Dipartimento della Difesa (Premio Idea W81XWH-07-0406) - Per Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Per Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Per Ulus Atasoy University of Missouri fondi istituzionali - Per Ulus Atasoy

Esperimento di preparazione Prima di iniziare la sperimentazione, è fondamentale disporre di tutti i reagenti, contenitori e utensili RNasi libero. Trattare vetreria con RNasi inibitore (RNaseZAP, Ambion) seguito da risciacquo con acqua trattata con DEPC. Assicurarsi che tutti i reagenti sono confermati come RNasi libero. 1. Preparare mRNP lisato <ol><li> Coltivare e raccogliere le cellule del tessuto in crescita esponenziale a produrre tra 2-5 mg di proteina totale per ogni RIP. <ol class="lalpha"><li> Due piastre di coltura P150 sono in genere sufficienti. </li><li> Per ogni RBP in fase di studio, il numero totale ammonta cellulari e proteine ​​deve essere ottimizzata per massimizzare l&#39;mRNA di destinazione appropriata e le interazioni RBP. </li><li> RIP per qRT-PCR può richiedere meno lisato cellulare (circa 400 mg di proteine ​​totali) a causa della sua amplificazione e metodo di rilevazione soprattutto per RBP abbondanza elevati, come HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Cellule pellet tramite centrifugazione a 200 xg per 8-10 min a 4 ° C, quindi lavare tre volte con PBS ghiacciato. </li><li> Dopo il lavaggio finale, picchietti leggermente la parte inferiore del tubo e risospendere il pellet cellulare in volumi uguali di preparato tampone di lisi polisomi (PLB) con inibitori della proteasi e RNasi. <ol class="lalpha"><li> Si consiglia di misurare il volume esatto di pellet. </li></ol></li><li> Miscela delicatamente pipetta (non vortex) a spezzare grumi di cellule e incubare lisato in ghiaccio per 5 min. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg per 20 min a 4 ° C per cancellare il lisato di detriti. </li><li> Trasferire immediatamente eliminato sopranatante in pre-raffreddata provetta per microcentrifuga. </li><li> Tenere su ghiaccio e conservare a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Congelamento immediato completa la lisi adeguata delle cellule e previene il legame indesiderato. Procedere con disgelo campione RIP immediatamente dopo e mantenere i campioni in ghiaccio per evitare la degradazione dell&#39;RNA. &lt;/ Li&gt; <li> Questo lisato può essere conservato per un massimo di sei mesi a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo in quanto ciò può portare a proteine ​​e / o degradazione mRNA. </li></ol></li><li> Quantificare la concentrazione proteica nel lisato mediante saggio standard Protein Bradford. </li></ol> 2. Proteina di rivestimento A Perle Sepharose con anticorpi e Wash <ol><li> Pre-swell proteina A Sepharose (PAS) in perline overnight NT2 tampone (3-4 volumi) con 5% BSA. Conservare a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Conservazione a lungo termine fino a diversi mesi a 4 ° C è possibile quando è integrato con sodio azide allo 0,1%. </li><li> Perline Sepharose proteine ​​devono essere scelti sulla base di isotipo di anticorpo bersaglio RBP. Proteine ​​A, G e A / G tutti hanno obiettivi isotipo specifici e variano in affinità di destinazione. Proteine ​​perline A Sepharose sono stati utilizzati sulla base di specificità isotipo e affinità per gli anticorpi della proteina Hur. </li></ol></li><li> Prima dell&#39;uso, rimuovere l&#39;eccesso di tampone NT2, cosìche perle finali al rapporto del buffer è di 1:1. </li><li> Con 1,5 ml RNasi-free microprovette, rimuovere 100 pl di PAS liquami e aggiungere 30 mg di anticorpo per ogni reazione IP individuale (ad esempio, specifica RBP e controllo isotipo). </li><li> Aggiungere 100-200 ml di tampone per NT2 anticorpo miscela di sferette. <ol class="lalpha"><li> Miscela può essere conservata per diverse settimane a 4 ° C quando è integrato con 0,1% di sodio azide. </li><li> Un isotipo-abbinato anticorpo o tutta sieri normali da una stessa specie devono essere utilizzati in parallelo come un controllo anticorpo contro RNA sfondo. </li></ol></li><li> Aggiungi anticorpo opportuno miscela di sferette ed incubare una notte, cadendo fine sull&#39;estremità a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Ottimizzate il titolo anticorpale per proteina specifica in fase di studio (mg 1, 5, 10 o 30 di anticorpo è di solito sufficiente). </li></ol></li><li> Preparare anticorpi perle rivestite immediatamente prima dell&#39;uso mediante lavaggio con 1 ml dighiacciato NT2 buffer di 5 volte. <ol class="lalpha"><li> Lavare miscela di sferette per centrifugazione a 13.000 xg per 1-2 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con attenzione la quantità massima di supernantant con pipetta mano o aspiratore, ma stare attenti a non interrompere pellet. </li><li> Lavaggio aiuta a rimuovere l&#39;anticorpo non legato e contaminanti RNasi da miscela di anticorpi. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio è stato completato, risospendere le sfere in 700 pl di tampone ghiacciato NT2 seguita da trattamento con vari inibitori della RNasi per proteggere gli mRNA bersaglio, di cui 10 ml di RNasi a 40 U / pl, 10 pl di 100 mM DTT e 15 microlitri EDTA (15 mM). Portare il volume a 1000 ml con tampone NT2. <ol class="lalpha"><li> Complessi ribonucleosidi Vanadil non sono utilizzati a causa dell&#39;effetto inibitorio di EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprecipitazione e RNA Precipitazione <ol><li> Opzionale Passo preclear:<ol class="lalpha"><li> Per ridurre sfondo, perline e anticorpo di controllo può essere utilizzato per pre-clear lisato. Questo può ridurre il segnale in uscita. </li><li> Questo passaggio può essere necessario ridurre il fondo quando si fa IP seguita da microarray. Non è generalmente necessario per IP seguita da RT-PCR. </li><li> Preclear con 15 microgrammi di controllo isotipo per 30 min / 4 ° C fine oscillando negli fine. </li><li> Aggiungere 50 ml di perline preswollen PAS non rivestiti con anticorpo dal punto 2.1. </li><li> Incubare 30 min / 4 ° C con l&#39;estremità di rotazione rispetto a fine </li><li> Centrifugare a 10.000 xg a 4 ° C. Salva surnatante per IP. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 ml di lisato isolato eliminato (circa 2-5 mg) al mix di anticorpi preparati. <ol class="lalpha"><li> Diluizione lisato contribuirà a ridurre il fondo e legame non specifico. </li><li> Quantità di input lisato può variare a seconda del metodo di rilevazione e abbondanza di RBP oefficienza r di anticorpi RBP come indicato nel passo 1.1.c. </li></ol></li><li> (Facoltativo) Miscelare immediatamente tubo delicatamente muovendo più volte, centrifugando breve a 10.000 xg a 4 ° C per perline pellet e rimuovere immediatamente 100 pl di surnatante come rappresentazione totale mRNA input per analisi qPCR utilizzando le normali tecniche di isolamento dell&#39;RNA. <ol class="lalpha"><li> Questo passo è quello di confermare che l&#39;input lisato RNA è ottimale per IP e deve essere eseguita solo come un passo di controllo o come un passo di risoluzione dei problemi in seguito PIR con scarsi risultati RNA. </li></ol></li><li> Tube Wrap in parafilm per assicurare la tenuta stretta e incubare a 4 ° C per 2 a 4 ore, cadendo fine su fine. <ol class="lalpha"><li> Tempi di incubazione dovrebbe essere ottimizzato basato sull&#39;abbondanza bersaglio e deve essere minimizzato per evitare complesso riarrangiamento o degradazione. Per alcuni RBPs brevi incubazioni possono essere più ottimale. </li></ol></li><li> Perline pellet a 5.000 XGFo 5 min a 4 ° C il surnatante e potenziale per analisi mediante Western blot. Aliquote Conservare a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Aliquote di supernatante con elevate quantità di proteine ​​bersaglio residua può indicare un guasto della proteina per essere precipitato da perline sefarosio. </li></ol></li><li> Come descritto in precedenza, lavare perline 5 volte con 1 ml di tampone ghiacciato e NT2 centrifugazione (5000 xg per 5 minuti a 4 ° C), quindi rimuovere il surnatante con pipettatore mano o un aspiratore. <ol class="lalpha"><li> Metodi di lavaggio più rigorose possono essere utilizzati per ridurre sfondo completandolo NT2 tampone con sodio desossicolato, urea o SDS. </li><li> Tenere campioni in ghiaccio per quanto possibile e lavorare rapidamente per minimizzare la degradazione di mRNA bersaglio. </li></ol></li><li> Opzionale: Salva una piccola aliquota (10%) di miscela di sferette o eseguire un campione supplementare in parallelo per il controllo della efficienza IP proteina bersaglio mediante analisi Western blot.</li></ol> 4. DNasi e proteinasi K Trattamenti <ol><li> Dopo il lavaggio, risospendere le perline con 100 pl di tampone NT2 supplementato con 5 ml di RNase-free DNase 1 (2 U / pl). </li><li> Mantenere a 37 ° C per 5-10 min. Aggiungere 1 ml di tampone NT2 e centrifugare a 5000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. <ol class="lalpha"><li> Una piccola (~ 10%) aliquota di perle possono essere utilizzati per verificare l&#39;efficienza IP mediante SDS-PAGE. </li></ol></li><li> Risospendere PAS pellet in 100 microlitri tampone NT2, 5 pl proteinasi K (10 mg / ml), e 1 pl SDS 10%. </li><li> Incubare la miscela risospeso tallone per 30 min a 55 ° C in un bagno d&#39;acqua, delicatamente sfogliando ogni 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinasi K sarà di aiuto nel rilascio dei componenti RNP. </li></ol></li><li> Perline pellet a 5000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e raccogliere il surnatante (~ 100 pl). </li><li> Aggiungere 200 microlitri NT2 buffer perline, centrifugheFuge 5000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente, raccogliere il supernatante (~ 200 pl), e perline rigetti. </li><li> Combinare supernatanti (100 microlitri e 200 microlitri) e aggiungere strato inferiore 300 ul di acido fenolo-CHCl 3. </li><li> Vortice, 1 min RT (o 37 ° C in shaker) e centrifugare a 16.000 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li><li> Raccogliere 250 ml di strato superiore (NON interrompere l&#39;interfaccia), aggiungere 25 microlitri di acetato di sodio a pH 5,2, 625 microlitri ETOH 100% e 5 glycoblue microlitri, e mescolare bene. </li><li> Memorizzare una notte a -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Per garantire il corretto recupero di RNA, l&#39;aggiunta di glycoblue aumenterà la visibilità del pellet di RNA agendo come una molecola di trasporto. </li></ol></li><li> Il giorno seguente, i tubi Mescolare capovolgendo 3-5 volte, girare a 12.000 xg a 4 ° C per 30 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di 70% ETOH per il pellet blu e mescolare per inversione o vortex. </li><li> Centrifugare 12.000 xg a 4 ° C per 2 min. </li><li> Discard surnatante e centrifugare 12.000 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere qualsiasi residuo di ETOH 70% con una pipetta e pellet aria secca a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Risospendere in 20-40 microlitri RNasi / DNasi-free acqua o un altro volume appropriato in base alle esigenze. <ol class="lalpha"><li> Il campione è ora pronto per ulteriori applicazioni a valle, come qRT-PCR o microarray. </li><li> Spettrofotometria Nanodrop può essere utilizzato per valutare la concentrazione del campione, tuttavia, con campioni preziosi, può essere utile per evitare campioni nanodropping come può essere uno spreco e relativamente imprecisa. Si consiglia di campioni per la normalizzazione trascritti del gene housekeeping per valutare la purezza e l&#39;efficienza IP per campioni di rendimento preziosi o bassa. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi Se la procedura è ottimizzato ed eseguito correttamente, il immunoprecipitazione dovrebbe produrre un arricchimento significativo di mRNA target. Tipicamente, A seconda della sua destinazione e RBP mRNA (s), vediamo arricchimento di circa 10 - a 50 volte quando valutata mediante RT-PCR. Molti obiettivi RBP può essere scoperto in massa usando l&#39;analisi microarray. Tuttavia, questo metodo è più sensibile alla degradazione rispetto qRT-PCR. A seconda della RBP, il numero di obiettivi e l&#39;efficienza della reazione, microarray può rivelare centinaia di nuovi bersagli, o può scoprire solo pochi, se presente. Ad esempio, uno dei meglio caratterizzato RNA binding proteins HuR, post-trascrizionalmente regola l&#39;espressione e la traduzione di molti geni importanti fisiologiche 1, 2. Isolamento del HuR-ribonucleo-complesso tramite RIP-Chip in linee cellulari di tumore mammario, per esempio, ha rivelato arricchimento di alcuni importanti obiettivi Hur note, comprese β-actina mediante RT-PCR, come mostrato in Figura 1. Nelle linee di cellule tumorali sia β-actina è arricchito 12 - a 15 volte. In genere, quando eseguita correttamente vediamo un significativo Enrichment di β-actina in una varietà di linee cellulari. Tuttavia, se il RIP non rivela alcuna arricchimento significativo per la β-actina questo indica un problema con il RIP e la procedura può essere necessario ripetere. Inoltre, l&#39;analisi di campioni microarray immunoprecipitate da queste linee cellulari di espressione rivelato sottoinsiemi distinti di obiettivi in Hur recettore degli estrogeni (ER diversa) positive cellule MCF-7 cancro rispetto negativi per ER-MB 231 linee cellulari di tumore mammario come evidenziato in Figura 2 1. Tali obiettivi rientrano in diverse categorie: obiettivi Hur conosciuti e sconosciuti che erano o associati o non associati con il cancro. Ad esempio, CALM2 e CD9 sono entrambi geni del cancro che non sono stati precedentemente identificati come obiettivi Hur. Utilizzando il microarray e confermando con RT-PCR, e CALM2 CD9 sono risultati 5 - a 180 volte arricchito in pellet HuR indica una interazione tra la proteina prominente HuR e questi geni bersaglio. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figura 1&quot; /&gt; Figura 1. Immunoprecipitazione e RIP in MB-231 (ER-) e MCF-7 (ER +), le cellule di cancro al seno. Immunoprecipitazione sono stati eseguiti da MB-231 o MCF-7 lisati cellulari utilizzando anticorpi anti-Hur anticorpo monoclonale (3A2) e di controllo isotipo IgG1. A. IP occidentale HuR rivelato banda dimensioni previste, come rilevato da 3A2. Pannello a destra rivela quantità di HuR in ingresso lisati utilizzato da entrambe le linee cellulari, con β-tubulina come controllo di caricamento. B. Verifica da RT-PCR ha mostrato quindici e undici volte arricchimenti di β-actina, un bersaglio HuR noto, nei PI 3A2 da MB-231 e MCF-7, rispettivamente. Tutti i valori sono stati normalizzati per ΔΔCT GAPDH. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. HuR RIP-CHIP identifica distinti profili genetici in ER + e ER-cellule di cancro al seno.Immunoprecipitazione Hur sono state eseguite da MB-231 o MCF-7 lisati cellulari con anticorpi IgG1 e HuR controllo isotipo ibridato Illumina array Sentrix (47.000 geni). Segnali di controllo sono stati sottratti. I risultati rappresentano dati cumulativi da 12 matrici differenti. Esperimenti sono stati fatti in triplicato (n = 3) per ciascuna linea cellulare con controlli corrispondenti. Le scale sono log2.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

A causa della natura di questa ottimizzazione esperimento, e l&#39;esperienza saranno gli unici modi garantiti per acquisire con successo i risultati attesi. In molti passi di questo procedimento, la temperatura e la gestione efficiente di reagenti e prodotti sono criticamente importanti. Una corretta pianificazione e l&#39;esecuzione della tecnica aiuterà ad assicurare che l&#39;esperimento è stato eseguito in un periodo di tempo adeguato alle temperature ottimali consigliate. Una questione importante con gli esperimenti di isolamento di RNA è la sensibilità di RNA alla degradazione da RNasi. Tutti i reagenti devono essere RNasi libero e immagazzinati o utilizzati in contenitori privi di RNasi. Questo è un passo fondamentale per garantire l&#39;integrità del campione di mRNA. Anche quando l&#39;esperimento viene eseguito correttamente, tuttavia, il risultato desiderato non può essere raggiunto a causa della natura della interazione tra l&#39;RBP e suoi mRNA bersaglio. Un potenziale problema è avere basso o addirittura nessun segnale dal RNA isolato da RIP-Chip.Anche se ci può essere il segnale di RNA totale, questo può essere il risultato di insufficiente legame proteico essere tirato giù dalle perle. Il primo passo di risoluzione dei problemi è confermare che il lisato cellulare utilizzato ha espressione adeguata del RBP specifico. Alla conferma, le proteine ​​possono essere isolati dopo il lavaggio finale NT2 e risospese in tampone Laemmli o altro tampone appropriato denaturazione e riscaldata a 95 ° C per 5 min. Analisi Western blot può essere utilizzato su questi campioni in coordinamento con lisato ingresso nonché controlli negativi per garantire sufficiente tirare verso il basso di proteine ​​associate. Inoltre, poiché la lisi cellulare è necessario per accedere a questi componenti, il potenziale di interazioni anormali e indesiderabili tra proteine ​​normalmente separati e mRNA possono essere introdotti. Queste interazioni potrebbero legare e &quot;assorbire&quot; le mRNA bersaglio o proteine ​​di legame attraverso interazioni non specifiche. Inoltre, in queste proteine ​​co variandonditions può piegare in più varianti e dei loro motivi di legame può diventare inaccessibile ai loro mRNA bersaglio, impedendo loro interazioni. Entrambi rafforzare l&#39;importanza di lavorare efficacemente, nonché utilizzando le temperature ottimali elencati limitare queste interazioni indesiderate. Inoltre, l&#39;ottimizzazione delle condizioni di lavaggio per ogni proteina bersaglio specifico sarà fondamentale per massimizzare la purezza dell&#39;interazione. Condizioni di lavaggio più severi può essere necessaria. Per esempio, il tampone di lavaggio può essere integrato con SDS o una quantità appropriata di urea per ridurre le interazioni non specifiche e sfondo nel segnale di uscita. Questo sarà completamente dipendente RBP bersaglio dello sperimentatore nonché l&#39;mRNA bersaglio nelle loro condizioni fisiologiche uniche. Alcune condizioni non sarà adatto a determinati strumenti di analisi di mRNA, che devono essere conosciute per la preparazione dei campioni. Infine, anche se è riuscito a RIP l&#39;arricchimento di RNA-RBP interazioni, un problema ben noto con RIP (CHIP) metodo è l&#39;incapacità di identificare i domini di legame specifico del RBP sui bersagli mRNA transitori. Diverse tecniche di reticolazione può essere utilizzata seguita da RIP isolare obiettivi sequenza univoci, tuttavia, l&#39;uso di onde corte UV tende a portare a danni acido nucleico. Un nuovo metodo noto come PAR-CLIP, o reticolazione ribonucleoside fotoattivabile e immuoprecipitation, impiega onda lunga UV per incorporare thiouridine in RNA nascenti che consentono l&#39;identificazione di siti di legame unici sia da stabili e transitori interazioni RNA. Nel complesso, RIP-Chip è stato stabilito come un ottimo strumento utilizzato per isolare e studiare le interazioni tra proteine ​​legano l&#39;RNA e ai loro obiettivi di mRNA dal nostro gruppo, così come molti altri gruppi di ricerca. Anche se di natura sensibile e pratica, la corretta esecuzione di questa procedura produrrà l&#39;isolamento di questi complessi RNP, che fino a poco tempo fa, sono stati inaccessible per la scoperta e l&#39;analisi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 1 M ditiotreitolo </td><td> Pescatore </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNasi 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNasi libero </td></tr><tr><td> Etilendiammina Acid Tetraccetic </td><td> Pescatore </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glicogeno </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Pescatore </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> Pescatore </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Vedere di seguito </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lysis Buffer polisomi </td><td> * Vedere di seguito </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi cocktail compresse </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Proteina A Sepharose Beads </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Pescatore </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi Out inibitore della RNasi </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / pl </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Pescatore </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio dodecil solfato </td><td> Pescatore </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Pescatore </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Complessi ribonucleosidi Vanadil </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Workup </td></tr><tr><td> Preparare i reagenti in RNasi / DNasi-free, trattata con DEPC vetro </td></tr><tr><td> Lisi buffer polisomi </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> HEPES 10 mM (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 unità / ml RNasi Out </td></tr><tr><td> 400 pM VRC </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi tablet cocktail </td></tr><tr><td> 5 ml di tampone di lisi polisomi </td></tr><tr><td> Aggiungere 50 ml di 1 M HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 microlitri di 1 M KCl </td></tr><tr><td> 25 ml di 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 pl di NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml DNasi RNasi-free H 2 O </td></tr><tr><td> 50 ml di 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 microlitri di 100 U / ml RNasi Out </td></tr><tr><td> 200 pl cocktail di inibitori delle proteasi (dissolto secondo costruttore) </td></tr><tr><td> 10 pl 200 mM VRC (al momento dell&#39;uso) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 L di tampone NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml di Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml di NaCl 5 M </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 NP40 pl </td></tr><tr><td> 820 ml DNasi RNasi-free H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

Come risultato dello sviluppo di alta sequenziamento e analisi microarray efficiente, globale analisi di espressione genica è diventata una forma semplice e facilmente disponibile di raccolta dati. In numerose ricerche e modelli di malattia tuttavia, i livelli allo stato stazionario di mRNA target gene non sempre direttamente correlata con i livelli stabili di proteine ​​di Stato. Regolazione post-trascrizionale del gene è una probabile spiegazione della divergenza tra i due. Spinto dal legame di RNA binding proteins (RBP), regolazione post-trascrizionale riguarda la localizzazione mRNA, la stabilità e la traduzione formando un Ribonucleoproteina (RNP) complesso con mRNA bersaglio. Identificare questi obiettivi sconosciuti de novo da mRNA estratti cellulari nel complesso RNP è fondamentale per la comprensione dei meccanismi e delle funzioni del RBP e la loro conseguente effetto sulla produzione di proteine. Questo protocollo descrive un metodo denominato RNP immunoprecipitazione-microarray (RIP-Chip), che consente l&#39;identificazione di smRNA SPECIFICHE associato nel complesso ribonucleoproteina, alle mutevoli condizioni sperimentali, insieme con la possibilità di ottimizzare ulteriormente un esperimento per il singolo ricercatore. Con questo importante strumento sperimentale, i ricercatori possono esplorare i complessi meccanismi connessi con regolazione post-trascrizionale del gene, nonché le interazioni ribonucleoproteina altri.

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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.4K Views.  University of Missouri. Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Ricerca

Biologia

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificazione e caratterizzazione di glicosilazione delle proteine ​​con specifiche endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Mapping basato AFM delle proprietà elastiche delle pareti cellulari: al Tissue, cellulare, e le risoluzioni subcellulari

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procedura per valutare l&#39;efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Floema Sap campionamento da Brassica napus per 3D-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...