Questo lavoro è stato sostenuto dal Office of Naval Research via US Naval Research Laboratory fondi core.

1. Sonde LNA e disegno sperimentale <ol><li> Disegno sonde LNA che sono il complemento inverso del vostro Srna trascritto / mRNA o li hanno progettati su misura a <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Se si utilizza l&#39;opzione personalizzata di progettazione, si conosce la sequenza, ma non il modello spiking LNA. L&#39;aggiunta di ogni residuo LNA in un DNA o RNA oligonucleotide risultati in un aumento della T m tra i due ei 10 ° C per un LNA-RNA duplex ibridazione 14. Idealmente, le sonde LNA progettato deve essere di 20-25 nucleotidi di lunghezza (più sonde sono più difficili da sintetizzare) e hanno una T di m tra 85-90 ° C per l&#39;RNA ibridazione. </li><li> Dopo aver progettato la sequenza, l&#39;uso BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> o confrontare la sequenza della sonda al database locale per assicurare la sonda è specifica solo per il tuo Srna / mRNA di interesse. </li><li>Al momento dell&#39;ordine la sonda LNA, aggiungere un biotina-TEG modifica per porre fine alla 5 &#39;del oligonucleotide LNA. Il biotinilazione è necessario per la post-ibridazione colorazione con un streptavidina coniugato con il colorante. E &#39;possibile aggiungere questa modifica al 3&#39;, se necessario, ma l&#39;aggiunta al 5 &#39;è meno costoso e deve portare a rendimenti più elevati. </li><li> Tre controlli negativi dovrebbero essere inclusi nel metodo: (i) un &#39;no LNA&#39; di controllo, in cui una sonda LNA non viene aggiunto durante l&#39;ibridazione, (ii) un controllo &#39;non colorante&#39; in cui la sonda LNA è ibridato al bersaglio Srna, ma l&#39;evento di ibridazione non viene rilevato per l&#39;assenza della macchia fluorescente, e controllo (iii) &#39;mRNA non espresso Srna /&#39; uno che utilizza una sonda LNA che si rivolge a un Srna inesistente o non espresso in ordine di monitorare non specifici ibridazione. </li><li> La sonda specifica LNA qui è complementare al CsrB Srna e ha la sequenza 5&#39;-biotina-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(monomeri di LNAlettere maiuscole). </li><li> Dopo aver ricevuto liofilizzato LNA, risospendere con acqua priva di nucleasi a 50 mg / mL e conservare in 10-20 microlitri aliquote a -20 ° C. </li></ol> Soluzioni <ul><li> 8% paraformaldehye (PFA), 10% di acido acetico in PBS: Mix 1 ml 32% pfa, 400 microlitri acido acetico, 400 microlitri di PBS 10X, pH = 7,4, e 2,2 ml acqua priva di nucleasi. Per le aliquote congelate, congelare in aliquote uso singola a -20 ° C senza acido acetico. </li><li> 60% la soluzione di solfato di destrano: aggiungere 6,0 g di solfato di destrano in una provetta da 50 ml conica e aggiungere acqua ad un volume finale di 10 ml. Questa miscela di calore a 65 ° C a bagnomaria fino a quando il solfato di destrano è sciolto (potrebbe durare 1-2 ore). Acqua che potrebbe essere necessario aggiungere tutto il processo di solubilizzazione di mantenere un volume di 10 ml. Aliquota del 60% destrano la soluzione di solfato e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ul> 2. Fissazione <ol><li> Harvest 1x10 8 celle di bioluminescenti <em&gt; Vibrio campbellii o il vostro batteri di interesse e trasferirle in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Questa quantità di cellule fornisce abbastanza materiale di partenza per quattro flow-FISH campioni (uno specifico campione sonda LNA e tre controlli negativi). Ulteriori 1,5 mL aliquote provetta devono essere raccolti se altri Srna / mRNA specie devono essere testati. </li><li> Agglomerare le cellule batteriche per centrifugazione a 2300 xg per cinque minuti. Scartare il surnatante pipettando e risospendere le cellule in 400 ml di PBS 1X. </li><li> A questa miscela, aggiungere 400 ml di uno paraformaldehye 8% (PFA) e il 10% di acido acetico in soluzione salina tamponata con fosfato 1X (1X PBS) soluzione, mescolare bene e incubare per 10 minuti a 25 ° C mescolando una volta dopo cinque minuti. Tutte le incubazioni, salvo diversa indicazione, sono eseguite in un supporto tubo riscaldato. La soluzione pfa deve essere preparato fresco o usato da aliquote congelati dopo l&#39;aggiunta di acido acetico. Paraformaldeide è un fissativo reticolazione che hPEL di conservare la morfologia cellulare e mantenere l&#39;RNA intracellulare. </li><li> Agglomerare le cellule da questo miscuglio per centrifugazione a 4500 xg per due minuti e rimuovere il surnatante pipettando. Tutti i passaggi futuri che richiedono centrifugazione dovrebbe usare le stesse impostazioni (7K, 2 min). E &#39;importante notare che dopo la centrifugazione surnatanti dovrebbe essere rimosso pipettando e non decantazione. </li><li> Lavare le cellule due volte con 400 microlitri di PBS 1X e risospendere il pellet cellulare finale in 400 microlitri di PBS 1X. Le cellule sono fissi e possono essere conservati a 4 ° C in 400 microlitri di PBS 1X per un massimo di sette giorni. </li></ol> 3. Dietil pirocarbonato trattamento <ol><li> Preparare 400 ml di una soluzione 0,1% del dietil pirocarbonato (DEPC) in 1X PBS (400 ml di questa soluzione è necessario per ogni campione da analizzare in modo scala di conseguenza). La soluzione DEPC deve essere preparato fresco da uno stock DEPC. Trattamento DEPC inattiva RNasi da carbethoxylation e diminuisce ildel segnale di fondo. </li><li> Aggiungere 400 microlitri della soluzione del 0,1% DEPC ad ogni campione fisso di cellule batteriche e mescolare bene pipettando. Incubare la miscela a 25 ° C per 12 minuti. Lavare le cellule due volte con 400 microlitri di PBS 1X, agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. </li></ol> 4. Permeabilizzazione <ol><li> Aggiungere 1,0 mg di lisozima a 1 ml di tampone Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) per un mg / mL di soluzione 1.0. Questa soluzione deve essere preparato fresco. Aggiungere 800 microlitri della mg / 1 ml soluzione di lisozima alle cellule, mescolare accuratamente pipettando e incubare a 25 ° C per 30 minuti mescolando di tanto in tanto. Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. Lisozima agisce come reagente permeabilizzazione idrolizzando peptidoglicano presente nella parete cellulare batterica. </li><li> Preparare un 3,0 mg / ml soluzione di proteinasi K nel buffer TE. Questa soluzione deve essere preparato fresco da un mg / ml 20 magazzino proteinasi K che viene conservato a -20 ° C.Proteinasi K è una serina proteasi che digerisce una varietà di proteine ​​e aiuta l&#39;accessibilità delle sonde e reagenti per l&#39;RNA. </li><li> Aggiungere 800 microlitri della 3,0 mcg / ml soluzione proteinasi K al pellet e mescolare bene pipettando. Incubare a 25 ° C per 15 minuti con vortex a metà incubazione. </li><li> Agglomerare le cellule (7K, 2 min), rimuovere il surnatante e lavare le cellule una volta con 400 microlitri di PBS 1X. Dopo aver rimosso il surnatante lavaggio, risospendere le cellule in 400 microlitri di PBS 1X e aggiungere 100 microlitri della risospensione in quattro nuove da 1.5 mL microcentrifuga. Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. </li></ol> 5. Ibridazione <ol><li> Preparare 100 ml di buffer di ibridazione (HB) per ogni campione. L&#39;HB è composto da 50% formammide in volume, il 10% di solfato di destrano in massa (aggiungere 16,7 ml di soluzione al 60% del solfato di destrano microlitri per ogni 100), soluzione 1X Denhardt, a 50 mM fosfato di sodio pH 7.0,Sodio citrato 2X (SSC), 20 mg di DNA salmone tranciati spermatozoi (SSSD) e 20 tRNA di lievito mcg. </li><li> Ognuno dei componenti della HB ha uno scopo diverso. Formammide abbassa la temperatura di fusione di duplex acidi nucleici contribuendo così con denaturazione del RNA e minimizzare i danni cellulari. Solfato di destrano è usato come un volume esclusi-polimero per concentrare la sonda e aumentare il tasso di ibridazione. Soluzione Denhardts, lievito e SSSD tRNA fungono da agenti di blocco per ridurre legame non specifico. </li><li> In ognuno di cella risospensione contenenti provette da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 95 microlitri e microlitri HB 5.0 del Srna / mRNA specifico LNA [20 pmol di concentrazione specifico LNA finale] o acqua (per la LNA alcun controllo negativo). Per esempio: <ol class="lalpha"><li> Tubo 1-95 microlitri HB + 5,0 microlitri Srna / mRNA-sonda specifica </li><li> Tubo 2-95 microlitri HB + 5,0 microlitri Srna / mRNA-sonda specifica (controllo negativo &#39;no dye&#39;) </li><li> Tubo 3-95 microlitri HB + Srna 5,0 microlitri/ MRNA sonda (&#39;non espresso Srna / mRNA&#39; di controllo negativo) </li><li> Tubo 4-95 microlitri HB + acqua 5,0 microlitri (&#39;no LNA&#39; controllo negativo) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Incubare tutti e quattro i campioni a 60 ° C per 60 minuti. La temperatura di ibridazione dipende dalla sonda LNA (s) T m e dovrebbe essere fissata a circa 30 ° C al di sotto del predetto T m per ricottura RNA. Sia l&#39;elevata temperatura di ibridazione e formammide in HB garantisce la denaturazione di struttura secondaria della Srna o mRNA di interesse. </li></ol> 6. Post-ibridazione lava <ol><li> Dopo l&#39;ibridazione, aggiungere 1,0 mL 0,1 X. SSC con 0,1% di Tween-20 (SSCT) alla miscela di ibridazione. Ciò è necessario per consentire alle cellule di essere rimosso dalla soluzione di ibridazione viscoso. Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 200 ml di 50% formammide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 per il pellet cellulare, mescolare accuratamente e incubmangiò per 30 minuti a 65 ° C su una piastra riscaldante. </li><li> Aggiungere 1 ml 0,1 X. SSCT alla miscela, agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 500 microlitri SSCT 0,1 X. per risospendere le cellule e incubare per 40 minuti a 65 ° C in un blocco di calore. Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. </li></ol> 7. Blocco e colorazione <ol><li> Preparare il tampone di bloccaggio (BB) e la streptavidina-dye soluzione colorante. Preparare una soluzione 1X BB da uno stock 5X (disponibile in commercio, vedi reagenti). Per ogni serie di quattro tubi, preparare 1,2 ml 1X BB. </li><li> Aggiungere 200 ul 1X BB al pellet cellulari, risospendere e incubare per 30 minuti a 25 ° C. </li><li> Un streptavidina coniugata con colorante è utilizzato per rilevare le sonde LNA biotinilato. Mentre il blocco, preparare una soluzione di 2 mg / mL DyLight 488 streptavidina o il vostro desiderato dye-streptavidina coniugato in 1X BB per 30 min (per tre campioni, fanno 300 mL). </li><li> Dopo incubzione con 1X BB, agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. Aggiungere 50 microlitri della streptavidina-colorante soluzione al pellet cellulare, mescolare accuratamente, e incubare per 12 minuti a 25 ° C con miscelazione costante in un vortice o in un Thermomixer. Per il controllo &#39;no dye&#39;, aggiungere 50 microlitri di buffer 1X blocco solo. Per il resto del protocollo, proteggere i tubi di luce utilizzando un foglio di alluminio. </li><li> Lavare le cellule una volta con 500 microlitri di buffer SSCT 0,1 X. e una volta con 400 microlitri 1X PBS con 0,1% di Tween-20 (PBST). Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. </li><li> Dopo l&#39;iniziale coniugato streptavidina-colorazione, il segnale viene amplificato introducendo un biotinilato anti-streptavidina anticorpi alla streptavidina coniugato con il colorante e poi colorazione una seconda volta con la streptavidina-dye aumentando così l&#39;uscita del segnale per ibridato LNA sonda (Figura 2) . </li><li> Aggiungere 100 ml di 1 mg / mL biotinilato anti-streptavidina anticorpi in PBS 1X, resuspend le cellule e incubare a 25 ° C per 30 minuti mescolando con occasionali. Agglomerare le cellule (7K, 2 min), rimuovere il surnatante e lavare due volte con 400 microlitri PBST 1X. </li><li> Aggiungere 50 microlitri della 2 mcg / ml streptavidina-dye soluzione per le cellule, mescolare accuratamente, e incubare per 12 minuti a 25 ° C con miscelazione costante in un vortice o in un Thermomixer. Per il controllo &#39;no dye&#39;, aggiungere 50 microlitri di buffer 1X blocco solo. </li><li> Lavare le cellule una volta con 500 microlitri di buffer SSCT 0,1 X. e una volta con 400 microlitri PBST 1X. </li><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri PBST 1X e conservare a 4 ° C fino al momento per l&#39;analisi di citometria a flusso. Per le piccole cellule batteriche impostare la velocità di flusso per rallentare per ridurre le dimensioni del nucleo. Inoltre, per citofluorimetri con tagli in avanti la soglia scatter, il taglio deve essere quanto più basso possibile per garantire le piccole cellule batteriche vengono rilevati. </li><li> Per DyLight 488 rilevamento, il citofluorimetro deve essere dotato di un laser a 488 nm e standard di emissionefiltri per FITC. Almeno 2x10 4 eventi dovrebbero essere raccolti. Per la compatibilità con citofluorimetri dotati di laser differenti, altri streptavidina coniugata con fluorofori possono essere utilizzati per questo protocollo. </li></ol> 8. Rappresentante risultati Un esempio di cellule che sono fissi e permeabilizzate è mostrato efficace nel dot plot di citometria a flusso in figura 3a. Quando si utilizzano le condizioni di cui sopra per permeabilizzazione, la popolazione cellulare è aggregati indicando piccola e omogenea delle cellule pochi. Se è superiore (5 mg / ml) concentrazioni di lisozima sono usate, le cellule hanno maggiori probabilità di aggregare e mostrare una maggiore dispersione dei valori in avanti, indicativo di particelle più grandi (Figura 3B). Un esempio di citometria a flusso di dati da un flusso di successo LNA-FISH è riportato in Figura 4. L&#39;istogramma mostra la rilevazione specifica di un bersaglio Srna insieme a tre controlli negativi.Il controllo negativo &#39;no colorante&#39; produce meno fluorescenza, seguito dal &#39;no LNA&#39; e &#39;non espresso Srna&#39; controlli negativi. Infine, il campione con il Srna-specifica sonda LNA produce il massimo di fluorescenza. Una volta che il metodo e le sonde LNA sono convalidati in questo modo, ulteriori esperimenti possono essere progettati per monitorare le variazioni nel segnale di Srna nel corso del tempo, in risposta alle mutazioni o condizioni di coltura varia, ecc <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione dello schema generale di un flusso-FISH esperimento LNA per il rilevamento di Srna batterica. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Figura 2. Colorazione e l&#39;amplificazione del flusso-FISH segnale LNA. a) Ibridazione della sonda biotinilato LNA. b) con la colorazione fluorescente DyLight 488 coniugato streptavidina. c) Il legame del biotinilato anti-streptavidin anticorpi al DyLight 488 streptavidina. L&#39;anticorpo può legarsi streptavidina attraverso il suo sito di legame antigene o può essere vincolato da streptavidina attraverso i suoi residui di biotina. d) L&#39;amplificazione del segnale dalla colorazione ulteriormente con la fluorescente DyLight 488 coniugato streptavidina. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Figura 3. Trame dot citometria a flusso che mostrano in avanti rispetto ai risultati dispersione laterale per a) 1 mg / ml lisozima, 3 mg / ml proteinasi K permeabilizzazione e b) 5 mg / ml di lisozima, 3 mcg / ml proteinasi K permeabilizzazione. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Figura 4. Istogramma analisi del flusso-FISH risultati LNA. Il segnale di fluorescenza generata da ciascun campione è mostrato dalle quattro tracce: nero - Srna specifici LNA sonda; rosso - controllo negativo &#39;non espresso Srna&#39;; blu - controllo negativo &#39;no LNA&#39;; viola -&#39;No colorante&#39; di controllo negativo.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il flusso-FISH LNA metodo presentato qui è stato utilizzato per rilevare l&#39;espressione di un Srna da Gram-negativi marino batterio Vibrio campbellii la cui espressione è già stata confermata mediante microarray a base di profili di espressione e di invertire la reazione della polimerasi a catena della trascrizione 16. Fino ad oggi, abbiamo utilizzato questo metodo per monitorare l&#39;espressione di una varietà di RNA (es. trans-codifica Srna, Srna che modulano l&#39;attività della proteina, riboswitches, e mRNA). Come tale, siamo certi che il metodo è adattabile e può essere utilizzato per rilevare eventuali bersaglio Srna o mRNA e può essere modificato per l&#39;uso in tutte le specie batteriche o tipo di cellula. Se la modifica di questo protocollo è necessario per altri tipi di cellule, la variabile più importante da considerare la manipolazione è il passo permeabilizzazione. Per esempio, quando si modificano le condizioni di permeabilizzazione qui descritte, i cambiamenti nelle concentrazioni di lisozima e proteinasi K dovrebbe essere testato. Abbiamo scoperto che raddoppiando otriplicando la quantità di lisozima e proteinasi K portato a grandi cambiamenti nel flusso-FISH risultati LNA. Inoltre, quando le condizioni di prova permeabilizzazione aggiuntive, le cellule devono essere analizzati per aggregazione, perdita di cellule, e il miglior segnale ottenibile rapporto fluorescenza di fondo. Il grado di aggregazione delle cellule possono essere testati per al microscopio e / o di citometria a flusso. Mediante citometria di flusso, grumi di cellule sono presenti, come le code in avanti rispetto scatter plot parte punti e il metodo di permeabilizzazione corretto ridurre al minimo questo effetto tailing. Questo metodo è anche suscettibile di rilevazione Srna multiplex senza grosse modifiche al protocollo descritto come ulteriori sonde LNA etichettati con apteni altri come digossigenina potrebbero essere aggiunte durante l&#39;ibridazione e poi rilevata con un anticorpo anti-digossigenina e secondario coniugato anticorpo-fluoroforo. Attualmente, l&#39;unica limitazione che abbiamo incontrato con questo metodo è la sua incapacità di generare sufficiente segnale da debolmente exspecie Srna pressato e gli sforzi sono in corso per determinare la soglia di rilevazione (in numero di copie in assoluto per cella). Nel complesso, il flusso-FISH LNA metodo offre la possibilità di misurare Srna batterica o espressione di mRNA a singolo livello di cella in un modo un elevato throughput di fornire uno sguardo sulla presenza e abbondanza relativa di una specie Srna e il grado in cui la sua espressione varia in una popolazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Fosfato 10X soluzione salina tamponata (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (DEPC non trattati) </td></tr><tr><td> 32% paraformaldeide </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> RT 15714 </td><td> Etanolo libero </td></tr><tr><td> L&#39;acido acetico </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Tenere essiccato </td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasi K (20 mg / ml) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Deionizzata, aliquota e congelare </td></tr><tr><td> Destrano solfato MW&gt; 500.000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Aliquota soluzione al 60% e congelare </td></tr><tr><td> Denhardt soluzione di 50X concentrarsi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Aliquotare e conservare </td></tr><tr><td> Citrato di sodio tampone 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; DNA spermatico Salmon (tosato) 10 mg / mL </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Aliquotare e conservare </td></tr><tr><td> TRNA di lievito (10 mg / ml) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Aliquotare e conservare </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5X in soluzione di ibridazione in situ il blocco </td><td> Laboratori Vector </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidina </td><td> Laboratori Vector </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilato anti-streptavidina </td><td> Laboratori Vector </td><td> BA-0500 </td><td> Aliquotare e conservare </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una potente tecnica che viene utilizzata per rilevare e localizzare specifiche sequenze di acido nucleico in ambiente cellulare. Al fine di aumentare il throughput, FISH può essere combinato con citometria a flusso (flow-FISH) per consentire il rilevamento di mirate sequenze di acidi nucleici in migliaia di singole celle. Di conseguenza, il flusso-FISH offre un netto vantaggio rispetto lisato / ensemble basati su acidi nucleici metodi di rilevamento in quanto ogni cellula viene trattato come un osservazione indipendente, consentendo in tal modo più forte le analisi statistiche e varianza. Questi attributi hanno spinto l&#39;uso di metodi FISH e flusso-FISH in un certo numero di applicazioni diverse e l&#39;utilità di questi metodi è stato dimostrato con successo nel determinare la lunghezza dei telomeri 1,2, identificazione cellulare e genica 3,4, il monitoraggio moltiplicazione virale in cellule infette 5 e analisi di comunità batteriche e di enumerazione6. Tradizionalmente, la specificità dei metodi di FISH e flusso-FISH è stata impartita da sonde di oligonucleotidi DNA. Recentemente, tuttavia, la sostituzione delle sonde di DNA oligonucleotide con gli analoghi degli acidi nucleici come sonde FISH e flusso-FISH ha aumentato sia la sensibilità e la specificità di ogni tecnica a causa delle temperature di fusione più elevato (T m) di questi analoghi naturali per acidi nucleici 7,8 . Chiuso acido nucleico (LNA) sonde sono un tipo di acido nucleico analogico che contengono nucleotidi LNA a spillo durante una sequenza di DNA o RNA 9,10. Quando accoppiato con flusso-FISH, sonde LNA hanno già dimostrato di sovraperformare sonde di DNA convenzionali 7,11 e sono stati utilizzati con successo per rilevare l&#39;mRNA eucariotico 12 e RNA virale nelle cellule dei mammiferi 5. Qui espandere questa capacità e descrivere un flusso-FISH LNA metodo che permette di rilevare specifiche di RNA in cellule batteriches (Figura 1). In particolare, siamo interessati a rilevare piccole non codificanti regolamentazione RNA (Srna), che hanno raccolto un notevole interesse negli ultimi anni in quanto sono stati trovati a servire come chiave di elementi regolatori in molti processi cellulari fondamentali 13. Tuttavia, ci sono strumenti limitati per lo studio sRNAs e le sfide di rilevare Srna nelle cellule batteriche è in parte dovuto alle dimensioni relativamente piccole (tipicamente 50-300 nucleotidi di lunghezza) e l&#39;abbondanza di molecole a basso Srna e la generale difficoltà nel lavorare con piccole cellule biologiche con differenti membrane cellulari. In questo metodo, si descrivono le condizioni di fissazione e permeabilzation che conservano la struttura delle cellule batteriche e permettere la penetrazione di sonde LNA, nonché alle fasi di amplificazione del segnale che consentono il rilevamento specifico di abbondanza Srna basso (Figura 2).

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Un romanzo ad alta produttività metodo è descritto che consente il rilevamento e la quantificazione relativa di RNA di piccole e di espressione di mRNA da singole cellule batteriche con bloccate le sonde di acidi nucleici e di citometria a flusso fluorescenza<em&gt; In situ</emIbridazione&gt;.

Chiuso flusso degli acidi nucleici Citometria fluorescenza In situ Ibridazione (LNA flow-FISH): un metodo per la rilevazione dei batteri piccoli RNA

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

locked-nucleic-acid-flow-cytometry-fluorescence-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

25.2K Views.  Naval Research Laboratory. Un romanzo ad alta produttività metodo è descritto che consente il rilevamento e la quantificazione relativa di RNA di piccole e di espressione di mRNA da singole cellule batteriche con bloccate le sonde di acidi nucleici e di citometria a flusso fluorescenza In situ.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

Trasfezione e Mutagenesi di geni bersaglio in cellule Mosquito da Locked Nucleic Acid modificati Oligonucleotidi

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Ibridazione<em&gt; In situ</em&gt; Delle ghiandole salivari, ovaie, e gli embrioni di Vector zanzare

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV models are limited to hepatoma cell lines (such as HepG2 and Huh7) overexpressing a functional HBV receptor, sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP). Here, we used 293T-NE-3NRs (293T&#160;overexpressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) as model cell lines.&#160;HBV infection in these cell lines was performed either by using concentrated HBV virus particles from HepG2.2.15 or co-culturing HepG2.2.15 with the target cell lines. HBcAg immunofluorescence for HBcAg was performed to confirm HBV infection. The two methods presented here will help us study HBV infection in non-hepatic cell lines.&#160;&#160;

This manuscript describes a detailed protocol for Hepatitis B virus (HBV) infection in novel engineered 293T cells (293T-NE-3NRs, expressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and traditional hepatic cells (HepG2-NE, expressing human NTCP).

Modellazione dell'infezione da virus dell'epatite B nelle cellule non epatiche 293T-NE-3NRs

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...