이 작품은 &quot;회사 직원 Nationale 드 라 공들인&quot;부여 ANR - 09 - JCJC - 0117-01와 로맹 Chery에 대해 &quot;Neuropôle 드 공들인 Francilien - NERF&quot;부여합니다. 지원했습니다 우리는 C + + / Qt는에있는 소프트웨어 개발을위한 프랑소의 Lefebvre 감사 및 광학 이미징 설정의 개발에 도움 로랑 피노와 얇은 평직의 무명 안토니오.

1. (실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽의 권고에 따라, 86/609/EEC 지시문) 이미징을위한 동물 준비 <ol><li> 6~8주 오래된 C57BL6 남성 쥐들이 intraperitonealy 주입 케타민을 (10mg/kg)과 xylazine (100mg/kg)의 칵테일과 함께 anesthetized 있습니다. 마우스가 더 이상 핀치를 hindpaw에 응답 없을 때 수술이 시작됩니다. 전체 실험 기간 동안 동물은 가열 패드에 배치됩니다. 체온이 지속적으로 모니터 37에서 관리하고 있습니다 ° C. 마취의 심도는 사지의 부재 철회를 확인하여 수술 및 이미징 세션을 통해 유지됩니다. 초기 마취 칵테일의 20 %의 피하 주사가 다르게 관리됩니다. </li><li> 가위를 사용하여 두피에서 머리카락을 제거합니다. 식염수에 담가 멸균 거즈를 사용하여 잔류 머리에서 노출된 피부를 청소합니다. </li><li> stereotaxic 프레임에서 마우스를 놓으십시오. 주둥이는 머리의 뒤쪽과 같은 비행기에한다수평으로 후각 망울의 표면을 설정하기 위해서. 이미징하는 동안 움직임을 방지하기 위해 단단히 귀 및 코 막대를 고정합니다. </li><li> 건조하고 고통을 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 70 °의 에탄올과 betadine의 연속 감시 장치로 두피 지역 모든 수술기구를 소독. </li><li> 두개골을 덮고있는 피부를 제거하려면 귀 사이 머리의 뒤쪽에서 가위로 피부에 절개를하여 시작합니다. 그런 다음 귀의 기본 방향과 눈꺼풀을 따라 이마쪽으로 anteroposterior 방향으로 양쪽에서 했네요. 코 표시줄에 가까운 주둥이 위에 피부를 절단하여 두피를 제거 완료. </li><li> 쌍안경 관측에서 부드럽게 두개골의 상단에있는 골막을 분리하기 위해 식염수에 담가 면봉을 사용합니다. 나머지 조직을 제거하고 깨끗한 준비를 위해 메스로 두개골의 표면을 긁어 포셉 한 쌍의을 사용합니다. </li><li>OB는 눈꺼풀 사이에 위치 두 hemibulbs 구성된 대칭 구조입니다. 그들은 정맥 부비동 (副 鼻 洞)에 의해 주동이의와 꼬리 방향으로 제한하고, 화살 봉합사로 구분됩니다. OB 위의 뼈에 증류수로 적셔 흡수성 젤라틴 스폰지 조각을 넣으십시오. 실험에 걸쳐이 골 지역 촉촉한 유지하는 것이 중요합니다. </li></ol> 2. 두개골 창문을 준비 <ol><li> 젤라틴 스폰지를 제거하고 부드럽게 N ° 10 메스 블레이드와 뼈 근근이 살아가고으로 시작합니다. 칼날과 뼈 사이에 45 °의 일정한 각도를 유지하고 눈꺼풀의 전구 지역의 화살쪽으로 칼날을 이동합니다. 뼈에 수직 압력을 적용하거나 정맥 구멍 위에있는 뼈 긁지 마라. </li><li> 숱이없는 과정마다 5 분을 중지하고 준비를 진정 뼈에 수산화 젤라틴 스폰지를 넣으시기 바랍니다. 면봉 뼈 먼지를 제거하는 스펀지와 두개골. </li><li> 전면 유지하고trabeculae, 해면 뼈 계층을 시각까지 또는 냉각. OB의 훌륭한 vasculature는이 단계에서 표시되어야합니다. 뼈를 긁적 중지하고, OB를 둘러싸고 사각형 영역을 &quot;그리는&quot;로 수직 메스의 팁을 사용하여 시작합니다. 이 단계에서 N ° 11 메스 블레이드를 사용할 수 있습니다. 모든 메스 뇌졸중의 안전한되어야 정맥 sinuses의 한계 내에서 수술을 보관하십시오. </li><li> 메스의 연속 동작을 사용하여 점진적으로 형성된 사각형 참호를 파다. 그것을 깨끗하게하고 날카로운 유지하기 주기적으로 메스의 끝부분을 닦아주십시오. 경질 표면을 만져 피하기 위해 팁의 깊이주의 추가한다. </li><li> 남아있는 뼈의 두께의 감각을 얻기 위해서, 포셉의 쌍 끝에 조심스럽게 밀어. 압력 아래에있는 뼈 플랩 폴드 경우, 다음 단계로 이동합니다. </li><li> 염분의 드롭에서 뼈 플랩을 세운 가로 메스 지향의 팁을 사용합니다. 플랩의 제거는 C를 할 수있다arefully 남은 뼈를 떼어 줘야하지 않도록합니다. </li><li> OB의 표면이 노출되면 어떤 출혈이나 혈관 교합 (anastomosis)의 부재를 확인합니다. 경질 또는 조직 표면을 손상하는 광학 신호를 얻기의 기회를 줄일 수 있습니다. 전구의 촉촉한을 유지하기 위해 식염수에 담가 젤라틴 스폰지와 지역을 닦아주십시오. </li><li> 창 주위 골에 우물을 형성 폴리 아크릴 산 치과 시멘트를 적용합니다. </li><li> 경질을 통해 낮은 용융 점 아가로 오스 (1.2 %)의 드롭를 삽입하고, 윈도우의 크기에서 멸균 덮개 유리를 넣어. 이미징 세션 동안, 아가로 오스의 작은 수량은 탈수를 보상하기 위해 추가할 수 있습니다. 아가로 오스는 호흡과 함께 이동에서 OB를 방지하고 광학 이미징을위한 평평한 표면을 제공합니다. </li></ol> 3. 후각 활동 매핑을위한 광학 이미징 설정 <ol><li> 후각 자극은 정확하게 olfactometer를 사용하여 시간과 강도에 정의된되어야합니다. 우리는 기본적인 공기 압축기 (압축 숨쉴만한 공기는 물론 적절한 것입니다)과 관련된 자동화 과학에서 multivial 재관류 시스템 Valvebank 8II의 사용자 지정 수정된 버전을 사용합니다. 이 시스템은 정확하고 빠른 외부 밸브 제어를 허용합니다. 순수 odorant의 솔루션은 선택한 농도의 미네랄 오일에 희석 수 있습니다. 같은 hexanal로 지느러미 OB aldehydes을 활성화하기 위해 일반적으로 사용됩니다. 희석 odorant (20 50μl)의 정확한 볼륨 필터 종이에로드되고 주사기의 저수지에 배치됩니다. 재관류 시스템을 통해, 압력 제어 공기 밸브 오프닝 기간 동안 동물의 코를 odorized 공기 유량 전달의 지속적인 속도를 보장 시스템에 전달됩니다. Odorant는 ~ 1000ml/min의 흐름 속도로 공기를 운반 Tygon R - 3603 진공 튜브 (세인트 - Gobain 주식 회사)를 통해 제공됩니다. 튜브에 odorants와 odorant의 잔여 수량 사이의 오염을 피한다. 가능한 경우, odorant의 자극의 재현성은 contro 수 있습니다불꽃 이온화 검출기의 사용 (microFID 2020 Photovac)를 통해 lled. </li><li> 광학 설정은 켜져 있습니다. 그것은 이루어진 인터 레이스 냉각 12 비트 형광 stereomicroscope (Leica MZ16), 컴퓨터 제어 olfactometer 적절한 밴드 패스 간섭 필터 안정화 여기 램프와 연결된 CCD 카메라 (오카 하마 마츠 AG). 우리의 설정을 설명하는 방식은 그림 2에 제공됩니다. 내장 광학 신호 이미징 (IOSI), 섬유 링 라이트 (SCHOTT)과 함께 200W 텅스텐 할로겐 램프 (출창 QTH)은도 안정적이고 조명을 제공하는 데 사용되는 현미경 목표 주변에 연결. Flavoprotein Autofluorescence 신호 이미징 (FASI), 5mm 핵심 액체 라이트 가이드와 150W 금속 할로겐화물 램프 (Leica)는 stereomicroscope의 에피 조명 포트를 통해 형광도화된 여기를 제공하십시오. 이미지 수집 및 하드웨어 동기화는 사용자 지정 소프트웨어에 의해 실현됩니다. 오픈의ource 소프트웨어는 또한 마이크로 광학 설치 및 수집을 제어하는​​ 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 4. 광학 이미징 <ol><li> stereomicroscope 아래 stereotaxic 프레임 (그림을 참조하십시오. 광학 설치의 구조에 대한 2A)보기의 분야에서 중심 두개골 윈도우를 놓습니다. </li><li> 모세 혈관에 초점 현미경을 조정. 이전 자극 실험으로 (5 설명 참조) 전구의 이미지는 혈관 이미징을위한 좋은 대조를 제공 560nm (녹색) 라이트 (광섬유 링) 아래 이루어집니다. 이 사진은 준비의 상태를 확인하는 해부학 제어로 사용하고 실험하는 동안 여러 번 획득합니다. </li><li> IOS 이미지 들면, 빛의 강도는 630 + / -10 NM (빨간색) 조명 아래의 CCD 카메라로 기록됩니다 반영됩니다. 이미지가 150ms 정도의 노출 시간에 해당하는 초당 5 프레임의 풀 프레임 (NO binning)에 인수하고 있습니다. 광원의 전원이 다시 조정됩니다<html> 가까운 픽셀 CCD 우물의 채도에 OB 지역에 적어도 ~ 3000의 ACH 회색 수준. 이렇게하면 인증 기간 동안 희미한 강도 변화를 포착하는 CCD의 12bits 역학을 활용하는 것이 가능합니다. 최대 IOS amplitudes에 도달 ~ 1 %. </li><li> FAS 이미징 형광 들어 480nm의 여기 + / - 20nm (파란색) epiflurorescence 조명에 따라 취득됩니다. 515nm의 높은 패스 필터는 빛을 포착하도록 설정되어 있습니다. 이미지 감도를 극대화 4로 4 binning와 초당 5 프레임에서 찾았습니다. 여기 라이트 전원은 OB 지역에있는 3000의 회색 수준 IOS와 비슷하게 조정됩니다. 최대 FAS amplitudes는 ~ 3 %에 도달. 두 이미징 modalities 들어, 제목 비행기에서 필드의 깊이는 동일하며 약 4 시간의 확대를위한 0.5 mm에서 측정되었다. </li><li> 라이트는 가열과 준비 photobleaching 피하기 위해 이미징 실험 사이에서 해제해야합니다. </li></ol>르 &quot;&gt; 5. 이미징 실험 <ol><li> 표준 영상 세션은 공기가 전달 10 초 5의 기준을 포함, 추가로 기준 복구를 위해 지속적인 공기 흐름 (그림과 함께 기록 선택한 악취 농도, 70 82s에 따라 10 초 3에 대한 악취 자극에 의해 다음 2A). 재판 끝에 빛이 꺼져 있고 순수한 공기가 잔류 냄새 분자를 씻고 감각 요법 이니을 피하기 위해 (1 3 분 소요) 간 시험 간격 기간 동안 제공됩니다. 악취 시련은 빈 실험 (공기 공급)와 인터리빙된되었습니다. </li><li> 냄새 evoked 활성 영역은지도에 대략 구형 영역으로 시각되며 개별 glomeruli (직경 9 80 200μm)의 크기에 해당한다. 영상 처리는 그림 2B에서 설명합니다. 후각지도를 그림 3에 제공됩니다. 다른 감각 시스템에 반대로, OB의 신호 대 잡음 비율 (싱글 시련의 냄새 evoked 답변을 해결하기 위해 충분한되었습니다그림. IOS와 그림에 대한 3B. FAS를위한 3D). </li><li> 마우스는 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 유럽의 권장 사항에 따라 방법을 사용하여 영상 세션이 끝날 때 즉시 euthanized있다. </li></ol> 6. 대표 결과 (그림 3 후각지도 참조) : <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" /> 설치류의 주요 후각 망울의 1 구조 조직을 그림. 후각 감각 뉴런, 메인 후각 상피에있는 기본 감각 세포가 같은 odorant 수용체를 표현하고 OB에서 동일한 glomeruli에 수렴. 후각 glomeruli, 둥근 모양의 neuropils는 (점선 원), OB의 표면에 위치하고 있습니다. 아주 밀도가 높으며 복잡한 혈관 네트워크가 사구체 수준에서 존재합니다. 약어 (위 / 아래) : ONL : 후각 신경 층, GL : 사구체 층, EPL : 외부 plexiform 층, MCL :승모판 세포 층, GCL : 과립 세포 계층. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" /> 그림 2 반사율과 생체내에 기록 형광 신호. A. 넓은 필드 광학 이미징 설정. anesthetized 마우스의 두뇌는 광학 렌즈 또는 현미경의 에피 조명 포트에 연결된 두 환상 섬유 링을 통해 빨간색 (IOS) 또는 파란색 (FAS) 조명 하나에 노출됩니다. 냄새는 밀폐 유리병에로드하고 odorized 공기는 동물 코로 전달된다 (녹색 표시등 : 개방 밸브). B. 녹음 프로토콜과 데이터 처리. IOS와 FAS은 개별 시험의 시리즈 (기간의 90 년대)로 기록됩니다. 그림은 하나의 재판 일정을 보여줍니다 : 기준 5에서 10 초, 10 초 3으로 자극하고, 70 82s으로 기준으로 돌아가 다릅니다. 이미지 처리 자극의 기간 동안 강도 값 기준 중 강도 값의 픽셀별로 픽셀 뺄셈 (FAS)을 O가 필요합니다R의 자극 기준 플러스로 돌아갑니다 (IOS에 대해). 이 차이는 다음 (그림의 결과 이미지를 참조하십시오. 3) %의 편차를 구하는 기준 가치로 나눈 값입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" /> 그림 3 냄새 evoked IOS와 FAS 이미징을 사용하여 OB의 활동지도. 지느러미 OB의 A. Vasculature 녹색 불빛 아래에서 시각. BC. 20 % hexanal의 10 초 프레 젠 테이션을위한 IOS 몇 군데 (각각 세 평균 시험 대비 단일 재판). 흰색 화살표는이 냄새에 의해 활성화된 관심의 구형 영역을 나타냅니다. 이러한 활성지도 프레임 (B A와 -0.52 %의 반사율의 변화 -0.63 %의 최대) 냄새 자극의 끝에 후 첫 초 동안 평균 사용 얻은했습니다. 냄새 활성화가 발생했습니다 흡광도의 블랙 영역을 확인합니다. CD. FAS는 (세명 평균 시련 각 대 한 재판 같은 odorant에 대해 동일한 마우스에 순차적으로 인수니). 이러한 활성지도 프레임 (형광 변화 D에 0.72 %와 0.66 % E에서 최대) 냄새 자극의 시작 후 첫 초 동안 평균 사용 취득했다. 검정색 화살표로 표시 autofluorescence 방출의 흰색 영역은 IOS의 검은 영역에 해당합니다. FAS지도에서 본 입자 측면은 감도의 향상에 필요한 4 binning으로 4 때문입니다. FAS 이미지는 autofluorescence은 표백에서 수정되지 않았습니다. 이미지의 실제 크기는 : 0.7 mm (폭) x 1.2 mm 길이.

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	<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb.">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li><li>Chance, B., Cohen, P., J&amp;246, b. s. i. s., &amp;amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo.">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li><li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence.">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. 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Lett. 28, 28-30 (2003).</li><li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain:+insights+from+Monte+Carlo+simulations.">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. 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우리는 공개 아무것도 없어.

이 문서에서 우리는 마우스 OB에서 냄새 evoked 활동의 생체내 레코딩에 대한 IOS와 FAS 이미징 기술을 제시한다. 이 목표를 달성하기 위해 비교적 간단하고 저렴 넓은 필드 광학 영상 설정이 필요합니다. 이미지 데이터의 수집은 미세 수술 절차를 수행하고 경질이나 뇌 조직에 어떤 부상을 피하기 위해 훈련이 필요합니다. 특히, 주요 출혈이 영상에 대해 기록된 광자를 흡수 실험을 종료합니다. IOS와 FAS 이미지 중 하나는 혜택은 세포 독성 또는 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수있는 형광 추적기의 주입을 방지하는 것입니다. 그들은 가능​​한 후각지도 감각 자극의 공간적 따라서 코딩에 대한 문제를 해결하기 위해합니다. 2 DeoxyGlucose 이미징 반대로, 그들은 하나의 동물에 이미지 몇 냄새로 가능성을 제공합니다. 광자 침투가 조직에 제한되기 때문에하지만, IOS와 FAS는 OB의 지느러미 부분에 제한됩니다그리고 복부 지역에서 기록하실 수 없습니다. 내생 광학 신호 이미징은 생체내 이미징의 우수한 공간 해상도를 제공합니다. 반사율의 혈관 부품의 기술 향상에 관심 정량 계산 감각 활성화 10시 8,9뿐만 아니라 혈액 산소와 볼륨의 역학을 신호. IOS 이미지 방식의 Multiwavelength 이미징은 현재 완전히 감각 활성화하는 동안 OB 총 헤모글로빈 농도와 산소를 정할 저희 연구실에서 개발된 있습니다. FAS 이미지에 추가이 spectroscopic 광학 측정 감각 활성화 11,12 중에 혈관과 세포 역학 사이의 미해결 관계를 응답 수있는 기회를 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 리젠트의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Imalgene </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> 바이엘 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스, 유형 III - A </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A9793 - 50g까지 </td></tr><tr><td> Hexanal 98% </td><td> 올드 리치 </td><td> 115606 - 100ML </td></tr></tbody></table>

imaging odor-evoked activities in the mouse olfactory bulb using optical reflectance and autofluorescence signals

두뇌에 감각 자극은 자극의 코딩에 참여 기능 모듈 간의 뉴런의 인구를 분산 활성화됩니다. 기능성 광학 이미징 기술은 높은 공간 해상도를 가진 감각 cortices에서 이러한 모듈의 활성화를 시각화에 유리하고 있습니다. 이러한 맥락에서, neuroenergetics에 연결된 분자 메커니즘에서 발생하는 내생 광학 신호는 쥐 두뇌에서 다양한 분야를 통해 감각 자극의 공간적지도를 기록하는 대조의 귀중한 자원입니다. 여기, 우리는 활성화하는 동안 뇌 조직의 내생 광학 특성의 변화에​​ 따라 두 가지 기술을 제시한다. 먼저 내장 광학 신호 (IOS)는로 인해 붉은 빛의 반사율에 지역 변경에 의해 생산 (I) 흡수 혈액 산소 수준과 혈액 볼륨 (2) 광자 산란의 변화에​​ 의해. 공간지도를 기록하는 생체내 IOS에의 사용은 1980 년대 중반 observati으로 시작고양이 시각 피질 1 쥐, 오리 엔테이션 열에 수염 배럴의 광학적지도에. odorants에 대응 설치류 주요 후각 망울 (OB)의 표면 IOS 이미징은 나중에 래리 카츠의 그룹 2로 입증되었다. 두 번째 접근 방식은 다음과 mitochondrial 신진 대사 중간체의 산화 환원 상태의 변화로 인해 flavoprotein autofluorescence 신호 (FAS)에 의존합니다. 더 정확하게, 기술은 조직이 푸른 불빛과 함께 기쁘게 생각합니다 flavoproteins의 산화 상태로 인해 녹색 형광을 기반으로합니다. 이러한 신호가 Britton의 기회와 동료 3의 선구자 연구에서 뇌 활동의 연구에 대해 기록된 최초의 형광 분자 간의 아마도했지만, 그것은 그들이 생체내 뇌 활성화의 매핑에 사용되는 것으로 최근까지되지 않았습니다. FAS 이미징 먼저 Katsuei Shibuki의 그룹 4로 hindpaw의 자극에 대한 응답으로 설치류의 somatosensory 피질에 적용되었다. 그것은 환경에서 화학 물질의 효율적인 탐지 및 식별 (음식, 육식)을 수 있기 때문에 후각 시스템은 살아있는 인류의 대다수의 생존을위한 중앙 중요하다. OB는 두뇌의 후각 정보 처리의 첫 번째 릴레이입니다. 그것은 휘발성 odorant 분자를 감​​지 후각 감각 뉴런에서 주 수입 성의 전망을받습니다. 각각의 감각 신경 세포가 ~ 100μm 3 같은 잘 정의된 microregions 자신의 신경 프로세스를 보내는 수용체의 동일한 유형을 가지고 odorant 수용체와 신경의 한 유형 이산 neuropil, 후각 glomerulus (그림 1)의 형성을 표현합니다. 지난 10 년, IOS 영상은 가장 공부 감각 구조 중 하나가 가지고있는 OB 5, 6, 7의 기능 탐사를 육성하고 있습니다. FAS 이미지와 OB 활동의 매핑은 아직 수행되지 않았습니다. 여기, WE 마우스 OB에서 냄새 evoked 활동을지도하기 위해 IOS와 FAS 이미징을위한 효율적인 프로토콜의 연속 단계를 보여줍니다.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

이 문서는 생쥐의 후각 망울의 표면에지도 냄새 evoked 활동에 고유 광 신호와 flavoproteins autofluorescence 신호 이미징의 프로토콜을 제공합니다.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K 조회수.  UMR8165 Université Paris Sud 11, Paris Diderot 7 – CNRS. 이 문서는 생쥐의 후각 망울의 표면에지도 냄새 evoked 활동에 고유 광 신호와 flavoproteins autofluorescence 신호 이미징의 프로토콜을 제공합니다.

비디오: Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

연구

신경과학

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

대뇌 혈류와의 광 산란 특성을 동시에 평가<em&gt; 생체</em&gt; 다중 스펙트럼 확산 반사 이미징을 이용한 쥐 뇌

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...