Siamo in debito con C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet e tutto il personale delle strutture di origine animale; a J Baijer e N Dechamps per separazione delle cellule; O. Etienne per l&#39;assistenza tecnica, e A. Gouret per la sua assistenza amministrativa. Citometria a flusso e di smistamento delle cellule sono state effettuate presso il IRCM citometria a flusso di risorse condivise, istituito con contributi in conto impianti da DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fondation ARC, e CEA. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di Electricité de France (EDF). MD ha una borsa di studio da La Ligue Contre le Cancer e LM dalla regione Ile-de-France (DIM bioterapie). Marc-André Mouthon e François D. Boussin paternità quota co-maggiore.

Questo protocollo è stato progettato in conformità alle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) ed è stato approvato dal nostro benessere degli animali comitato istituzionale (CETEA-CEA DSV IDF). 1. Basic Setup Prima di Cultura e Videomicroscopy <ol><li> Utilizzare vetro piastre di coltura fondo o μ-Piastre per la microscopia confocale il video. Per 1 - 5 x 10 3 cellule / pozzetto, utilizzare piastre a 96 pozzetti e piastre da 24 pozzetti per più di 5 x 10 3 cellule / pozzetto. </li><li> Almeno un giorno prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento, preparare sterile poli-D-lisina (PDL) piastre rivestite per colture monostrato aderenti. Aggiungere abbastanza PDL (10 mg / ml in dH2O) per rivestire il fondo di ciascun pozzetto e incubare O / N a 37 ° C. Rimuovere la soluzione PDL e sciacquare tre volte con dH 2 O prima di consentire la piastra si asciughi nella cappa per almeno 2 ore, sotto flusso laminare. Se non utilizzato immediatamente, conservare la piastra rivestita in-20 ° C. </li><li> Preparare terreno di coltura mescolando NSC Basal Medium e NSC proliferazione Supplemento a rapporto 9: 1 (vedi tabella Materiale) con 2 mg / eparina ml, 20 ng / ml purificato umano fattore di crescita epidermico ricombinante (EGF), e 10 ng / ml umano fibroblasti crescita fattore ricombinante 2 (FGF-2). Riscaldare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua prima dell&#39;uso. </li><li> Per la dissociazione SVZ, preparare la soluzione di papaina: 1 mg / ml papaina (15 UI / ml) in Balance Salt Solution Earl (EBSS) contenente 0,2 mg / ml di L-cisteina, 0,2 mg / ml di EDTA, e 0,01 mg / ml DNasi I in PBS. Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro da 0,2 micron. Equilibrare la soluzione a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Per fermare la reazione enzimatica, preparare una soluzione inibitore della proteasi (ovomucoid): media F12 contenente 0,7 mg / ml di tripsina inibitore di tipo II: DMEM. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 micron. </li><li> Preparare PBS 0,6% soluzione di glucosio per raccogliere il cervello e PBS 0,15% BSA sOLUZIONE per fasi di lavaggio e per la colorazione degli anticorpi. </li><li> Preparare strumenti di dissezione: forbici, sezionando e legando pinze, bisturi. Ammollo in etanolo al 70%. </li></ol> 2. La raccolta di topo adulto Brains e SVZ Microdissections <ol><li> Sacrificio adulto FUCCI topi 23 (2-3 mesi e / o 12 mesi per gli studi invecchiamento) l&#39;esecuzione di una dislocazione cervicale in conformità con le linee guida istituzionali appropriate. </li><li> Spruzzare il mouse utilizzando etanolo al 70% e tagliare la testa con le forbici affilate. </li><li> Fare un&#39;incisione lungo il cuoio capelluto per rivelare il cranio. </li><li> Eseguire una linea mediana taglio longitudinale a partire dalla base del cranio verso bulbi olfattivi utilizzando un piccolo paio di forbici. Assicurati di evitare di danneggiare il cervello sottostante con le lame a forbice. Rimuovere la parte superiore aperta del cranio con pinze curve per esporre il cervello. </li><li> Raccogliere il cervello in una capsula di Petri 15 mm contenente 0,6% di glucosio in PBS. </li><li> Dissect via bulbi olfattivi. Posizionare il cervello sulla sua superficie dorsale e fare una sezione coronale attraverso il chiasma ottico con un bisturi. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, posizionare la parte rostrale della sezione cervello con la superficie rivolta verso l&#39;alto taglio coronale verso sperimentatore. </li><li> Per sezionare la SVZ, rimuovere il setto con una pinza sottile curva quindi inserire una punta di una pinza sottile nello striato immediatamente adiacente al ventricolo e staccare il SVZ dal tessuto circostante. Per ulteriori dettagli, fare riferimento a Azari et al. 24. Posizionare la SVZ sezionato in una capsula di Petri contenente 1 ml di PBS-0,6% di glucosio. </li></ol> 3. SVZ Tissue dissociazione <ol><li> Tritare la SVZ sezionato nella capsula di Petri finché non rimangono pezzi di grandi dimensioni. </li><li> Trasferire il tessuto tritato insieme alla% di glucosio PBS-0.6 in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di papaina pre-riscaldato (1mg / ml, preparato al punto 1.4) integrato con 0,01 mg / ml DNasi I. Incubare per 10 minuti in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Usare 1 ml di papaina per mouse. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato ovomucoid (0,7 mg / ml, preparato al punto 1.5) per fermare le attività papaina. Meccanicamente dissociare il tessuto tritato ulteriormente in una cella singola sospensione pipettando gentilmente su e giù per 20 volte attraverso una punta p1000 micropipetta. Evitare di bolle d&#39;aria. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 20 micron sterile in un nuovo tubo 15 ml. Assicurarsi di lavare il filtro cella con PBS 0,15% BSA per evitare di perdere le cellule. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 l di PBS contenente 0,15% di BSA. </li></ol> 4. immunofluorescenza per l&#39;ordinamento delle cellule Per l&#39;ordinamento delle cellule utilizzando FUCCI-Red topi (Figura 2A), utilizzare la seguenteAnticorpi: CD24 ficoeritrina-cyanine7 coniugati [PC7]; CD15 / LeX isotiocianato di fluorescina [FITC] coniugata e Ax647 FEG coniugato ligando. Nota: + cellule LeX + EGFR e + cellule EGFR non sono abbondanti nella SVZ adulta: ≈ 600 e 1500 cellule / topo rispettivamente 9. Si consiglia di mettere in comune le cellule SVZ da 2 a 3 topi di avere abbastanza materiale. Non lavorare con più di 12 topi nello stesso giorno in modo che la durata di ordinamento delle cellule non supera 3 ore. Tenete a mente che lavorare con troppi topi nello stesso giorno porterà ad un aumento della durata cell sorting possibilmente con conseguente aumento della morte cellulare e / o di differenziazione cellulare. <ol><li> Eseguire la colorazione FACS in 100 ml di PBS 0,15% BSA per topo (o in 200 microlitri per un gruppo di 2 a 3 topi per la colorazione ottimale). </li><li> Preparare le provette di controllo. Utilizzare sfere di compensazione per preparare singoli tubi di controllo del colore in base al produttore9; s protocollo. Selezionare una frazione di cellule (1/10 delle cellule estratte da un mouse è sufficiente) e separarlo in 4 tubi per preparare 1 tubo negativo di controllo (cellule non marcate) e 3 di fluorescenza meno uno (FMO) provette di controllo. Risospendere le cellule in 200 ml di PBS 0,15% BSA per provetta. Suggerimento: Per il controllo Lex-FITC FMO, etichettare le cellule con CD24-PC7 (01:50) e Ax647 coniugato EGF ligando (1: 200); per il controllo CD24-PC7 FMO, etichettare le cellule con CD15 / LEX-FITC (01:50) e Ax647 coniugato EGF ligando (1: 200) e per Ax647 coniugato controllo FMO FEG ligando, etichettare le cellule con CD15 / Lexmark FITC (01:50) e CD24-PC7 (01:50). </li><li> Per i tubi utilizzati per l&#39;ordinamento delle cellule, utilizzare i seguenti anticorpi alla diluizione indicata in PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (01:50), CD15 / LEX-FITC (01:50) e Ax647 coniugato ligando EGF (1: 200). </li><li> Incubare per 20 minuti a 4 ° C al buio. Lavare con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 xg per 10 min. Risospendere le cellule in 20081; l di PBS 0,15% BSA per cerebrale. Mantenere i tubi di ordinamento delle cellule su ghiaccio e procedere immediatamente alla separazione delle cellule. </li><li> Se si utilizzano topi FUCCI-verdi, frazioni LEX-positivi e Lex negativi separati utilizzando colonne di separazione prima cellula di smistamento delle azioni anticorpi LEX-FITC stessa lunghezza d&#39;onda di emissione di fluorescenza FUCCI-verde (Figura 3A, B). <ol><li> Innanzitutto, etichettare le cellule con un anti-umano LeX-anticorpo di topo (01:50) per 15 minuti a 4 ° C al buio in 100 ml di PBS 0,15% BSA. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 xg per 10 min, quindi etichettare le cellule con microsfere IgM anti-topo (1:10) per 15 minuti a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di PBS 0,15% BSA e centrifugare a 200 xg per 10 min. Risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS 0,15% BSA e versare le cellule attraverso colonna di separazione nel campo magnetico come schematizzato in figura 3 C. Lavare la colonna con 1 ml di PBS 0,15% BSA di ottenere frazione negativo Lex. </li><li> Per ottenere frazione LeX-positivo, rimuovere la colonna di separazione dal campo magnetico ed eluire le cellule con 2 ml di PBS 0,15% BSA. </li><li> Procedere alla CD24-PC7 e Ax647 coniugati ligando EGF colorazione come indicato al punto 4.2. </li></ol> </li></ol> 5. cella Ordinamento Nota: Le cellule sono state ordinate su una selezionatrice FACS a 40 Psi con un 86 micron noozle. La fluorescenza è stato raccolto utilizzando il seguente set di filtri: 520/35 nm (CIC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) e 740LP (PC7). Compensazione è necessaria per evitare segnali falsi-positivi come una sovrapposizione si trova tra gli spettri di emissione di fluorescenza FUCCI rosso e il colorante PC7. <ol><li> Immediatamente prima separazione delle cellule, aggiungere un colorante vitale per discriminare vivo dalle cellule morte. Abbiamo usato HO (vedi tabella materiali) a 2 mg / ml concentrazione finale. Eseguire la provetta del controllo negativo (cellule non marcate) attraverso il sorter FACS e selezionare °cellule e utilizzando side scatter (SSC) e parametri forward scatter (FSC) (Figura 1A). NOTA: Le cellule morte sono stati esclusi dal gating solo la frazione HO-negativo (Figura 1A &#39;) e poi doppiette stati esclusi selezionando Pulse Width frazione negativo (Figura 1A&#39; &#39;). </li><li> Eseguire i controlli monocolore previste al punto 4.2 e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) tensioni (scala cellule cioè popolazione negativa, troppo alte e / o positivi off) se necessario. Eseguire compensazione del colore nella finestra di compensazione del software. </li><li> Esegui FMO controlli disposti a passo 4,2 (LEX-FITC controllo FMO, CD24-PC7 controllo FMO e Ax647 coniugato controllo FMO EGF legante) e disegnare le porte di ordinamento (Figura 1). Ordinare le cellule direttamente in 100 ml di terreno di coltura in 1,5 ml microtubi. </li></ol> 6. Preparazione di cellule di Microscopia <ol><li> Piatto della cella appena ordinatos ad una densità di 1 - 3 x 10 3 cellule / pozzetto in Poly-D-Lysine- rivestite 96 pozzetti μ-Plate con 300 ml di terreno di coltura. </li><li> Prima videomicroscopia, incubare le piastre di coltura a 37 ° C e 5% CO 2 per almeno 1 ora per consentire l&#39;adesione cellulare. </li></ol> Setup 7. Microscopio e Image Acquisition <ol><li> Eseguire immagini dal vivo con obiettivo Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) in un sistema confocale microscopio a scansione laser collegata ad una camera termostatata invertita a 37 ° C sotto 5% di CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Posizionare il 96 pozzetti μ-Plate all&#39;interno della camera termostatata pre-riscaldato ed equilibrato e sostituire il coperchio da un coperchio termostatato. </li><li> Aprire il software NIS-Elements e cliccare nella barra dei menu &quot;Acquire / Acquisizione controlla / acquisizione ND&quot; per selezionare le opzioni del time-lapse (lunghezza, posizioni di scena, confocale z-sezioni, ...), &quot;Acquisire / controlli di acquisizione / Pad Ti221; per selezionare gli obiettivi e &quot;Acquire / controlli di acquisizione / A1plus Impostazioni&quot; per selezionare il livello di PMT per ogni fluorescenza nella barra dei menu. Selezionare la cartella in cui salvare i file di dati. </li><li> Utilizzando la finestra di acquisizione ND, impostare il centro di ogni pozzetto come posizione organizzare e selezionare l&#39;opzione immagine grande da 7 x 7 mm². Questo crea un&#39;immagine mosaico intorno al centro di ciascun pozzetto. Impostare la sovrapposizione per l&#39;immagine grande mosaico 5%. Scattare foto ogni 20 minuti per 24 ore. Selezionare l&#39;obiettivo del piano Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) nella finestra Ti Pad. </li><li> Nella finestra A1plus Impostazioni, acquisire immagini utilizzando lo scanner di risonanza ad alta velocità in un formato di 512 x 512 pixel con una risoluzione di 1,26 micron / pixel. Utilizzare campo chiaro di visualizzare forme cellulari. In caso di topi FUCCI-rossi, eccitare la fluorescenza a 561 nm rosso e raccogliere utilizzando un 595/50 nm filtro. Nel caso di FUCCI-Green topi, eccitare la fluorescenza verde a 488 nm e raccogliere con un 530/40 nm filtro. Determinare la PM ottimaleLivello di T, offset e potenza del laser per ogni lunghezza d&#39;onda. NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione di autofocus per il canale campo chiaro per consentire al software di autofocus in ogni posizione prima di ogni fase di acquisizione. Suggerimento: un Piano Apo VC 20x obiettivo DIC (NA: 0,75) è stato utilizzato per la sua eccellente risoluzione, senza la necessità di petrolio. Altri obiettivi possono essere utilizzate a seconda della risoluzione ottica desiderata. </li><li> Selezionare il pulsante &#39;Esegui ora&#39; nella finestra di acquisizione ND per iniziare l&#39;acquisizione. Suggerimento: seguire il lavoro al computer per 1 ciclo per essere sicuri che tutto funzioni correttamente. </li></ol> 8. Image Processing and Analysis <ol><li> Analizzare i dati direttamente sul software NIS-Elements tenendo traccia delle cellule singolarmente. Suggerimento: per guadagnare tempo, risparmiare ogni posizione in formato .avi utilizzando il software NIS-Elements e analizzare i film con ImageJ. </li><li> Nel software ImageJ, monitorare le singole cellule in fase di almeno 2 divisioni (cioè una cellulauna colonia quattro celle). Ritagliare una piccola area intorno alla cella e selezionare &#39;Immagine / Duplica&#39;. </li><li> Seleziona &#39;Immagine / Pile / Fai Montage&#39; nella barra dei menu per effettuare un montaggio. Specifica i fotogrammi da includere, le dimensioni delle immagini e salvare il montaggio come file .tif per risoluzione ottimale. </li><li> Per calcolare la prima SG 2 / M lunghezza fase (Figura 2C, D), selezionare una singola cella fluorescente rossa (in G 1) e quindi impostare t = 0 (fase S inizierà quando il rosso-fluorescenza spegne). Contare il numero di fotogrammi finché la cellula si divide per stimare la lunghezza SG 2 / M. NOTA: Il tempo calcolato dipende dall&#39;intervallo di tempo tra ogni fotogramma. </li><li> Per calcolare la successiva fase G1 (Figura 2C, D), continuerà a monitorare la cella che appena diviso. Se la cella divisa entra nella fase G1, ci sarà un accumulo di proteine ​​rosso fluorescente CDT1. Calcolare il numero di fotogrammi fino a rosso-fluorescenza spegne agaa ciascuna cella. Suggerimento: All&#39;inizio del G 1 fluorescenza rossa potrebbe essere debole in modo da scegliere l&#39;inizio della fase G 1 sul fotogramma in cui la cella è diviso per evitare approssimazioni. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+division+and+lineage+progression+in+vitro.">Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro.</a> Development. 138, 1057-1068 (2011).</li><li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+and+lineage+progression+of+neural+progenitors+in+the+ventricular-subventricular+zones+of+adult+mice.">Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).</li><li>Sakaue Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell+cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).</li><li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+lengthens+the+G1+phase+of+stem+cells+in+aged+mouse+brain.">TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain.</a> Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).</li><li>Roccio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+stem+cell+fate+changes+by+differential+cell+cycle+progression+patterns.">Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns.</a> Development. 140, 459-470 (2013).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse+two+cultures+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice.">One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres+re+evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open+a+critical+review+of+sphere+formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Spella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Licensing+regulators+Geminin+and+Cdt1+identify+progenitor+cells+of+the+mouse+CNS+in+a+specific+phase+of+the+cell+cycle.">Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle.</a> Neuroscience. 147, 373-387 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

La tecnica di ordinamento delle cellule qui descritta permette discriminazione affidabile tra NSC quiescente, le cellule staminali neurali attivati ​​ei loro studi progenie consentendo di loro proprietà e la dinamica del cervello adulto 9. Accoppiato con la tecnologia FUCCI che permette la visualizzazione del ciclo cellulare in cellule viventi 23, abbiamo sviluppato una tecnica rapida ed efficiente per seguire le G 1 e SG 2 / M fasi del ciclo cellulare da cellule cerebrali del mouse invecchiati e giovani adulti. La tecnica cell sorting utilizzata in questo protocollo è stata la prima combinazione convalidato di marcatori che permettono la purificazione dei cinque principali popolazioni neurogenici dalla SVZ 9. È stata anche la prima tecnica validata consente la distinzione di NSC quiescenti ed attivati. È interessante notare che questa tecnica non richiede l&#39;uso di topi transgenici per sé, che è necessaria quando adattato su modelli di topi transgenicich come FUCCI. Da allora, Codega et al. 10 hanno usato una combinazione di etichettatura tripla GFAP-GFP / CD133 / EGFR distinguere NSCs quiescenti dalla loro controparte attiva, ma non può essere adattato alla tecnologia FUCCI quanto richiede l&#39;utilizzo di GFAP-GFP topi transgenici. Mich et al. 11 hanno sviluppato un / EGFR / CD24 strategia di etichettatura tripla Glast che condivide i risultati comuni con la tecnica utilizzata in questo studio 9. In effetti, una forte correlazione tra Lex e marcatori Glast NSC è stato già osservato in Daynac et al. 9 studiare. Tuttavia, l&#39;anticorpo Glast utilizzato nella tecnica Mich et al. È accoppiato alla ficoeritrina e quindi non può essere adattato con l&#39;uso di topi FUCCI-rossi. Ci sono alcuni importanti punti tecnici che richiedono attenzione prima della cernita cellule SVZ. Innanzitutto, il passaggio di dissociazione è molto importante in quanto il tessuto cerebrale deve essere dissociate in singole cellule preservando la strutturaleintegrità delle proteine ​​utilizzate per la strategia di etichettatura anticorpo. 0,05% tripsina-EDTA ha dimostrato di essere molto efficace nel dissociare SVZ tessuto 27 ma l&#39;antigene LeX è risultato essere altamente sensibile come quasi tutti LeX-FITC immunofluorescenza era perso (dati non mostrati). Così, papaina è stato utilizzato come era più efficiente e meno distruttivo di altre proteasi su tessuto cerebrale. Inoltre, né LeX nè EGFR né CD24 sono stati influenzati dal trattamento papaina. Va notato che l&#39;etichettatura anticorpo è stato modificato se il trattamento papaina superato 15 min. Abbiamo ottenuto ottimi risultati con un trattamento papaina 10 min associato ad una dissociazione meccanica (pipetta su e giù per 20 volte). Il rivestimento poli-D-lisina permette coltura di cellule aderenti e la formazione di colonie dopo diversi giorni di coltura. E &#39;ormai ampiamente riconosciuto che in vitro viene fornito con i loro limiti 28,29. Si consiglia di determinare solo il primo ciclo cellulare perle cellule in almeno una successiva divisione per rimanere il più vicino possibile al fenotipo cellulare in vivo. È degno di nota ricordare che le proteine ​​Geminin (fluorescenza verde) e CDT1 (fluorescenza rossa) utilizzati per progettare il sistema FUCCI 23 sono stati precedentemente dimostrato di essere espressa abbondantemente dai progenitori neurali durante le prime fasi neurogenesi nei topi 30 e cervello adulto tessuti 9,25 . Anche se il mKO2-hCdt1 (30/120) costrutto è stato utilizzato prevalentemente nel presente studio per seguire la fase G1 con fluorescenza rossa, l&#39;utilizzo di entrambi i costrutti [mKO2-hCdt1 (30/120) e MAG-hGem (1/110) ] potrebbe essere previsto per consentire la visualizzazione delle principali fasi del ciclo cellulare (G 1 e SG 2 / M) e G 1 / S transizione 23. Il principale svantaggio di imaging bicolore È gli insiemi compatibili limitate di fluorescenza che può ancora essere utilizzato per la marcatura delle cellule. Una soluzione è quella di utilizzare Separatisu colonne. Ad esempio, abbiamo esaurito con successo la frazione CD24-positivo da cellule utilizzando colonne di separazione prima cellula di smistamento e live-imaging abbiamo utilizzato un anticorpo CD24-PE che condivideva la stessa lunghezza d&#39;onda di emissione di fluorescenza FUCCI-Rosso 25. Pochi studi hanno indagato la durata del ciclo cellulare delle popolazioni del mouse SVZ adulta. La lunghezza totale del ciclo cellulare ottenuta con la nostra tecnica è vicino a quello stimato in vitro da Costa et al. 21, ma siamo riusciti per la prima volta per distinguere le diverse fasi del ciclo cellulare. In uno studio in vivo, Ponti et al. 22 utilizzato l&#39;incorporazione di analoghi della timidina per determinare la dinamica proliferazione delle diverse popolazioni cellulari SVZ. Tuttavia, esse non potevano né eseguire un monitoraggio continuo del ciclo cellulare né monitorare le cellule a livello di singola cellula. Questo potrebbe essere un problema in quanto è stato dimostrato che una forte eterogeneità esiste spiritohin una data popolazione di cellule SVZ 22,25. Descriviamo qui un&#39;alternativa tecnica vitro, facile da configurare, che consente l&#39;imaging dal vivo delle fasi del ciclo cellulare di diverse popolazioni adulte neurogena a livello di singola cellula. Comprendere la regolazione del ciclo cellulare delle cellule staminali neurali e progenitori rimane una sfida per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici nel contesto di invecchiamento o di patologie del cervello. Il nostro protocollo può quindi avere una vasta gamma di applicazioni. Nel contesto di invecchiamento, questa tecnica potrebbe rivelarsi utile per capire gli effetti dell&#39;invecchiamento sulla NSC differenziazione. Infatti, è possibile identificare neurali cellule staminali / progenitrici entrano differenziazione loro intensità fluorescente rossa è tipicamente superiore 26. Infine, potrebbe anche essere di interesse per sfruttare la continua imaging dal vivo a livello di singola cellula per studiare la cellula processi intrinseci ed estrinseci responsabili della pro lignaggioprogressione di NSC adulte.

Cellule quiescenti staminali neurali (NSC) sono la fonte per neurogenesi adulta 1 e possono convertire in loro proliferante &quot;attivato&quot; forma che esprime i EGFR (aNSCs) 2. Una volta attivato, danno origine a cellule di transito amplificare (TAC) 3 e poi neuroblasti che migrano verso i bulbi olfattivi (OB) attraverso un tubo di astrociti e, infine, si differenziano in neuroni 4,5. NSC e la loro progenie sono organizzati in &quot;nicchie&quot; specializzati architetture lungo i ventricoli laterali, implicando una miriade di fattori che controllano la proliferazione 6. L&#39;isolamento e la purificazione di cellule neurogena SVZ è necessario illuminare la regolazione molecolare complessa di loro proliferazione, ma sono rimasti una sfida per lungo tempo a causa della mancanza di marcatori specifici e tecniche adatte. Nuovi approcci in citometria a flusso hanno reso possibile l&#39;isolamento di cellule staminali neurali e their progenie dall&#39;adulto SVZ 2,7-11. Usando il marcatore di cellule staminali LeX 12 lungo con neuroblasto marcatore CD24 13 e FEG a fluorescenza per etichettare EGFR in cellule proliferanti 2, abbiamo recentemente messo a punto una strategia FACS che permette la purificazione di cinque dei principali SVZ popolazioni neurogena: riposo e attivato NSC, TAC, immaturi nonché migrazione neuroblasti 9. Qui, descriviamo in dettaglio questa cella cernita e come Lex / EGFR / CD24 colorazione tripla permesso per la prima volta l&#39;isolamento di entrambi NSC quiescenti e attivati. Anche se la neurogenesi persiste durante l&#39;età adulta, la produzione di nuovi neuroni è drasticamente diminuito nel cervello che invecchia 14. La maggior parte degli studi concordano su una progressiva riduzione del numero di cellule proliferanti progenitrici nella SGZ e SVZ 15-20. Le conseguenze non sono innocuo come il declino relativo all&#39;età nella neurogenesi nel SVZ provoca una diminuzione di nneuroni ewborn nei bulbi olfattivi del cervello in età, in ultima analisi, che porta alla perdita di valore in una discriminazione olfattiva in età compresa tra 18 topi. Chiarire cinetica del ciclo cellulare dei progenitori neurali è un passo fondamentale per comprendere i meccanismi alla base dell&#39;evoluzione della neurogenesi adulta durante l&#39;invecchiamento. Recenti studi hanno indagato il ciclo cellulare e la progressione stirpe di cellule staminali neurali adulte in vitro 21 e in vivo, 22 ma nessuno di loro ha approfittato di tecniche di separazione delle cellule e le sonde del ciclo cellulare fluorescenti geneticamente codificate per visualizzare le fasi del ciclo cellulare delle cellule isolate a livello di singola cellula. Qui si descrive un protocollo che sfrutta i topi transgenici Fucci in cui le cellule sono fluorescenti durante il loro ciclo cellulare, che permette la distinzione tra G 1 e SG 2 / M 23 fasi. Questo protocollo dimostra come potenziale isolamento di cellule staminali neurali e la loro progenie da adulto mi FUCCIce combinato con videomicroscopia time-lapse consente lo studio della dinamica del ciclo cellulare a livello di singola cellula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well uncoated glass bottom culture plates&#160;</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P96G-1.5-5-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plates 96-well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A003E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult NSC Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroCult NSC Proliferation Supplement&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24010-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Ovomucoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>BD Medimachine Filcon</td>
			<td>340622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtubes 3810X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1595</td>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7]</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14776</td>
			<td>Mouse IgM; clone MMA. 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>332778</td>
			<td>Rat IgG2b; clone M1/69.&#160; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human LeX antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>559045</td>
			<td>Mouse IgM; clone MAM.&#160; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 - conjugated EGF ligand</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E35351</td>
			<td>1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompBeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>644204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>separation columns (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgM microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861405</td>
			<td>HO (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFLUX cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACS sorter (in the text)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>confocal laser scanning microscope (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>NIS-Elements software (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75)</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ti thermostated chamber</td>
			<td>Nikon Corp.</td>
			<td></td>
			<td>thermostated chamber (in the manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>RBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star, Ashland, OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCCI mice</td>
			<td>RIKEN BioResource Center, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Sakaue-Sawano et al. 2008</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell sorting of neural stem and progenitor cells from the adult mouse subventricular zone and live-imaging of their cell cycle dynamics

Le cellule staminali neurali (NSC) nella zona subventricolare dei ventricoli laterali (SVZ) sostenere la neurogenesi olfattiva per tutta la vita nel cervello dei mammiferi. Hanno successivamente generano cellule transito amplificando (TAC) e neuroblasti che si differenziano in neuroni una volta che integrano i bulbi olfattivi. Emerging fluorescente cellule attivate ordinamento tecniche (FACS) hanno permesso l&#39;isolamento di cellule staminali neurali e la loro progenie e hanno iniziato a far luce sulle reti di regolazione genica in nicchie neurogeni adulti. Riportiamo qui una tecnica separazione delle cellule, che permette di seguire e distinguere le dinamiche del ciclo cellulare delle popolazioni cellulari di cui sopra dalla SVZ adulto con un LeX / EGFR / CD24 colorazione tripla. Cellule isolate vengono poi placcati come cellule aderenti da scoprire dettagli loro progressione del ciclo cellulare mediante microscopia time-lapse video. A tal fine, usiamo transgenico fluorescenza Ubiquitinazione Indicatore ciclo cellulare (FUCCI) topi in cui le cellule sono di colore rosso fluorescente during G 1 fase a causa di un G 1 specifica giornalista rosso-CDT1. Questo metodo ha recentemente rivelato che le cellule staminali neurali proliferanti progressivamente allungano la loro fase G 1 durante l&#39;invecchiamento, con conseguente perdita di valore neurogenesi. Questo metodo è facilmente trasponibile ad altri sistemi e potrebbe essere di grande interesse per lo studio della dinamica del ciclo cellulare delle cellule cerebrali nel contesto di patologie cerebrali.

La capacità di discriminare in modo affidabile tra le diverse popolazioni di cellule del topo adulto stirpe di cellule staminali SVZ è primordiale per indagare le loro proprietà funzionali. A questo scopo, abbiamo sviluppato un / EGFR / CD24 strategia triple-etichettatura LeX che permette la purificazione di specifiche popolazioni di cellule dalla SVZ adulta: NSC quiescenti (LEX luminosi), le cellule staminali neurali attivati ​​(LEX + EGFR +), TAC (EGFR +) , neuroblasti immaturi e migrazione (CD24 + CD24 + e EGFR +, rispettivamente) 9 (Figura 1). Applicato a Fucci topi transgenici, la cella di cernita consente di imaging dal vivo delle fasi del ciclo cellulare delle diverse popolazioni neurogenici a livello di singola cellula 25. Topi FUCCI-Red sono stati usati per seguire il G 1 fase con fluorescenza rossa usando la microscopia time-lapse video (Figura 2A). Cellule neg FUCCI-rossi rappresentano le cellule in S-G 2 / M fasi del ciclo cellulare, le cellule pos FUCCI-rossi sono G 1 cellule e cellule brillanti FUCCI-rossi sono cellule che escono o fuori del ciclo cellulare (Figura 2B) 23,26. LeX + EGFR + e cellule EGFR + da giovane adulto (Figura 2C) e topi di mezza età (Figura 2D) sono stati placcati come cellule aderenti su piastre di coltura rivestite di poli-D-lisina. La prima fase SG 2 / M è stato identificato su cellule singole volta la fluorescenza rossa spegne finché la cellula si divide. Come già osservato il SG 2 / M lunghezza fase non ha mostrato differenze tra LeX + EGFR + e + cellule EGFR, sia in topi giovani o di mezza età. Poi abbiamo calcolato il prossimo G 1 lunghezza di fase dalla prima divisione fino alla fluorescenza rossa si spegne. È interessante notare che, una fase di allungamento G 1 è stato trovato durante l&#39;invecchiamento in + cellule LeX + EGFR, ma nonin cellule EGFR + 25 (figura 2C, D). Di conseguenza, neurosfere ottenute 5 giorni dopo la placcatura sono più piccole cellule LeX + EGFR + ottenuti da topi anziani, come mostrato nella Figura 2E. FUCCI-Green topi può essere utilizzato anche per visualizzare il SG 2 / M fase con fluorescenza verde (figura 3A, B), ma le cellule devono essere pre-ordinato con colonne di separazione come anticorpo LEX-FITC condivideva la stessa lunghezza d&#39;onda di emissione rispetto al FUCCI- fluorescenza verde (Figura 3C). Un esempio di fluorescenza FUCCI-verde per la prima SG 2 / M fase giovani adulti LeX + EGFR + e cellule EGFR + è mostrato in Figura 3D. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig1.jpg" /> Figura 1:. Strategia di selezione cellulare mediante FACS (A) Le cellule sono state prima selezionati secondo tmorfologia erede utilizzando dispersione laterale (SSC) vs parametri forward scatter (FSC). Per ulteriori dettagli sulla selezione cancello morfologia, si riferiscono a Daynac et al. 9 (A &#39;) Le cellule morte sono stati etichettati con HO marcatore ed esclusi dalla selezione. (A&#39; &#39;) Farsetti sono stati esclusi con il parametro di larghezza di impulso. (Etichettatura LEX-FITC / FUCCI-Red / EGF-Ax647; B) per impostare la cernita cancelli, Fluorescenza meno uno (FMO) controlla per CD24-PC7 e Lex-FITC (FUCCI-Red / EGF-Ax647 / CD24 etichettatura -PC7; B &#39;) sono stati utilizzati (C, C&#39;.) Quindi, porte di smistamento sono stati determinati in / EGF-Ax647 / CD24-PC7 tubi etichettati insieme con i controlli FMO LEX-FITC / FUCCI-Red. Le percentuali medi delle cellule totali sono rappresentati all&#39;interno dei cancelli. Se si seleziona CD24 + cellule (neuroblasts), fare attenzione a escludere le cellule che esprimono CD24 brillanti dal cancello. Infatti, CD24 luminoso corrispondono a ce ependimalells 2,9. C &#39;rappresenta le cellule negative CD24 (quadrati nero in C). Solo LeX + EGFR + e EGFR + (C &#39;) porte di smistamento sono stati utilizzati per questo studio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig2.jpg" /> Figura 2: analisi diretta del ciclo cellulare utilizzando topi FUCCI-Rosso (A) Rappresentazione schematica del ciclo cellulare FUCCI-Rosso, dove le cellule sono di colore rosso fluorescente in fase G1 e incolore durante SG 2 / M fasi 23 rappresentazione (B) FACS di.. fluorescenza FUCCI-rosso sulle cellule SVZ. (C, D) la microscopia Video con LeX + EGFR + e EGFR + cellule ordinati da giovane (C) e di mezza età (D) topi FUCCI-rosso permette il tracciamento della fase G 1 con fluorescenza rossa mentre l&#39;SG 2 / M fasi possono essere dedotte when la fluorescenza rossa si spegne. Immagini successive vengono visualizzate con una scala temporale presentato in Re. (E) Immagini rappresentative della colonie (neurosfere) ottenuti 5 giorni dopo la placcatura. Scala bar:. 10 micron (C, D), 30μm (E) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53247/53247fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig3.jpg" /> Figura 3:.. Strategia per le analisi in tempo reale del ciclo cellulare utilizzando topi FUCCI-Verdi (A) Rappresentazione schematica del ciclo cellulare FUCCI-verde in cui le cellule sono verdi durante SG 2 / M fase e incolore durante G1 fase 23 (B) la rappresentanza FACS di FUCCI-Green fluorescenza: cellule neg FUCCI-verdi rappresentano le cellule in G1 fase del ciclo cellulare durante FUCCI-Green cellule pos sono cellule in SG 2 / M 23. (C) Al fine di seguire la SG verde fluorescente 2 / M fasi della lex + EGFR + e cellule EGFR +, le cellule SVZ dovevano essere pre-ordinato con colonne di separazione. Le cellule sono state marcate con anti-topo LeX anticorpi e frazione LeX + è stato mantenuto sulla colonna utilizzando microsfere anti topo (vedi protocollo 4). Poi, Lex + e Lex - frazioni sono state eluite ed etichettati con EGF-Ax647 e gli anticorpi CD24-PC7 per FACS ordinamento (D) microscopia video della lex + EGFR + e EGFR + cellule ordinati da giovani topi FUCCI-verde consente il tracciamento di. la SG 2 / M fasi con fluorescenza verde. Immagini successive vengono mostrati con una scala temporale presentato in D. Scala bar: 10 micron (D).

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Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

cell-sorting-neural-stem-progenitor-cells-from-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Views.  CEA DSV iRCM SCSR, Laboratoire de Radiopathologie, UMR 967. We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Video: Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

La zona subventricolare En-face: colorazione Wholemount e flusso ependimale

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Ricerca

Neuroscienze

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a pseudostratified epithelium lining the lateral ventricles of the embryonic brain. Genotoxic stresses, such as ionizing radiation, have highly deleterious effects on the developing brain related to the high sensitivity of NSPC. Elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved depends on the characterization of the DNA damage response of these particular types of cells, which requires an accurate method to determine NSPC progression through the cell cycle in the damaged tissue. Here is shown a method based on successive intraperitoneal injections of EdU and BrdU in pregnant mice and further detection of these two thymidine analogues in coronal sections of the embryonic brain. EdU and BrdU are both incorporated in DNA of replicating cells during S phase and are detected by two different techniques (azide or a specific antibody, respectively), which facilitate their simultaneous detection. EdU and BrdU staining are then determined for each NSPC nucleus in function of its distance from the ventricular margin in a standard region of the dorsal telencephalon. Thus this dual labeling technique allows distinguishing cells that progressed through the cell cycle from those that have activated a cell cycle checkpoint leading to cell cycle arrest in response to DNA damage.
An example of experiment is presented, in which EdU was injected before irradiation and BrdU immediately after and analyzes performed within the 4 hr&#160;following irradiation. This protocol provides an accurate analysis of the acute DNA damage response of NSPC in function of the phase of the cell cycle at which they have been irradiated. This method is easily transposable to many other systems in order to determine the impact of a particular treatment on cell cycle progression in living tissues.

Administration of two analogs of thymidine, EdU and BrdU, in pregnant mice allows the analysis of cell cycle progression in neural and progenitor cells in the embryonic mouse brain. This method is useful to determine the effects of genotoxic stress, including ionizing radiation, during brain development.

Valutare progressione del ciclo cellulare delle staminali e cellule progenitrici del cervello di sviluppo del mouse dopo stress genotossico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

Colture organotipiche della corteccia umana adulta come modello ex vivo per il trapianto e la validazione di cellule staminali umane

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

"Mungitura cerebrale" di ratto per l'isolamento delle cellule progenitrici del tronco neurale e degli oligodendrociti

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new neurons and glia. One such niche is the subependymal zone (SEZ; also called the ventricular-subventricular zone), which is located across the lateral walls of the lateral ventricles, adjacent to the ependymal cell layer. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are abundantly distributed throughout the central nervous system, constituting a pool of proliferative progenitor cells that can generate oligodendrocytes.
Both NSCs and OPCs exhibit self-renewal potential and quiescence/activation cycles. Due to their location, the isolation and experimental investigation of these cells is performed postmortem. Here, we describe in detail &#34;brain milking&#34;, a method for the isolation of NSCs and OPCs, amongst other cells, from live animals. This is a two-step protocol designed for use in rodents and tested in rats. First, cells are &#34;released&#34; from the tissue via stereotaxic intracerebroventricular (i.c.v.) injection of a &#34;release cocktail&#34;. The main components are neuraminidase, which targets ependymal cells and induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor-2. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid are performed from the cisterna magna, in anesthetized rats without the need of an incision.
Results presented here show that isolated cells retain their endogenous profile and that NSCs of the SEZ preserve their quiescence. The denudation of the ependymal layer is restricted to the anatomical level of injection and the protocol (release and collection) is tolerated well&#160; by the animals. This novel approach paves the way for performing longitudinal studies of endogenous neurogenesis and gliogenesis in experimental animals.

Autore in primo piano: Raccolta di cellule staminali neurali e progenitrici da animali vivi utilizzando un nuovo protocollo di mungitura cerebrale 

A method for the isolation of neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells from the brains of live rats is presented here in experimental detail. It allows multiple collections of these cells from the same animals without compromising their well-being.

Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...