulla superficie del bulbo olfattivo nel topo.

Le attività di imaging Odore-Evocati nel bulbo olfattivo del mouse utilizzando riflettanza ottica e segnali autofluorescenza

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K Views.  UMR8165 Université Paris Sud 11, Paris Diderot 7 – CNRS. Questo articolo presenta i protocolli di intrinseca segnali ottici e flavoproteine ​​autofluorescenza di imaging per mappare segnali odori evocati attività sulla superficie del bulbo olfattivo nel topo.

Video: Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

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Neuroscienze

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

La valutazione simultanea di Emodinamica cerebrale e Light Scattering proprietà del<em&gt; In Vivo</em&gt; Cervello del cervello usando l&#39;imaging di riflessione diffusa multispettrale

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...