Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Ellison Medical (SDP, <a href="http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp" target="_blank">http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp</a> ), NIH K01AG031917 (NJL, <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) e NIH R01AG030593 (SDP). Questo lavoro ha utilizzato le risorse del Aging Drosophila Core (DAC) del Centro di Eccellenza Nathan Shock nella biologia dell&#39;invecchiamento finanziato dal National Institute of Aging P30-AG-013283 ( <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ). Gli autori desiderano ringraziare il Laboratorio Pletcher per le discussioni utili e, in particolare Brian Chung per la lettura critica del manoscritto. Si desidera ringraziare Nick Asher e Kathryn Borowicz per l&#39;assistenza con la raccolta dei dati.

Si consiglia la conservazione di alimenti, pasta di lievito sperimentali, e piastre di agar uva che appaiono nel protocollo a 4 ° C e il loro utilizzo entro 1-2 mesi fino a quando la muffa e l&#39;aridità non sono impostare in condizioni ambientali standard sia per la larve e adulti fase di manutenzione comportano mosche in un incubatore a 25 ° C con un ciclo luce 12:12 hr scuro e 60% di umidità relativa. 1. Preparazione di alimenti Sperimentale <ol><li> Per la crescita delle larve, si usa una versione modificata del Caltech Media 5, che è abbreviato in questo protocollo come CT. </li><li> Si consiglia una dieta per adulti Drosophila (SY), che consiste di zucchero (saccarosio) e lievito (lievito liofilizzato di birra intero) in una base di agar al 2%, che è stata bollita, integrato con antibiotici e anti-fungine agenti, e distribuito (10 ml per flaconcino) 6. Alimentare dovrebbe essere consentito di solidificare e far evaporare per 12-24 ore prima del rimessaggio. Perché l&#39;ambiente nutriente può sostanzialmente longevità impatto, la coerenza nei processi di cottura è essenziale sia all&#39;interno di un esperimento e per il confronto tra esperimenti. </li><li> Se un agente farmacologico deve essere aggiunto al cibo per adulti, questo farmaco può essere miscelato in un piccolo lotto di alimenti e stratificato (2 ml) sulla superficie alimentare, con le fiale di controllo ricevono strati contenenti il ​​solo veicolo. </li></ol> 2. Preparazione di una pasta di lievito vivo Unire 5-6 ml di acqua con 3 g di lievito secco attivo e mescolare bene. La consistenza della pasta di lievito dovrebbe essere quella di un burro di arachidi liscia. 3. Preparazione di una piastra di agar Grape <ol><li> Aggiungere un pacchetto di una premiscela agar uva in 500 ml di acqua distillata in un matraccio tarato da 1000 ml e seguire le istruzioni sulla confezione di sciogliere l&#39;uvaggio agar. </li><li> Versare con cautela uno spesso strato della miscela in piastre di Petri da 100 mm, evitando la formazione di bolle. Una bustina di premix produce circa 14 grape piastre di agar. </li><li> Ai media raffreddare e solidificare a temperatura ambiente con coperchi per 15 min. Piastre può essere conservato a 4 ° C, avvolto nella pellicola, o utilizzato immediatamente. </li></ol> 4. Raccolta di uova sincronizzato Tutti i mezzi utilizzati in questo protocollo, vale a dire lievito, piastre di agar uva, CT e il 10% il cibo SY, devono essere a temperatura ambiente. <ol><li> Stendere uno strato di 2-3 cm di diametro di lievito in pasta su una piastra di agar uva e mettere da parte. </li><li> Mettere una grande gabbia di raccolta delle uova su un CO 2 pad con la maglia sul lato verso il basso per anestetizzare le mosche. A base di azoto anestesia è un&#39;alternativa a CO 2, utilizzato da alcuni laboratori, che può produrre risultati di alta qualità 7. </li><li> Usando un imbuto, trasferire 150-200 coppie di mosche nella gabbia raccolta delle uova. </li><li> Posizionare la piastra di agar dell&#39;uva per coprire l&#39;estremità aperta della gabbia e fissare con un cappuccio terminale. </li><li> Posare la gabbia su un lato fino mosche svegliarsi.Quindi, assicurarsi che il gabbia uva lato piastra di agar verso il basso, in incubatrice durante la notte. </li><li> Il giorno dopo, scambiare la piastra d&#39;uva con una piastra di uva appena yeasted. Solo mettere circa 1 cm di diametro di pasta di lievito sulla superficie della piastra. Eliminare il giorno 1 ° piatto d&#39;uva. </li><li> Lasciare embrioni a raccogliersi sulla superficie della piastra di agar uva per 16-22 ore. Una volta fatto, raccogliere l&#39;uva piastra agar ed eliminare le mosche padre. </li><li> Lavare la superficie delle piastre di agar uva con 1x tampone fosfato isotonico (PBS). Le uova possono essere trasferite da raschiando delicatamente con un batuffolo di cotone. Fare attenzione a non graffiare, danneggiare o raschiare sottili pezzi di agar sulla superficie della piastra. Con l&#39;aiuto di un imbuto, versare le uova lavate in una provetta conica da 15 ml. </li><li> Lasciate che le uova si depositano sul fondo della provetta e versare il surnatante, facendo attenzione a non perdere tutte le uova. Il volume rimanente dovrebbe essere di circa 2-3 ml. </li><li> Aggiungere 8-10 ml di PBS al tubo e ripetere il precedente passo 2-3 morvolte posta di lavare accuratamente le uova fino a quando il surnatante è chiara. Come liberarsi di lievito residuo è la chiave in questa fase. </li><li> Dopo il lavaggio, prosciugare surnatante fino rimanente volume è di 2 ml. Aliquotare 32 pl di uova in bottiglie CT con un ampio foro punta della pipetta. Uova nel puntale della pipetta deve essere compatto, con poco o nessun liquido aspirato. Questo può essere ottenuto inserendo la punta della pipetta profondità nella composizione uovo e rilasciando lo stantuffo per aspirare. </li><li> Luogo testa di serie CT imbottiglia torna in incubatrice durante tutto lo sviluppo mosca. </li></ol> 5. Raccolta di pari età Adulto Flies <ol><li> Gli adulti in genere Eclose dal giorno 9 in poi. Eliminare le mosche emerse il primo giorno e bottiglie posto di nuovo in incubatrice durante la notte. Questa pratica sarà evitare la selezione involontaria per Emergents precoci e consentire la raccolta di un numero massimo di mosche sincronizzati. </li><li> 16-22 ore più tardi, trasferire il giorno di vita adulto vola into 10% SY alimentari bottiglie. Se necessario, un altro lotto possono essere raccolti il ​​giorno successivo. </li><li> Ritorno vola di nuovo nel incubatore e consentire in linea per raggiungere la maturità sessuale e compagno per due giorni. Registrare il giorno del trasferimento al 10% bottiglie SY come il primo giorno di adulta. </li></ol> 6. Ordinamento mosche e impostazione esperimento Longevità <ol><li> Anestetizzare piccoli gruppi di mosche sul pad anestetico, poi maschi e femmine di ordinamento in due gruppi utilizzando un pennello. Se si utilizza CO 2, è fondamentale ridurre al minimo l&#39;esposizione di prevenire possibili duraturi problemi di salute che possono compromettere l&#39;integrità dell&#39;esperimento longevità. </li><li> Posto 30 mosche dello stesso sesso in fiale singole. Supponendo che non cromosomi bilanciatori nella popolazione e progenie sana, ogni bottiglia dovrebbe produrre circa 3-4 fiale di ciascun sesso. Aliquotandolo mosche in fiale singole non dovrebbe richiedere più di 3-4 minuti, in modo che, in totale, le mosche sono solo esposti ad anestesia per un massimo di9-10 min. </li><li> Ripetere i passaggi 6,1-6,2 fino a quando ci sono 8-10 flacone replicati per ogni genere e trattamento sperimentale. </li></ol> 7. Impostazione del foglio di calcolo Excel per tenere traccia dell&#39;esperimento Longevità <ol><li> Si consiglia di randomizzazione posizione fiala piuttosto che fiale di raggruppamento di condizioni sperimentali, al fine di evitare distorsioni associate alla posizione flaconcino in incubatrice e di oscurare l&#39;identità fiala per lo sperimentatore. Per fare questo, prima assegnare un ID numerico casuale ad ogni flacone in un programma di foglio di calcolo, quindi disporre i flaconi in vassoi per numero ID. Se si utilizza il software di esperimento dLife gestione, seguire il tutorial sulla configurazione di esperimento per generare il numero di ID per ogni flacone. </li><li> (Facoltativo) Se si utilizza un lettore di RFID o lettore di codici a barre in associazione con dLife, collegare un codice a barre o tag RFID per ogni flacone e associare l&#39;etichetta con l&#39;ID numerico del flaconcino in dLife. Il programma riconosce ogni flacone durante la scansione con un lettoree guidare uno per registrare i dati nella posizione corretta in un foglio. Utilizzo di un lettore di tag in combinazione con dLife riduce significativamente il tempo di raccolta di dati e l&#39;errore di registrazione. </li></ol> 8. Mantenere l&#39;esperimento Longevità Le fiale contenenti alimenti freschi devono essere a temperatura ambiente per ogni trasferimento. <ol><li> Durante il periodo di sperimentazione, mosche trasferimento su nuovi flaconi contenenti cibo fresco ogni 2 giorni (donne giovani), o 3 volte a settimana (maschi o femmine&gt; 3 settimane di età). Questo passaggio farà in modo che l&#39;ambiente di alimentazione per le femmine giovani non viene interrotto dalla presenza di larve. Questo trasferimento dovrebbe essere completato senza anestesia, che può indurre la mortalità acuta, in particolare nei vecchi mosche (Pletcher, osservazioni personali). </li><li> Nel corso di ogni flacone di trasferimento, registrare l&#39;età, contare le mosche morte nel flacone vecchio, e le mosche morte che vengono trasportati al nuovo flacone. Registrare tali informazioni separatamente neldue colonne in un foglio di calcolo (sia dLife o il tuo foglio di calcolo). Questo farà sì che le mosche non sono effettuati due volte. Il numero totale di morti (morti + effettuata) dovrebbe almeno uguale al numero di mosche effettuate dal trasferimento precedente. Sottrarre il numero di mosche precedentemente svolte dal numero totale di decessi per determinare il numero di morti nuove. </li><li> Una mosca è considerata destro censurata se lasciato l&#39;esperimento prima della morte naturale attraverso la fuga o la morte accidentale. Animali in uscita l&#39;esperimento in questo modo deve essere inserito in una colonna a parte il giorno in cui la mosca è uscito l&#39;esperimento. Mosche censurati non sono registrati come morti (vedi sotto). </li><li> Continuare a ripetere i passaggi 8,1-8,2 fino a quando l&#39;ultimo sopravvissuto è morto. Essere consapevoli del fatto che, come l&#39;età mosche, alcune mosche può mentire sulla schiena e sembrano morti a causa della loro inactiveness. Pertanto, quando il conteggio mosche realizzate (morto), toccare il lato delle fiale per determinare se ci sono movimenti delle gambe. Se è così, thesmosche E sono ancora vivi. Nel caso in cui rimangono attaccate mosche per il cibo nel flaconcino vecchio ma vivo, non devono essere considerate come morta e deve essere salvato da un&#39;ulteriore maschiatura del flaconcino per rimuovere al volo. Censura mosche dovrebbero essere usati con cautela in quanto può causare pregiudizi sperimentale. </li></ol> 9. Analisi dei dati <ol><li> La curva di sopravvivenza mostra la probabilità che un individuo sopravvive a una certa età ed è di solito calcolato utilizzando un metodo Kaplan-Meier (Figura 1) 8. In assenza di dati censurati destro, la formula può essere semplificata in modo tale che l&#39;età-specifica sopravvivenza all&#39;età x (x S) è determinata dividendo il numero di individui viventi all&#39;inizio di un tempo censimento all&#39;età x (N x) per il numero totale di mosche nell&#39;esperimento (N 0); S x = x N / N 0. 9.2) le curve di sopravvivenza sono la forma più comune di presentazione dei dati, epuò essere testato per la parità tra i gruppi con un log-rank test. Ragionevole deduzione si può trarre da un minimo di 50-100 individui in una coorte. Sopravvivenza è una misura cumulativa, tuttavia e quindi morti che non sono legate all&#39;invecchiamento, come quelli nella prima infanzia, si deprimono sopravvivenza per tutta la durata rendendo difficile riscontrare specifici all&#39;invecchiamento. </li><li> Un secondo metodo di visualizzazione dei dati è l&#39;età-specifica funzione di mortalità, che visualizza il rischio di morire per ogni intervallo di età e presenta una descrizione più sfumata dei dati di sopravvivenza 9,10. Misure mortalità sono indipendenti da un&#39;età all&#39;altra, e la forma della curva di mortalità è utile per inferenza circa le dinamiche di invecchiamento, in particolare quando i trattamenti sono regolate durante la vita adulta. Le stime di mortalità specifica per età, tuttavia, mancano sia la precisione e l&#39;accuratezza con campioni di piccole dimensioni, e spesso richiedono molti-a-molti centinaia di individui per coorte per un es affidabiletimate 11. </li><li> Altri metodi per la stima delle differenze di longevità sono parametrici (ad esempio Gompertz) e semi-parametrici (ad esempio, della regressione di Cox) modelli. Questi modelli possono essere potenti, ma deve essere applicato con cautela a causa delle ipotesi formulate circa la forma delle curve di mortalità e la natura degli effetti del trattamento, che potrebbe portare a deduzione errata 11,12. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo qui presentato descrive un metodo per produrre misurazioni riproducibili di longevità adulto in Drosophila che è adattabile per la valutazione di interventi farmacologici, genetici e ambientali. Aspetti cruciali del protocollo includono controllando attentamente l&#39;ambiente di sviluppo larvale, riducendo al minimo lo stress degli adulti, e riducendo al minimo polarizzazione tra gruppi sperimentali e di controllo. Presentiamo anche l&#39;utilizzo del software di gestione dell&#39;esperimento d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Lieviti secchi attivi </td><td> Lievito di Fleishmann </td><td> 2192 </td><td></td></tr><tr><td> Uva Agar Premix Polvere </td><td> Genesee scientifico </td><td> 47-102 </td><td></td></tr><tr><td> Grande raccolta di embrioni Gabbie </td><td> Genesee scientifico </td><td> 59-101 </td><td></td></tr><tr><td> Grande ricambio Calotte di protezione </td><td> Genesee scientifico </td><td> 59-103 </td><td></td></tr><tr><td> 6 once bottiglie fondo quadro, in polipropilene </td><td> Genesee scientifico </td><td> 32-130 </td><td></td></tr><tr><td> Chiusure Flugs per Bottiglie Immagini </td><td> Genesee scientifico </td><td> 49-100 </td><td></td></tr><tr><td> DrosophilaFiale, Wide, polistirolo </td><td> Genesee scientifico </td><td> 32-117 </td><td></td></tr><tr><td> Chiusure Flugs per fiale larghe </td><td> Genesee scientifico </td><td> 49-101 </td><td></td></tr><tr><td> Ampi orifizio puntali Aardvark, 200 ul </td><td> Denville scientifico </td><td> P1105-CP </td><td></td></tr><tr><td> Flystuff Flypad, Formato standard </td><td> Genesee scientifico </td><td> 59-114 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 15 ml provette coniche </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-70C </td><td></td></tr><tr><td> FISHERBRAND piastre di Petri con coperchio trasparente, alzate Ridge; 100 OD x 15 mm H; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Kimax * Colorware Boccette 1.000 ml giallo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-200-47 </td><td></td></tr><tr><td> PBS pH 7,4 10x </td><td> Invitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> Gelidium Agar </td><td> Mooragar </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Lievito di birra </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0290331280 </td><td></td></tr><tr><td> Di zucchero semolato </td><td> Kroger </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Tegosept </td><td> Genesee scientifico </td><td> 20-266 </td><td> Fly conservante alimentare </td></tr><tr><td> Acido propionico, il 99% </td><td> Acros Organics </td><td> 149300025 </td><td> Fly conservante alimentare </td></tr><tr><td> Kanamicina solfato </td><td> ISC BioExpress </td><td> 0408-10G </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline HCl </td><td> VWR </td><td> 80058-724 </td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of lifespan in drosophila melanogaster

L&#39;invecchiamento è un fenomeno che si traduce in costante deterioramento fisiologico in quasi tutti gli organismi in cui è stato esaminato, con conseguente riduzione delle prestazioni fisiche e aumento del rischio di malattia. Invecchiamento individuale si manifesta a livello di popolazione, come un aumento della mortalità età-dipendente, che viene spesso misurata in laboratorio osservando la durata della vita in ampie coorti di individui di pari età. Gli esperimenti che cercano di quantificare la misura in cui le manipolazioni genetiche o ambientali impatto durata della vita in organismi modello semplici hanno riscosso un notevole successo per la comprensione degli aspetti dell&#39;invecchiamento che si conservano in taxa e per ispirare nuove strategie per estendere la durata della vita e la prevenzione della malattia associata all&#39;età nei mammiferi . La mosca dell&#39;aceto, Drosophila melanogaster, è un organismo modello attraente per lo studio dei meccanismi di invecchiamento a causa della sua relativamente breve vita, allevamento conveniente, e la genetica facili.Tuttavia, le misure demografiche di invecchiamento, tra cui l&#39;età-specifica e la mortalità, sono straordinariamente sensibili a variazioni anche minime nel disegno sperimentale e l&#39;ambiente, e il mantenimento di pratiche di laboratorio rigorose per tutta la durata degli esperimenti di invecchiamento è richiesto. Queste considerazioni, insieme con la necessità di praticare un attento controllo dei background genetico, sono essenziali per la generazione di misure robuste. In effetti, ci sono molte controversie notevoli circondano inferenza da esperimenti longevità in lievito, vermi, mosche e topi che sono stati tracciati di artefatti ambientali o genetici 1-4. In questo protocollo, si descrive una serie di procedure che sono stati ottimizzati per molti anni per misurare la longevità in Drosophila con fiale di laboratorio. Abbiamo anche descrivere l&#39;uso del software dLife, che è stato sviluppato dal nostro laboratorio ed è disponibile per il download ( <a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/ple</a>tcherlab / software). dLife accelera la produttività e promuovere le buone pratiche, integrando design ottimale sperimentale, semplificare la gestione e la raccolta dei dati mosca, e la standardizzazione delle analisi dei dati. Discuteremo anche le numerose insidie ​​potenziali nella progettazione, raccolta e interpretazione dei dati di durata della vita, e mettiamo a disposizione misure per evitare questi pericoli.

Uno schema semplificato del protocollo viene presentata in figura 1, dove sono riportate passaggi chiave. La parte del protocollo di sincronizzazione può essere utilizzato per vari metodi che richiedono mosche adulte pari età. Curve di sopravvivenza tipiche di wild-type mosche sono mostrati in figura 2a, utilizzando il software di gestione dLife esperimento (Figura 2b, c). Maschi adulti di solito vivono più breve, con entrambe le popolazi...

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Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster è un organismo modello potente per esplorare le basi molecolari della regolazione longevità. Questo protocollo discuterà i passaggi necessari per generare una riproducibile, basato sulla popolazione, la misurazione della longevità e gli eventuali rischi potenziali e come evitarli.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

measurement-of-lifespan-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

34.0K Views.  University of Michigan. Drosophila melanogaster è un organismo modello potente per esplorare le basi molecolari della regolazione longevità. Questo protocollo discuterà i passaggi necessari per generare una riproducibile, basato sulla popolazione, la misurazione della longevità e gli eventuali rischi potenziali e come evitarli.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Il monitoraggio delle funzioni cardiaca in larvali Drosophila melanogaster Per gli Studi fisiologici

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging attraverso il caso pupa di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Mantenimento di un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Cage Popolazione

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente Substrati in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Methods Article

Misura della durata della vita in