Ce travail a été soutenu par l&#39;Office of Naval Research des États-Unis via des fonds de recherche navale coeur de laboratoire.

1. Sondes LNA &amp; design expérimental <ol><li> Conception des sondes LNA qui sont le complément inverse de votre petit ARN transcrits / ARNm ou les ont conçus sur mesure au <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Si vous utilisez l&#39;option design personnalisé, vous connaîtrez la séquence, mais pas le modèle de dopage LNA. L&#39;ajout de chaque résidu de LNA dans un ADN ou d&#39;ARN oligonucléotides résultats par une augmentation de T m comprise entre deux et 10 ° C pour l&#39;hybridation d&#39;un duplex ARN LNA-14. Idéalement, les sondes LNA conçu devrait être entre 20-25 nucléotides de long (plus de sondes sont plus difficiles à synthétiser) et ont un Tm comprise entre 85-90 ° C pour l&#39;ARN hybridation. </li><li> Après la conception de la séquence, l&#39;utilisation de BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ou comparer la séquence de sonde à votre base de données locale pour assurer la sonde est spécifique à votre petit ARN / ARNm d&#39;intérêt. </li><li>Lors de la commande de la sonde LNA, ajouter une modification à la biotine TEG à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;oligonucléotide LNA. La biotinylation est nécessaire pour la post-hybridation coloration avec un conjugué streptavidine-colorant. Il est possible d&#39;ajouter cette modification de l&#39;extrémité 3 &#39;si nécessaire, mais l&#39;addition à l&#39;extrémité 5&#39; est moins cher et devrait se traduire par des rendements plus élevés. </li><li> Trois contrôles négatifs doivent être inclus dans la méthode: (i) un contrôle &quot;non LNA» dans lequel une sonde LNA n&#39;est pas ajouté au cours de l&#39;étape d&#39;hybridation, (ii) un «sans colorant» de contrôle dans lequel la sonde LNA est hybride à la cibles petit ARN, mais l&#39;événement d&#39;hybridation n&#39;est pas détectée en raison de l&#39;absence du colorant fluorescent, et de contrôle (iii) &#39;ARNm non exprimé petit ARN /&#39; une qui utilise une sonde LNA qui cible un petit ARN inexistantes ou non exprimées dans l&#39;ordre de surveiller une hybridation non spécifique. </li><li> La sonde spécifique LNA ici est complémentaire à l&#39;CsrB SRNA et a la séquence 5&#39;-biotine-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(monomères LNA dansmajuscules). </li><li> Après réception du lyophilisé LNA, resuspendre avec une eau sans nucléase à 50 pg / mL et de stocker en 10-20 aliquotes à -20 ° C. </li></ol> Solutions <ul><li> 8% (PFA) paraformaldehye, 10% d&#39;acide acétique dans du PBS: Mélanger 1 ml 32% PFA, 400 ul d&#39;acide acétique, 400 ul PBS 10X, pH = 7,4, et 2,2 ml d&#39;eau sans nucléase. Pour aliquotes congelés, en aliquots à usage unique à -20 ° C sans acide acétique. </li><li> 60% solution de sulfate de dextrane: ajouter 6,0 g de sulfate de dextrane à un tube conique de 50 ml et ajouter l&#39;eau pour un volume final de 10 ml. Chauffer ce mélange à 65 ° C dans un bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que le sulfate de dextran est dissoute (peut prendre 1-2 heures). D&#39;eau supplémentaire peut être nécessaire d&#39;ajouter tout au long du procédé de solubilisation de maintenir un volume de 10 mL. Aliquoter la solution 60% de sulfate de dextran et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ul> 2. Fixation <ol><li> Récolte 1x10 8 cellules de bioluminescents <em&gt; Vibrio campbellii ou votre bactéries d&#39;intérêt et de les transférer dans un tube de 1,5 ml. Cette quantité de cellules fournit suffisamment de matériel de départ pour quatre flux POISSONS échantillons (un échantillon spécifique de sonde LNA et trois contrôles négatifs). Additionnel de 1,5 ml aliquotes microcentrifugeuse tube doit être collectées que si d&#39;autres petit ARN / ARNm espèces ont besoin d&#39;être testé. </li><li> Pellet, les cellules bactériennes par centrifugation à 2300 xg pendant cinq minutes. Jeter le surnageant par pipetage et remettre en suspension les cellules dans 400 ul de PBS 1X. </li><li> A ce mélange, ajouter 400 ul d&#39;une paraformaldehye 8% (PFA) et 10% d&#39;acide acétique dans une solution saline tamponnée de phosphate 1X (1X PBS), bien mélanger, et laisser incuber pendant 10 minutes à 25 ° C le mélange une fois après cinq minutes. Toutes les incubations, sauf indication contraire, sont effectuées dans un porte-tube chauffé. La solution PFA doivent être préparés frais ou d&#39;occasion à partir aliquotes congelées après l&#39;addition d&#39;acide acétique. Paraformaldéhyde est un fixateur de réticulation que hPEL afin de préserver la morphologie cellulaire et de conserver l&#39;ARN intracellulaire. </li><li> Pellet les cellules de ce mélange par centrifugation à 4500 xg pendant deux minutes et retirer le surnageant par pipetage. Toutes les étapes à venir qui nécessitent une centrifugation devrait utiliser les mêmes paramètres (7K, 2 min). Il est important de noter que les surnageants après centrifugation doit être retiré par pipetage et pas de décantation. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 400 ul de PBS 1X et resuspendre le culot cellulaire final dans 400 ul de PBS 1X. Les cellules sont désormais fixes et peuvent être conservés à 4 ° C dans 400 ul de PBS 1X pour un maximum de sept jours. </li></ol> 3. Traitement de pyrocarbonate de diéthyle <ol><li> Préparer 400 ul d&#39;une solution à 0,1% du diéthyl pyrocarbonate (DEPC) dans du PBS 1X (400 pl de cette solution est nécessaire pour chaque échantillon à tester afin d&#39;échelle en conséquence). La solution DEPC doit être préparé à partir d&#39;un stock de DEPC. Le traitement DEPC inactive RNases par carbethoxylation et diminue lasignal de fond. </li><li> Ajouter 400 ul de la solution de 0,1% DEPC à chaque échantillon de cellules bactériennes fixées et bien mélanger par pipetage. Incuber ce mélange à 25 ° C pendant 12 minutes. Laver les cellules deux fois avec 400 ul de PBS 1X, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li></ol> 4. Perméabilisation <ol><li> Ajouter 1,0 mg de lysozyme à 1 mL de tampon Tris-EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) pour un 1,0 mg / ml solution. Cette solution doit être préparé. Ajouter 800 ul de 1 mg / ml solution de lysozyme dans les cellules, bien mélanger par pipetage et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes avec mélange occasionnel. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Le lysozyme agit comme un réactif de perméabilisation en hydrolysant le présent peptidoglycane dans les parois des cellules bactériennes. </li><li> Préparer un 3,0 mg / ml solution de protéinase K dans du tampon TE. Cette solution doit être préparé à partir d&#39;un stock de 20 mg / ml de protéinase K qui est stocké à -20 ° C.Protéinase K est une sérine protéase qui digère une variété de protéines et contribue à l&#39;accessibilité des sondes et des réactifs à l&#39;ARN. </li><li> Ajouter 800 uL de la g 3.0 / ml protéinase K solution au culot cellulaire et bien mélanger par pipetage. Incuber à 25 ° C pendant 15 minutes avec vortex à mi-parcours de l&#39;incubation. </li><li> Pellet cellules (7K, 2 min), éliminer le surnageant et laver les cellules une fois avec 400 ul de PBS 1X. Après avoir retiré le surnageant du lavage, remettre les cellules dans 400 ul de PBS 1X et ajouter 100 ml de la remise en suspension dans quatre nouveaux microtubes 1,5 ml. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li></ol> 5. Hybridation <ol><li> Préparer 100 uL de tampon d&#39;hybridation (HB) pour chaque échantillon. Le HB est constituée de formamide à 50% en volume, 10% de sulfate de dextrane en masse (ajouter 16,7 ul de la solution de sulfate de dextran 60% pour chaque uL 100), solution 1X Denhardt, 50 phosphate de sodium pH 7,0,Citrate de sodium 2X (SSC), 20 pg d&#39;ADN de sperme de saumon cisaillé (SSSD) et 20 mg ARNt de levure. </li><li> Chacune des composantes de l&#39;HB a un but différent. Le formamide abaisse la température de fusion du duplex d&#39;acides nucléiques permettant ainsi aux dénaturation de l&#39;ARN et en minimisant les dommages cellulaires. Sulfate de dextran est utilisé comme un volume hors de polymère pour concentrer la sonde et d&#39;augmenter le taux d&#39;hybridation. Solution Denhardts, la levure et les ARNt SSSD servir des agents bloquants pour réduire la liaison non spécifique. </li><li> Dans chacune des cellules remise en suspension contenant 1,5 ml microtubes, ajouter 95 uL HB et uL 5.0 du petit ARN / ARNm spécifiques de LNA [20 pmol de LNA concentration spécifique finale] ou de l&#39;eau (pour le contrôle LNA pas de négatif). Par exemple: <ol class="lalpha"><li> Tube de 1 à 95 uL HB + 5,0 uL petit ARN / ARNm sonde spécifique </li><li> Tube de 2 à 95 uL HB 5,0 + uL petit ARN / ARNm sonde spécifique (contrôle négatif &quot;sans colorant&quot;) </li><li> Tube de 3 à 95 uL HB + 5,0 uL petit ARN/ ARNm de la sonde («non-exprimé petit ARN / ARNm« témoin négatif) </li><li> Tube de 4 à 95 uL HB + 5,0 uL d&#39;eau (contrôle négatif &quot;non LNA») </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Incuber tous les quatre échantillons à 60 ° C pendant 60 minutes. La température d&#39;hybridation dépend de la sonde LNA m (s) T et devrait être fixé à environ 30 ° C en dessous de la Tm prédit pour le recuit ARN. Tant la température d&#39;hybridation élevée et le formamide dans les HB assure la dénaturation de la structure secondaire de la SRNA ou ARNm d&#39;intérêt. </li></ol> 6. Post-hybridation lave <ol><li> Après l&#39;hybridation, ajoutez 1,0 ml à 0,1 X SSC avec 0,1% de Tween-20 (SSCT) pour le mélange d&#39;hybridation. Cela est nécessaire pour permettre aux cellules d&#39;être retiré de la solution d&#39;hybridation visqueux. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 200 ul de 50% de formamide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 à l&#39;culots cellulaires, mélanger soigneusement et Incubmangé pendant 30 minutes à 65 ° C dans un bloc de chauffage. </li><li> Ajouter 1 mL 0,1 X SSCT au mélange, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 500 uL SSCT 0,1 X pour remettre les cellules et incuber pendant 40 minutes à 65 ° C dans un bloc thermique. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li></ol> 7. Blocage et coloration <ol><li> Préparer le tampon de blocage (BB) et la solution de coloration streptavidine-colorant. Préparer une solution 1X BB à partir d&#39;un stock de 5X (disponible dans le commerce, voir réactifs). Pour chaque ensemble de quatre tubes, préparer 1,2 ml 1X BB. </li><li> Ajouter 200 ul 1X BB au culots cellulaires, resuspendre et incuber pendant 30 minutes à 25 ° C. </li><li> Un colorant streptavidine conjuguée est utilisé pour détecter les sondes LNA biotinylé. Alors que le blocage, préparer une solution de 2 pg / ml DyLight 488 streptavidine ou votre désirée colorant streptavidine conjugué 1X BB pendant 30 min (pour trois échantillons, faire 300 uL). </li><li> Après Incubtion avec 1X BB, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Ajouter 50 uL de la solution de streptavidine-teinture pour les culots cellulaires, bien mélanger, et laisser incuber pendant 12 minutes à 25 ° C avec un mélange constant sur un vortex ou dans un thermomixer. Pour les «sans colorant» de contrôle, ajouter 50 ul de tampon 1X bloquant uniquement. Pour le reste du protocole, de protéger les tubes de lumière en utilisant du papier d&#39;aluminium. </li><li> Laver les cellules une fois avec 500 uL de tampon SSCT 0,1 X et une fois avec 400 ul de PBS 1X avec 0,1% de Tween-20 (PBST). Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li><li> Après les premières conjugué streptavidine-coloration, le signal est amplifié par l&#39;introduction d&#39;un anti-streptavidine biotinylé anticorps au conjugué streptavidine-dye et coloration une seconde fois avec la streptavidine-dye augmentant ainsi le signal de sortie par hybridation de sonde LNA (figure 2) . </li><li> Ajouter 100 ul de 1 pg / mL biotinylé anti-streptavidine anticorps dans du PBS 1X, resuspend les cellules et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes avec mélange occasionnel. Pellet cellules (7K, 2 min), éliminer le surnageant et laver deux fois avec 400 uL PBST 1X. </li><li> Ajouter 50 uL de la 2 mg / ml de streptavidine-dye solution pour les cellules, bien mélanger, et laisser incuber pendant 12 minutes à 25 ° C avec un mélange constant sur un vortex ou dans un thermomixer. Pour les «sans colorant» de contrôle, ajouter 50 ul de tampon 1X bloquant uniquement. </li><li> Laver les cellules une fois avec 500 uL de tampon SSCT 0,1 X et une fois avec 400 uL PBST 1X. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 uL PBST 1X et conserver à 4 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;analyse par cytométrie de flux. Pour les plus petites cellules bactériennes régler le débit de ralentir pour diminuer la taille du cœur. En outre, pour les cytomètres de flux avec l&#39;attaquant seuils seuil de dispersion, la coupure doit être aussi basse que possible pour assurer les petites cellules bactériennes sont détectées. </li><li> Pour DyLight 488 de détection, le cytomètre de flux doit être équipé d&#39;un laser à 488 nm et d&#39;émission standardfiltres pour FITC. Au moins 2x10 4 événements devraient être collectées. Pour la compatibilité avec cytomètres équipés de lasers différents, d&#39;autres streptavidine conjuguée à des fluorophores peut être utilisé pour ce protocole. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Un exemple de cellules qui sont fixées et perméabilisées efficace est indiqué dans le dot plot de cytométrie en flux sur la figure 3A. Lorsque les conditions décrites ci-dessus pour la perméabilisation, la population cellulaire est petite et homogène indiquant agrégats de cellules rares. Lorsque supérieur (5 mg / ml) des concentrations de lysozyme sont utilisés, les cellules sont plus susceptibles d&#39;agréger et de présenter des valeurs de dispersion accrue de l&#39;avant, indicatifs de particules plus grosses (figure 3B). Un exemple de données de cytométrie en flux à partir d&#39;un flux de succès LNA-FISH expérience est montré dans la figure 4. L&#39;histogramme montre la détection spécifique d&#39;un petit ARN cible avec trois contrôles négatifs.Le «sans colorant» contrôle négatif produit le moins de fluorescence, suivie par le «non LNA» et «non-exprimé petit ARN &#39;contrôles négatifs. Enfin, l&#39;échantillon avec la sonde petit ARN spécifiques de LNA qui produit le plus de fluorescence. Une fois la méthode et les sondes LNA sont validés de cette manière, des expériences complémentaires peuvent être conçus pour surveiller les changements dans le signal petit ARN au cours du temps, en réponse à des mutations ou des conditions de culture variées, etc <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation du schéma d&#39;ensemble d&#39;un flux de LNA-FISH expérimentation pour la détection de la SRNA bactérienne. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Figure 2. Coloration et l&#39;amplification des flux de LNA-FISH signal. a) L&#39;hybridation de la sonde biotinylée LNA. b) Coloration avec les fluorescents DyLight 488 conjugué streptavidine. c) La liaison de l&#39;biotinylé anti-sd&#39;anticorps à l&#39;treptavidin DyLight 488 streptavidine. L&#39;anticorps peut se lier streptavidine grâce à son site de liaison antigénique ou peut être lié par la streptavidine à travers ses résidus de biotine. d) L&#39;amplification du signal par une coloration plus loin avec l&#39;fluorescentes DyLight 488 conjugué streptavidine. <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Figure 3. Parcelles de cytométrie en flux de point montrant l&#39;avant par rapport aux résultats d&#39;une diffusion latérale) 1 mg / ml de lysozyme, 3 pg / ml de protéinase K perméabilisation et b) 5 mg / ml de lysozyme, 3 pg / ml de protéinase K perméabilisation. <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Figure 4. Analyse de l&#39;histogramme de l&#39;écoulement LNA POISSONS résultats. Le signal fluorescent généré à partir de chaque échantillon est représenté par les quatre traces: noir - petit ARN spécifiques LNA sonde; rouge - contrôle négatif &quot;non-exprimée petit ARN; bleu - contrôle négatif&quot; non LNA; violet -Contrôle négatif &quot;sans colorant&quot;.

<ol>
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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le flux de LNA-FISH méthode présentée ici a été utilisé pour détecter l&#39;expression d&#39;un petit ARN de la Gram-négatif bactérie marine Vibrio campbellii dont l&#39;expression a déjà été confirmée par le profil d&#39;expression basé sur un microréseau et inverser la réaction en chaîne par polymérase après transcription 16. À ce jour, nous avons utilisé cette méthode pour contrôler l&#39;expression d&#39;une variété d&#39;ARN (par exemple trans-encodé Srna, petit ARN qui modulent l&#39;activité des protéines, riboswitches et ARNm). En tant que tel, nous sommes convaincus que la méthode est adaptable et peut être utilisé pour détecter une cible petit ARN ou ARNm et peut être modifié pour être utilisé dans toutes les espèces bactériennes ou type de cellule. Si la modification de ce protocole est nécessaire pour d&#39;autres types cellulaires, la variable la plus importante à considérer la manipulation est l&#39;étape de perméabilisation. Par exemple, lors de la modification des conditions de perméabilisation décrit ici, les changements dans les concentrations de lysozyme et la protéinase K doit être testé. Nous avons constaté que doubler outripler la quantité de lysozyme et la protéinase K ont entraîné des changements majeurs dans les flux de LNA-FISH résultats. Par ailleurs, lors du test des conditions de perméabilisation supplémentaires, les cellules doivent être analysés pour l&#39;agglutination, la perte de cellules, et le meilleur signal obtenu au ratio de fond de fluorescence. L&#39;étendue de l&#39;agglutination de cellules peuvent être testés pour la microscopie et / ou la cytométrie de flux. Par cytométrie en flux, amas cellulaires sont présents que dans une queue avant vs dot plot côté de dispersion et la méthode de perméabilisation correct de minimiser cet effet de résidus. Cette méthode est également prête à la détection de petit ARN multiplex, sans modifications majeures au protocole décrit comme complémentaires des sondes LNA étiquetés avec des haptènes tels que la digoxigénine pourrait être ajouté lors de l&#39;étape d&#39;hybridation puis détecté avec un anticorps anti-digoxigénine et secondaires d&#39;anticorps fluorophore conjugué. Actuellement, la seule limitation que nous avons rencontrés avec cette méthode est son incapacité à générer un signal suffisamment de faiblement exespèces petit ARN pressées et des efforts sont en cours pour déterminer le seuil de détection (en nombre de copies par cellule absolue). Globalement, les flux de LNA-FISH méthode fournit l&#39;occasion de mesurer petit ARN bactérien ou l&#39;expression des ARNm au niveau des cellules simples de façon à haut débit pour fournir des indications sur la présence et l&#39;abondance relative d&#39;une espèce SRNA et la mesure dans laquelle son expression varie dans une population.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Phosphate 10X solution saline tamponnée (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (Non traitée DEPC) </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 32% </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> RT 15714 </td><td> Éthanol gratuitement </td></tr><tr><td> L&#39;acide acétique </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diéthyle pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Gardez desséchée </td></tr><tr><td> Le lysozyme </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Protéinase K (20 mg / ml) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Le formamide </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Déminéralisée, aliquoter et congeler </td></tr><tr><td> Sulfate de dextran PM&gt; 500000 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Solution Aliquoter 60% et le gel </td></tr><tr><td> Solution de Denhardt 50X concentrent </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Aliquoter et congeler </td></tr><tr><td> Tampon citrate de sodium 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; ADN de sperme de saumon (cisaillé) 10 mg / ml </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Aliquoter et congeler </td></tr><tr><td> Levure ARNt (10 mg / mL) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Aliquoter et congeler </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5X dans une solution d&#39;hybridation in situ le blocage </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidine </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé anti-streptavidine </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Aliquoter et congeler </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

L&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) est une technique puissante qui est utilisée pour détecter et localiser des séquences spécifiques d&#39;acide nucléique dans l&#39;environnement cellulaire. Afin d&#39;augmenter le débit, le poisson peut être combinée avec la cytométrie de flux (flow-FISH) pour permettre la détection de séquences d&#39;acide nucléique cible dans des milliers de cellules individuelles. En conséquence, le débit-FISH propose un net avantage sur lysat / ensemble basée sur des méthodes de détection des acides nucléiques, car chaque cellule est traitée comme une observation indépendante, permettant ainsi des analyses statistiques plus fort et la variance. Ces attributs ont incité l&#39;utilisation de méthodes de FISH et de débit-FISH dans un certain nombre de différentes applications et l&#39;utilité de ces méthodes a été démontrée avec succès dans la détermination de la longueur des télomères 1,2, l&#39;identification cellulaire et l&#39;expression du gène 3,4, suivi de la multiplication virale 5 cellules infectées, et l&#39;analyse des communautés bactériennes et le dénombrement6. Traditionnellement, la spécificité des méthodes de FISH et écoulement du poisson a été communiquée par les sondes d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN. Récemment toutefois, le remplacement des sondes oligonucléotidiques d&#39;ADN avec des analogues d&#39;acides nucléiques comme sondes FISH et flux de poissons a augmenté à la fois la sensibilité et la spécificité de chaque technique en raison de la température de fusion élevée (T m) de ces analogues pour les acides nucléiques naturels 7,8 . D&#39;acides nucléiques verrouillés (LNA) sondes sont un type de analogiques acide nucléique qui contiennent les nucléotides LNA pointes à travers une séquence d&#39;ADN ou d&#39;ARN 9,10. Couplé avec un débit-FISH, sondes LNA ont été précédemment montré à surperformer les sondes d&#39;ADN conventionnelles 7,11 et ont été utilisés avec succès pour détecter l&#39;ARNm eucaryotes 12 et l&#39;ARN viral dans les cellules de mammifères 5. Ici nous étendre cette capacité et décrire un LNA flux POISSONS méthode qui permet la détection spécifique de l&#39;ARN dans la cellule bactériennes (figure 1). Plus précisément, nous nous intéressons à la détection de petits non-codant l&#39;ARN de régulation (SRNA) qui ont remporté un intérêt considérable dans les dernières années car ils ont été trouvés pour servir les principaux éléments de la réglementation dans de nombreux processus cellulaires critiques 13. Cependant, il existe des outils limités pour étudier les défis et les petits ARN de détecter petit ARN dans les cellules bactériennes est due en partie à la taille relativement faible (typiquement 50 à 300 nucléotides de long) et la faible abondance de molécules d&#39;ARNs ainsi que la difficulté générale à travailler avec de plus petites cellules biologiques avec plus ou moins les membranes cellulaires. Dans cette méthode, nous décrivons les conditions de fixation et permeabilzation qui préservent la structure des cellules bactériennes et permettre la pénétration des sondes LNA ainsi que les étapes d&#39;amplification du signal qui permettent la détection spécifique de faible abondance Srna (figure 2).

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Un roman à haut débit méthode est décrite qui permet la détection et la quantification relative de petit ARN et d&#39;expression d&#39;ARNm à partir des cellules bactériennes simples en utilisant des sondes d&#39;acides nucléiques verrouillés et cytométrie en flux par fluorescence-<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt;.

Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ</emHybridation> (LNA flux FISH): une méthode d&#39;bactérienne détection de l&#39;ARN petits

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

25.2K vues.  Naval Research Laboratory. Un roman à haut débit méthode est décrite qui permet la détection et la quantification relative de petit ARN et d'expression d'ARNm à partir des cellules bactériennes simples en utilisant des sondes d'acides nucléiques verrouillés et cytométrie en flux par fluorescence- In situ

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Recherche

Immunologie et infection

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

La transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en Fermés d&#39;acide nucléique modifiés Oligonucléotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Phage »Bioluminescent&quot; Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridation<em&gt; In situ</em&gt; Des glandes salivaires, des ovaires et des embryons de moustiques vecteurs

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; sur les chromosomes mitotiques de moustiques

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l&#39;étude du brin positif de virus à ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV models are limited to hepatoma cell lines (such as HepG2 and Huh7) overexpressing a functional HBV receptor, sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP). Here, we used 293T-NE-3NRs (293T&#160;overexpressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) as model cell lines.&#160;HBV infection in these cell lines was performed either by using concentrated HBV virus particles from HepG2.2.15 or co-culturing HepG2.2.15 with the target cell lines. HBcAg immunofluorescence for HBcAg was performed to confirm HBV infection. The two methods presented here will help us study HBV infection in non-hepatic cell lines.&#160;&#160;

This manuscript describes a detailed protocol for Hepatitis B virus (HBV) infection in novel engineered 293T cells (293T-NE-3NRs, expressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and traditional hepatic cells (HepG2-NE, expressing human NTCP).

Modélisation de l’infection par le virus de l’hépatite B dans les cellules non hépatiques 293T-NE-3NRs

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

Un petit ARN non codant MicC contribue à la virulence des protéines de la membrane externe chez Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ (LNA flux FISH): une méthode d'bactérienne détection de l'ARN petits