Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Overstreet.

1. Impostazione di base prima di procedere alla coltura cellulare <ol><li> NeuroCult Media NSC basale e NeuroCult NSC supplementi proliferazione vengono miscelati con un rapporto 9:1, rispettivamente, per rendere completo supporto NSC. </li><li> A 37 ° C bagno di acqua viene utilizzata per riscaldare il mezzo. </li><li> Giusta quantità di calore inattivato siero fetale bovino (FCS) è stato scongelato. </li><li> Quantità appropriata di soluzioni crescita fotografici fattore compreso il fattore di crescita epidermico (EGF a 10 pg / ml), fattore di crescita fibroblastico (FGF-B a 10 pg / ml) e 0,2% soluzione di eparina in salina tamponata con fosfato (PBS) vengono scongelate. </li><li> Fiaschi coltura tissutale (T25, T75 e T175 o) sono necessari per l&#39;espansione e la differenziazione NSC. </li><li> Colture di tessuti trattati 96 e 24 pozzetti e vetrini sono necessari per la placcatura cellule ordinati. </li></ol> 2. Isolamento ed espansione (Passaging) di NSCs <ol><li> Staminali neurali e cellule progenitrici sono isolate ed espanse da mouse bpioggia come descritto in protocolli separati 1, 2 3. </li><li> Quando il neurosfere (neurosfere sia primarie o diversi passaggi) sono pronti per subcoltura (150-200 micron di diametro), le sfere terreno contenente viene trasferita ad un tubo di tessuto appropriato sterile cultura dimensioni, e centrifugate a 800 rpm (110 g) per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Il mezzo supernatante viene rimosso e le sfere vengono risospese in 1 ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> Dopo incubazione a 37 ° bagnomaria C per 2-3 min, un volume uguale di inibitore della tripsina di soia viene aggiunta alla sospensione cellulare per interrompere l&#39;attività tripsina. </li><li> Per assicurare che la tripsina è stato completamente inattivato, la sospensione cellulare viene delicatamente pipettano su e giù 3-5 volte. </li><li> Dopo centrifugazione a 800 rpm (110 g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in 1 ml di mezzo completo NSC. </li><li> 10 pl di sospensione cellulare viene miscelata con 90 pl di trypan blu per eseguire un numero di celle. Nota: Altri diluizioni cellulari idonee possono anche essere utilizzati. </li><li> Le cellule vengono poi usati per subcultura 1, 2 o per differenziazione come descritto di seguito. </li></ol> 3. Differenziazione delle staminali neurali e cellule progenitrici, il saggio neuroblasti (NBA) <ol><li> Le cellule risultanti da neurosfere dissociate sono piastrate ad una concentrazione di 2-3 x 10 5 cellule / ml in mezzo completo NSC supplementato con 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 pl / ml di eparina 0,2% e il 5% FCS inattivato al calore in un pallone di coltura tissutale appropriate dimensioni. 5 ml di mezzo è utilizzato per T25, T75 per 20 ml e 40 ml per T175 palloni. Nota: FCS causerà le cellule per fissare saldamente al substrato e non è necessario per il rivestimento dei cilindri per la cultura NBA. </li><li> Cultoure beute vengono poi incubate a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO 2 per 3-4 giorni. Questo periodo viene chiamata fase di proliferazione, durante la quale progenie NSC collegare al substrato e proliferare come un monostrato di cellule. </li><li> Quando la coltura diventa 90-95% confluenti, il mezzo di ciascun pallone viene commutato al mezzo completo NSC supplementato con 5% FCS in assenza di fattori di crescita. </li><li> Beute di coltura sono nuovamente incubate a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO 2 per altri 3-4 giorni. Questo periodo è chiamato stadio di differenziazione, durante la quale progenitori neuronali appaiono in cima ad un monostrato astrociti proliferano e per rendere colonie di cellule neuronali immature. Il giorno 4-5 della fase di differenziazione, la coltura è pronta per l&#39;isolamento delle cellule neuroblasti citometria di flusso tecnologia. </li></ol> 4. Preparazione celle per citometria a flusso Trypsinizazione <ol><li> La cultura di differenziare progenie NSC giorno 4-5 della fase di differenziazione viene lavata una volta con una quantità appropriata di PBS (2 ml per T25, T75 per 4 ml e 8 ml per T175 pallone) per rimuovere FCS dalla coltura. Nota: FCS blocchi tripsina-EDTA attività. </li><li> Poi, una quantità sufficiente di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA (2 ml per T25, T75 per 4 ml e 8 ml per T175 pallone) viene aggiunto a ciascun pallone a coprire il monostrato di cellule e incubate per 1-2 min in uno 37 ° C incubatore umidificato. </li><li> Il pallone viene controllato al microscopio per valutare l&#39;effetto di Tripsina-EDTA sulla cultura. Il pallone viene tenuto con una mano e colpito saldamente con l&#39;altra mano per rimuovere le cellule dal fondo del pallone. </li><li> Volume uguale di inibitore di tripsina di soia viene aggiunta al pallone per estinguere attività tripsina. La sospensione cellulare viene delicatamente pipettano su e giù da garantire l&#39;inattivazione tripsina e per realizzare una cella singola omogeneasospensione. Nota: In alternativa, media supplementato con 5% FCS potrebbe essere utilizzata per estinguere attività tripsina. </li><li> Per rimuovere non dissociati ciuffi, la sospensione cellulare viene fatto passare attraverso un 40-pm di dimensione filtro a maglie. </li><li> La sospensione cellulare viene quindi centrifugata a 800 rpm (110g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in un volume adeguato di mezzo completo NSC. </li><li> Il volume finale della sospensione cellulare è regolata in modo che la densità cellulare non supera 2-3x10 6 -cells/ml. Ad alta densità cellulare potrebbe causare il blocco flusso nella macchina citometria a flusso. </li><li> Se si desidera isolare le cellule neuronali solo in base alle loro proprietà fisiche, ora si può procedere alla FACS smistamento come descritto nella parte 4. </li><li> Prima di smistamento, ioduro di propidio (PI, Sigma, 500 mg / ml in PBS) è aggiunto ad una concentrazione di 1 pl / ml di sospensione cellulare per escludere cellule morte. </li></ol> Vivi cell immunomarcatura Per ottenere una purezza più elevata di cellule neuronali, raccolte singola cellula dalla cultura NBA può essere colorato per PSA-NCAM (un indicatore dei primi progenitori neuronali immature) e poi le cellule positive da parte della popolazione neuronale può essere isolato utilizzando la macchina FACS. <ol><li> Dopo aver eseguito un conteggio delle cellule, la sospensione singola cellula dalla cultura NBA è diviso in quattro gruppi: <ul><li> Le cellule di gruppo, serve solo come controllo per regolare i parametri e cancelli (0,5-1 x 10 6 celle). </li><li> Cellule più PI, serve come controllo per regolare i parametri e cancelli (0,5-10 x 10 6 celle). Cellule PI negativi di questo gruppo possono essere ordinati in base alle caratteristiche fisiche cellule. </li><li> Secondario solo (Isotype gruppo di controllo) che serve anche come controllo per regolare i parametri e cancelli (1-2 x 10 6 cellule). </li><li> Immunomarcatura gruppo (8-10 x 10 6 cellule) che si è macchiato per PSA-NCAM per raggiungereulteriore purificazione delle cellule neuronali immature. Per escludere le cellule morte su ordinamento, PI viene aggiunto a questo gruppo pure. </li></ul></li><li> Per avviare immunomarcatura, le cellule vengono centrifugate a 800 rpm (110 g) per 5 min. Il supernatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in 100 pl di mezzo completo NSC. </li><li> Ficoeritrina (PE) coniugato anti-PSA-NCAM anticorpo viene aggiunto ad un rapporto di 10 microlitri / 5-10 x 10 6 cellule alla sospensione cellulare per essere colorati per PSA-NCAM. Allo stesso modo, un PE coniugato anticorpo IgG1 controllo isotipico viene aggiunto alla sospensione cellulare isotipo di controllo. Seguire le istruzioni sul foglio delle specifiche di anticorpi quanto riguarda la concentrazione di anticorpi da utilizzare. La sospensione cellulare viene quindi miscelata delicatamente e incubate a temperatura ambiente per 10-15 minuti in scuro. </li><li> Le sospensioni cellulari (PSA-NCAM e tubi controllo isotipico) vengono quindi centrifugati a 800 rpm (110 g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule sono ri-suspended in 1 ml di mezzo completo NSC. </li><li> Per rimuovere l&#39;eccesso non-limitati anticorpi dai campioni, 4 step è ripetuto 2-3 volte. </li><li> Dopo re-sospensione cellule in un volume adeguato di mezzo, ioduro di propidio (PI, Sigma, 500 mg / ml in PBS) è aggiunto ad una concentrazione di 1 pl / ml delle sospensioni di cellule (cellule più PI, isotipo di controllo e PSA- NCAM macchiate campioni) per escludere cellule morte quando analizzate mediante citometria di flusso. </li><li> 15 ml provette sterili falcon contenenti 1 ml di terreno completo sono pronti a raccogliere le cellule ordinati provenienti da diverse popolazioni cellulari. </li></ol> 5. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) di neuroni immaturi <ol><li> La macchina FACS è impostato in base al suo manuale d&#39;istruzioni tramite il tecnico esperto di citometria a flusso struttura. </li><li> Soluzione salina tamponata (PBS) o qualsiasi altra soluzione appropriata depending su istruzioni del produttore, potrebbe essere utilizzato come fluido di guaina a 28 PSI mediante un ugello 90 micron. </li><li> Pressione differenziale sul sistema sia regolato in modo che il tasso di innesco tipo non superi i 2500 eventi al secondo. </li><li> La sospensione cellulare dalle cellule gruppo solo viene eseguito attraverso la macchina FACS. </li><li> In primo luogo, le cellule (eventi) vengono riportati in base alla loro dimensione (Forward Scatter (FSC), luce) rispetto complessità interna (Side Scatter (SSC), luce) per distinguere diverse popolazioni cellulari. Per fare ciò, i parametri di tensione per FSC e SSC deve essere regolato in modo che le cellule possono essere visti nella trama citometria a flusso. </li><li> Per escludere ciuffi e farsetti cellule, le cellule vengono prima tracciate sulla base dell&#39;area dispersione in avanti (FSC-A) rispetto a larghezza d&#39;impulso scatter avanti (FSC-W) e la popolazione singola cellula è controllato come popolazione 1 (P1). Quindi le cellule P1 sono riportati sulla base di zona laterale scatter (SSC-A) rispetto scatter ampiezza di lato impulso (FSC-W) e questa volta le singole cellule sono gated in quanto popolazione 2 (P2). Avendo stabilito questi due porte consecutive, grumi o doppietti (FSC di alta larghezza di impulso e di alta SSC larghezza d&#39;impulso) sono stati esclusi. </li><li> Per escludere le cellule morte o danneggiate, le singole cellule (P2) sono tracciate sulla base di reattività rispetto PI FSC-A e la popolazione singola cellula dal vivo è recintato. </li><li> Singole cellule vive sono riportati sulla base di FSC rispetto SSC per distinguere diverse popolazioni cellulari in base alle dimensioni delle cellule e la granularità interna. In questa fase due popolazioni cellulari principali sono gated come FSC basso SSC bassa (P3) e FSC elevata SSC alta (P4) popolazioni cellulari. </li><li> Per ordinare PSA-NCAM cellule immature immuno-reattivi neuronali dalla bassa popolazione FSC SSC basso, il primo FSC popolazione a basso SSC basso da cellule di controllo (oltre a PI e isotipo di controllo) i gruppi è tracciata sulla base di immunoreattività PE rispetto FSC-A e il negativo cellule sono gated (P5), e poi le cellule positive da PSA-NCAMgruppo macchiato sono gated come popolazione 6 (P6). </li><li> Dopo aver regolato tutte le porte necessarie, le cellule di interesse vengono ordinati in 15 tubi di tessuto ml sterili contenenti 1 ml di coltura media NSC. </li><li> Ordinati cellule vengono quindi centrifugate a 1200 rpm (240 g) per 5 min. </li><li> Il supernatante viene scartato ed il pellet viene risospeso in un volume adeguato di mezzo (a seconda della dimensione pellet) e un conteggio delle cellule viene effettuato. </li><li> Le cellule vengono quindi piastrate in Poly-L-ornitina rivestite piastre da 96 pozzetti ad una densità di 20-30 x 10 3 cellule / pozzetto in 200-250 microlitri di terreno completo NSC con 5% FCS e 20 ng / ml umana ricombinante BMP4 5 . </li></ol> Nota: a mantello 96 pozzetti, 100 pl di soluzione di poli-L-ornitina lavoro (1,5 ml Poly-O e 8,5 ml di PBS sterile) viene aggiunto a ciascun pozzetto e la piastra viene incubata a 37 ° C incubatore per almeno un ore. Quindi, il Poly-O viene rimosso e ciascun pozzetto viene lavato tre volte con PBS sterile(Lasciare il PBS rimanere nel bene per 10 minuti ogni volta). Usare 500 pl di Poly-L-ornitina lavoro soluzione / se ben 24-pozzetti vengono utilizzati. <ol start="14"><li> Le cellule vengono poi fissati a tempi diversi dopo ditta utilizzando freddo paraformaldeide al 4% e immunomacchiate appropriati marcatori di cellule neuronali e gliali per valutare il fenotipo di cellule selezionate provenienti da diverse popolazioni cellulari. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Nella cultura neuroblasti differenziazione saggio (NBA), cellule placcati collegare al substrato coltura tissutale e crescere come monostrato. A seconda della densità iniziale placcatura delle cellule, la cultura si trasformerà in una cultura del 90-95% confluenti dopo 3-4 giorni. In questa fase, un monostrato di cellule principalmente astrocitari possono essere visualizzate sotto con piccole cellule progenitrici neuronali rotonde sopra 4,5 (Figura 1). Dopo il passaggio del mezzo su un supporto fattore di crescita libera, le cellule progenitrici neuronali iniziaredividono rapidamente e generare gruppi di cellule immature neuroblasti sopra del monostrato astrociti in 4-5 giorni (Figura 2). Analisi di citometria di flusso del dissociato cultura NBA il giorno 4-5 stadio di differenziazione, mostra due principali popolazioni cellulari; FSC SSC bassa bassa e FSC di alta SSC alto in base alle dimensioni delle cellule (FSC) e la granularità interna (SSC) (Figura 3). Immuno-fluorescente analisi delle celle ordinate indica che le cellule neuronali sono situate principalmente nelle basse FSC popolazioni SSC basso (con più del 75% della loro espressione β-tubulina III), mentre cellule selezionate dalla popolazione FSC alta SSC alta sono prevalentemente astrociti GFAP immunoreattive (Figura 4). Ulteriore purificazione delle cellule neuronali immature fino a quasi omogeneità (97%) potrebbe essere raggiunto con la selezione positiva del PSA-NCAM cellule IR da parte della popolazione FSC bassa SSC basso (Figura3, 4). Arricchito cellule neuronali generati dalle NSCs isolati da topo E14 eminenze gangliari acquisire un fenotipo GABAergico ed esprimere DARPP-32, un marker di neuroni spinosi medi, sulla differenziazione (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Test cultura neuroblasti dalla E14 cellule staminali neuronali di topo il giorno 4 della fase di proliferazione. Questa cultura monostrato costituito da celle piatte astrocitari (punte di freccia) sotto e rotonde cellule progenitrici neuronali (frecce) sulla parte superiore. Original ingrandimento; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="Figura 2"/> . Figura 2 test cultura neuroblasti dalla E14 cellule staminali neuronali di topo il giorno 4 dello stadio di differenziazione: A) contrasto di fase, B) colorazione immunofluorescenza. Si noti il cluster di cellule neuronali immature (frecce in A </strong&gt; e β tubulina III colorazione in B) sulla parte superiore del monostrato astrociti (punte di freccia in A, colorazione GFAP in B). Original ingrandimento; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="Figura 3"/> . Figura 3 appezzamenti di ordinamento rappresentativi: A). FSC vs SSC sorta plot prima esclusione di doppiette e cellule morte. B, C). Appezzamenti di ordinamento per l&#39;esclusione di doppietti a base di FSC e SSC larghezza d&#39;impulso. D). Esclusione delle cellule morte e danneggiate sulla base di immunoreattività ioduro di propidio. E). FSC vs SSC complotto dopo l&#39;esclusione di doppietti e cellule morte, che mostra i due principali popolazioni etichettati come la bassa FSC SSC bassa e gli alti FSC popolazioni SSC elevate. F, G). Appezzamenti Ordina per isolare PSA-NCAM cellule immature IR dal FSC di popolazione SSC basso. Micrografie rappresentativi Figura 4. A partire da cellule ordinati da diverse popolazioni un giorno dopo la placcatura. A) FSC bassa popolazione SSC bassa (più del 75% di queste cellule sono i neuroni). B) FSC di popolazione SSC alto (la maggior parte di queste cellule sono astrociti ). C) PSA-NCAM + cellule ordinati dalla popolazione FSC SSC bassa bassa (quasi tutte le celle sono ordinati neuroni). Ingrandimento originale, 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Ordinati neuroni immaturi differenziarsi in neuroni GABAergici (A) ed espressi DARPP-32 (B), un marker per medie neuroni spinosi.

<ol>
	<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis.">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li><li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient.">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La capacità di isolare definite popolazioni di cellule nervose (neuroni cioè, astrociti e oligodendrociti) potrebbe risolvere alcuni degli impedimenti connessi con l&#39;applicazione clinica delle cellule staminali neurali (NSC). In primo luogo, ci permette di caratterizzare completamente la popolazione di partenza di cellule del donatore. In secondo luogo, permette di utilizzare un particolare tipo di cellula o una combinazione di tipi di cellule diversi con un rapporto specifico, a seconda della natura o stadio dell...

<table border="1"><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC medio basale </td><td> Medio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC proliferazione Integratori </td><td> Supplemento media </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% di tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina di soia </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * I HEPES </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * Acqua distillata </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Cella filtro </td><td> Setaccio </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 pallone </td><td> Cultura ware </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 pallone </td><td> Cultura ware </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml provette </td><td> Cultura ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml provette </td><td> Cultura ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Fattore di crescita </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Fattore di crescita </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Fattore di crescita </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Ricostituita in PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Anticorpo </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-coniugata del mouse IgG1 </td><td> Isotype controllo dell&#39;anticorpo </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Fattore di crescita </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Ricostituita in PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Fattore di crescita </td><td> R &amp; D </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-OrnitHine </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Di siero di vitello fetale </td><td> Supplemento media </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Anticorpo </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III tubulina </td><td> Anticorpo </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Per fare HEM, mix 1 x 10 L pacchetto di MEM e 160 ml di HEPES 1M e portare il volume a 8,75 L con acqua distillata. Impostare il pH finale di 7,4 e conservarlo a 4 ° C.

the neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry

Le cellule staminali neuronali (NSC) possono essere isolate ed espanse in larga scala, utilizzando il saggio neurosfere e differenziato in tre tipi principali di cellule del sistema nervoso centrale (CNS); vale a dire, astrociti, oligodendrociti e neuroni. Queste caratteristiche rendono staminali neurali e cellule progenitrici una preziosa fonte rinnovabile di cellule per studi in vitro, come lo screening di stupefacenti, neurotossicologia ed elettrofisiologia ed anche per la terapia di sostituzione cellulare in molte malattie neurologiche. In pratica, tuttavia, l&#39;eterogeneità della progenie NSC, bassa produzione di neuroni e oligodendrociti, e il predominio di astrociti seguenti differenziazione limitare le loro applicazioni cliniche. Qui, descriviamo una metodologia innovativa per la purificazione e la successiva generazione dei neuroni immaturi di topo nati da NSC con fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS), la tecnologia. Usando questa metodologia, altamente arricchito neuronale popolazione di cellule progenitrici può essere realizzato spiritoHout qualsiasi astrociti evidente e bona fide contaminazione NSC. La procedura prevede differenziazione di progenie NSC isolate ed espanse da E14 eminenze gangliari topo con il test neurosfere, seguito da isolamento e arricchimento delle cellule neuronali immature base alle loro proprietà fisiche (dimensioni e complessità interna) e fluorescente citometria di flusso tecnologia. Nel complesso, ci vogliono 5-7 giorni per generare neurosfere e 6-8 giorni per differenziare progenie NSC altamente purificato e isolare cellule neuronali immature.

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The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Questo protocollo video viene illustrato un nuovo metodo per la generazione e la successiva purificazione delle cellule progenitrici neuronali da una fonte rinnovabile di cellule staminali neuronali (NSC) sulla base della loro fisico (granularità e dimensione interna) e proprietà di fluorescenza usando citometria di flusso tecnologia.

Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K Views.  The University of Florida. Questo protocollo video viene illustrato un nuovo metodo per la generazione e la successiva purificazione delle cellule progenitrici neuronali da una fonte rinnovabile di cellule staminali neuronali (NSC) sulla base della loro fisico (granularità e dimensione interna) e proprietà di fluorescenza usando citometria di flusso tecnologia.

Video: The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neuroscienze

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Citometria a flusso Protocolli per superficie e intracellulare Antigen analisi di tipi di cellule neurali

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Conteggio di cellule staminali neurali L&#39;utilizzo clonali Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...