Dipartimento della Difesa (Premio Idea W81XWH-07-0406) - Per Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Per Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Per Ulus Atasoy University of Missouri fondi istituzionali - Per Ulus Atasoy

Esperimento di preparazione Prima di iniziare la sperimentazione, è fondamentale disporre di tutti i reagenti, contenitori e utensili RNasi libero. Trattare vetreria con RNasi inibitore (RNaseZAP, Ambion) seguito da risciacquo con acqua trattata con DEPC. Assicurarsi che tutti i reagenti sono confermati come RNasi libero. 1. Preparare mRNP lisato <ol><li> Coltivare e raccogliere le cellule del tessuto in crescita esponenziale a produrre tra 2-5 mg di proteina totale per ogni RIP. <ol class="lalpha"><li> Due piastre di coltura P150 sono in genere sufficienti. </li><li> Per ogni RBP in fase di studio, il numero totale ammonta cellulari e proteine ​​deve essere ottimizzata per massimizzare l&#39;mRNA di destinazione appropriata e le interazioni RBP. </li><li> RIP per qRT-PCR può richiedere meno lisato cellulare (circa 400 mg di proteine ​​totali) a causa della sua amplificazione e metodo di rilevazione soprattutto per RBP abbondanza elevati, come HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Cellule pellet tramite centrifugazione a 200 xg per 8-10 min a 4 ° C, quindi lavare tre volte con PBS ghiacciato. </li><li> Dopo il lavaggio finale, picchietti leggermente la parte inferiore del tubo e risospendere il pellet cellulare in volumi uguali di preparato tampone di lisi polisomi (PLB) con inibitori della proteasi e RNasi. <ol class="lalpha"><li> Si consiglia di misurare il volume esatto di pellet. </li></ol></li><li> Miscela delicatamente pipetta (non vortex) a spezzare grumi di cellule e incubare lisato in ghiaccio per 5 min. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg per 20 min a 4 ° C per cancellare il lisato di detriti. </li><li> Trasferire immediatamente eliminato sopranatante in pre-raffreddata provetta per microcentrifuga. </li><li> Tenere su ghiaccio e conservare a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Congelamento immediato completa la lisi adeguata delle cellule e previene il legame indesiderato. Procedere con disgelo campione RIP immediatamente dopo e mantenere i campioni in ghiaccio per evitare la degradazione dell&#39;RNA. &lt;/ Li&gt; <li> Questo lisato può essere conservato per un massimo di sei mesi a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo in quanto ciò può portare a proteine ​​e / o degradazione mRNA. </li></ol></li><li> Quantificare la concentrazione proteica nel lisato mediante saggio standard Protein Bradford. </li></ol> 2. Proteina di rivestimento A Perle Sepharose con anticorpi e Wash <ol><li> Pre-swell proteina A Sepharose (PAS) in perline overnight NT2 tampone (3-4 volumi) con 5% BSA. Conservare a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Conservazione a lungo termine fino a diversi mesi a 4 ° C è possibile quando è integrato con sodio azide allo 0,1%. </li><li> Perline Sepharose proteine ​​devono essere scelti sulla base di isotipo di anticorpo bersaglio RBP. Proteine ​​A, G e A / G tutti hanno obiettivi isotipo specifici e variano in affinità di destinazione. Proteine ​​perline A Sepharose sono stati utilizzati sulla base di specificità isotipo e affinità per gli anticorpi della proteina Hur. </li></ol></li><li> Prima dell&#39;uso, rimuovere l&#39;eccesso di tampone NT2, cosìche perle finali al rapporto del buffer è di 1:1. </li><li> Con 1,5 ml RNasi-free microprovette, rimuovere 100 pl di PAS liquami e aggiungere 30 mg di anticorpo per ogni reazione IP individuale (ad esempio, specifica RBP e controllo isotipo). </li><li> Aggiungere 100-200 ml di tampone per NT2 anticorpo miscela di sferette. <ol class="lalpha"><li> Miscela può essere conservata per diverse settimane a 4 ° C quando è integrato con 0,1% di sodio azide. </li><li> Un isotipo-abbinato anticorpo o tutta sieri normali da una stessa specie devono essere utilizzati in parallelo come un controllo anticorpo contro RNA sfondo. </li></ol></li><li> Aggiungi anticorpo opportuno miscela di sferette ed incubare una notte, cadendo fine sull&#39;estremità a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Ottimizzate il titolo anticorpale per proteina specifica in fase di studio (mg 1, 5, 10 o 30 di anticorpo è di solito sufficiente). </li></ol></li><li> Preparare anticorpi perle rivestite immediatamente prima dell&#39;uso mediante lavaggio con 1 ml dighiacciato NT2 buffer di 5 volte. <ol class="lalpha"><li> Lavare miscela di sferette per centrifugazione a 13.000 xg per 1-2 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con attenzione la quantità massima di supernantant con pipetta mano o aspiratore, ma stare attenti a non interrompere pellet. </li><li> Lavaggio aiuta a rimuovere l&#39;anticorpo non legato e contaminanti RNasi da miscela di anticorpi. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio è stato completato, risospendere le sfere in 700 pl di tampone ghiacciato NT2 seguita da trattamento con vari inibitori della RNasi per proteggere gli mRNA bersaglio, di cui 10 ml di RNasi a 40 U / pl, 10 pl di 100 mM DTT e 15 microlitri EDTA (15 mM). Portare il volume a 1000 ml con tampone NT2. <ol class="lalpha"><li> Complessi ribonucleosidi Vanadil non sono utilizzati a causa dell&#39;effetto inibitorio di EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprecipitazione e RNA Precipitazione <ol><li> Opzionale Passo preclear:<ol class="lalpha"><li> Per ridurre sfondo, perline e anticorpo di controllo può essere utilizzato per pre-clear lisato. Questo può ridurre il segnale in uscita. </li><li> Questo passaggio può essere necessario ridurre il fondo quando si fa IP seguita da microarray. Non è generalmente necessario per IP seguita da RT-PCR. </li><li> Preclear con 15 microgrammi di controllo isotipo per 30 min / 4 ° C fine oscillando negli fine. </li><li> Aggiungere 50 ml di perline preswollen PAS non rivestiti con anticorpo dal punto 2.1. </li><li> Incubare 30 min / 4 ° C con l&#39;estremità di rotazione rispetto a fine </li><li> Centrifugare a 10.000 xg a 4 ° C. Salva surnatante per IP. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 ml di lisato isolato eliminato (circa 2-5 mg) al mix di anticorpi preparati. <ol class="lalpha"><li> Diluizione lisato contribuirà a ridurre il fondo e legame non specifico. </li><li> Quantità di input lisato può variare a seconda del metodo di rilevazione e abbondanza di RBP oefficienza r di anticorpi RBP come indicato nel passo 1.1.c. </li></ol></li><li> (Facoltativo) Miscelare immediatamente tubo delicatamente muovendo più volte, centrifugando breve a 10.000 xg a 4 ° C per perline pellet e rimuovere immediatamente 100 pl di surnatante come rappresentazione totale mRNA input per analisi qPCR utilizzando le normali tecniche di isolamento dell&#39;RNA. <ol class="lalpha"><li> Questo passo è quello di confermare che l&#39;input lisato RNA è ottimale per IP e deve essere eseguita solo come un passo di controllo o come un passo di risoluzione dei problemi in seguito PIR con scarsi risultati RNA. </li></ol></li><li> Tube Wrap in parafilm per assicurare la tenuta stretta e incubare a 4 ° C per 2 a 4 ore, cadendo fine su fine. <ol class="lalpha"><li> Tempi di incubazione dovrebbe essere ottimizzato basato sull&#39;abbondanza bersaglio e deve essere minimizzato per evitare complesso riarrangiamento o degradazione. Per alcuni RBPs brevi incubazioni possono essere più ottimale. </li></ol></li><li> Perline pellet a 5.000 XGFo 5 min a 4 ° C il surnatante e potenziale per analisi mediante Western blot. Aliquote Conservare a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Aliquote di supernatante con elevate quantità di proteine ​​bersaglio residua può indicare un guasto della proteina per essere precipitato da perline sefarosio. </li></ol></li><li> Come descritto in precedenza, lavare perline 5 volte con 1 ml di tampone ghiacciato e NT2 centrifugazione (5000 xg per 5 minuti a 4 ° C), quindi rimuovere il surnatante con pipettatore mano o un aspiratore. <ol class="lalpha"><li> Metodi di lavaggio più rigorose possono essere utilizzati per ridurre sfondo completandolo NT2 tampone con sodio desossicolato, urea o SDS. </li><li> Tenere campioni in ghiaccio per quanto possibile e lavorare rapidamente per minimizzare la degradazione di mRNA bersaglio. </li></ol></li><li> Opzionale: Salva una piccola aliquota (10%) di miscela di sferette o eseguire un campione supplementare in parallelo per il controllo della efficienza IP proteina bersaglio mediante analisi Western blot.</li></ol> 4. DNasi e proteinasi K Trattamenti <ol><li> Dopo il lavaggio, risospendere le perline con 100 pl di tampone NT2 supplementato con 5 ml di RNase-free DNase 1 (2 U / pl). </li><li> Mantenere a 37 ° C per 5-10 min. Aggiungere 1 ml di tampone NT2 e centrifugare a 5000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. <ol class="lalpha"><li> Una piccola (~ 10%) aliquota di perle possono essere utilizzati per verificare l&#39;efficienza IP mediante SDS-PAGE. </li></ol></li><li> Risospendere PAS pellet in 100 microlitri tampone NT2, 5 pl proteinasi K (10 mg / ml), e 1 pl SDS 10%. </li><li> Incubare la miscela risospeso tallone per 30 min a 55 ° C in un bagno d&#39;acqua, delicatamente sfogliando ogni 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinasi K sarà di aiuto nel rilascio dei componenti RNP. </li></ol></li><li> Perline pellet a 5000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e raccogliere il surnatante (~ 100 pl). </li><li> Aggiungere 200 microlitri NT2 buffer perline, centrifugheFuge 5000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente, raccogliere il supernatante (~ 200 pl), e perline rigetti. </li><li> Combinare supernatanti (100 microlitri e 200 microlitri) e aggiungere strato inferiore 300 ul di acido fenolo-CHCl 3. </li><li> Vortice, 1 min RT (o 37 ° C in shaker) e centrifugare a 16.000 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li><li> Raccogliere 250 ml di strato superiore (NON interrompere l&#39;interfaccia), aggiungere 25 microlitri di acetato di sodio a pH 5,2, 625 microlitri ETOH 100% e 5 glycoblue microlitri, e mescolare bene. </li><li> Memorizzare una notte a -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Per garantire il corretto recupero di RNA, l&#39;aggiunta di glycoblue aumenterà la visibilità del pellet di RNA agendo come una molecola di trasporto. </li></ol></li><li> Il giorno seguente, i tubi Mescolare capovolgendo 3-5 volte, girare a 12.000 xg a 4 ° C per 30 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di 70% ETOH per il pellet blu e mescolare per inversione o vortex. </li><li> Centrifugare 12.000 xg a 4 ° C per 2 min. </li><li> Discard surnatante e centrifugare 12.000 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere qualsiasi residuo di ETOH 70% con una pipetta e pellet aria secca a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Risospendere in 20-40 microlitri RNasi / DNasi-free acqua o un altro volume appropriato in base alle esigenze. <ol class="lalpha"><li> Il campione è ora pronto per ulteriori applicazioni a valle, come qRT-PCR o microarray. </li><li> Spettrofotometria Nanodrop può essere utilizzato per valutare la concentrazione del campione, tuttavia, con campioni preziosi, può essere utile per evitare campioni nanodropping come può essere uno spreco e relativamente imprecisa. Si consiglia di campioni per la normalizzazione trascritti del gene housekeeping per valutare la purezza e l&#39;efficienza IP per campioni di rendimento preziosi o bassa. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi Se la procedura è ottimizzato ed eseguito correttamente, il immunoprecipitazione dovrebbe produrre un arricchimento significativo di mRNA target. Tipicamente, A seconda della sua destinazione e RBP mRNA (s), vediamo arricchimento di circa 10 - a 50 volte quando valutata mediante RT-PCR. Molti obiettivi RBP può essere scoperto in massa usando l&#39;analisi microarray. Tuttavia, questo metodo è più sensibile alla degradazione rispetto qRT-PCR. A seconda della RBP, il numero di obiettivi e l&#39;efficienza della reazione, microarray può rivelare centinaia di nuovi bersagli, o può scoprire solo pochi, se presente. Ad esempio, uno dei meglio caratterizzato RNA binding proteins HuR, post-trascrizionalmente regola l&#39;espressione e la traduzione di molti geni importanti fisiologiche 1, 2. Isolamento del HuR-ribonucleo-complesso tramite RIP-Chip in linee cellulari di tumore mammario, per esempio, ha rivelato arricchimento di alcuni importanti obiettivi Hur note, comprese β-actina mediante RT-PCR, come mostrato in Figura 1. Nelle linee di cellule tumorali sia β-actina è arricchito 12 - a 15 volte. In genere, quando eseguita correttamente vediamo un significativo Enrichment di β-actina in una varietà di linee cellulari. Tuttavia, se il RIP non rivela alcuna arricchimento significativo per la β-actina questo indica un problema con il RIP e la procedura può essere necessario ripetere. Inoltre, l&#39;analisi di campioni microarray immunoprecipitate da queste linee cellulari di espressione rivelato sottoinsiemi distinti di obiettivi in Hur recettore degli estrogeni (ER diversa) positive cellule MCF-7 cancro rispetto negativi per ER-MB 231 linee cellulari di tumore mammario come evidenziato in Figura 2 1. Tali obiettivi rientrano in diverse categorie: obiettivi Hur conosciuti e sconosciuti che erano o associati o non associati con il cancro. Ad esempio, CALM2 e CD9 sono entrambi geni del cancro che non sono stati precedentemente identificati come obiettivi Hur. Utilizzando il microarray e confermando con RT-PCR, e CALM2 CD9 sono risultati 5 - a 180 volte arricchito in pellet HuR indica una interazione tra la proteina prominente HuR e questi geni bersaglio. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figura 1&quot; /&gt; Figura 1. Immunoprecipitazione e RIP in MB-231 (ER-) e MCF-7 (ER +), le cellule di cancro al seno. Immunoprecipitazione sono stati eseguiti da MB-231 o MCF-7 lisati cellulari utilizzando anticorpi anti-Hur anticorpo monoclonale (3A2) e di controllo isotipo IgG1. A. IP occidentale HuR rivelato banda dimensioni previste, come rilevato da 3A2. Pannello a destra rivela quantità di HuR in ingresso lisati utilizzato da entrambe le linee cellulari, con β-tubulina come controllo di caricamento. B. Verifica da RT-PCR ha mostrato quindici e undici volte arricchimenti di β-actina, un bersaglio HuR noto, nei PI 3A2 da MB-231 e MCF-7, rispettivamente. Tutti i valori sono stati normalizzati per ΔΔCT GAPDH. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. HuR RIP-CHIP identifica distinti profili genetici in ER + e ER-cellule di cancro al seno.Immunoprecipitazione Hur sono state eseguite da MB-231 o MCF-7 lisati cellulari con anticorpi IgG1 e HuR controllo isotipo ibridato Illumina array Sentrix (47.000 geni). Segnali di controllo sono stati sottratti. I risultati rappresentano dati cumulativi da 12 matrici differenti. Esperimenti sono stati fatti in triplicato (n = 3) per ciascuna linea cellulare con controlli corrispondenti. Le scale sono log2.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

A causa della natura di questa ottimizzazione esperimento, e l&#39;esperienza saranno gli unici modi garantiti per acquisire con successo i risultati attesi. In molti passi di questo procedimento, la temperatura e la gestione efficiente di reagenti e prodotti sono criticamente importanti. Una corretta pianificazione e l&#39;esecuzione della tecnica aiuterà ad assicurare che l&#39;esperimento è stato eseguito in un periodo di tempo adeguato alle temperature ottimali consigliate. Una questione importante con gli esperimenti di isolamento di RNA è la sensibilità di RNA alla degradazione da RNasi. Tutti i reagenti devono essere RNasi libero e immagazzinati o utilizzati in contenitori privi di RNasi. Questo è un passo fondamentale per garantire l&#39;integrità del campione di mRNA. Anche quando l&#39;esperimento viene eseguito correttamente, tuttavia, il risultato desiderato non può essere raggiunto a causa della natura della interazione tra l&#39;RBP e suoi mRNA bersaglio. Un potenziale problema è avere basso o addirittura nessun segnale dal RNA isolato da RIP-Chip.Anche se ci può essere il segnale di RNA totale, questo può essere il risultato di insufficiente legame proteico essere tirato giù dalle perle. Il primo passo di risoluzione dei problemi è confermare che il lisato cellulare utilizzato ha espressione adeguata del RBP specifico. Alla conferma, le proteine ​​possono essere isolati dopo il lavaggio finale NT2 e risospese in tampone Laemmli o altro tampone appropriato denaturazione e riscaldata a 95 ° C per 5 min. Analisi Western blot può essere utilizzato su questi campioni in coordinamento con lisato ingresso nonché controlli negativi per garantire sufficiente tirare verso il basso di proteine ​​associate. Inoltre, poiché la lisi cellulare è necessario per accedere a questi componenti, il potenziale di interazioni anormali e indesiderabili tra proteine ​​normalmente separati e mRNA possono essere introdotti. Queste interazioni potrebbero legare e &quot;assorbire&quot; le mRNA bersaglio o proteine ​​di legame attraverso interazioni non specifiche. Inoltre, in queste proteine ​​co variandonditions può piegare in più varianti e dei loro motivi di legame può diventare inaccessibile ai loro mRNA bersaglio, impedendo loro interazioni. Entrambi rafforzare l&#39;importanza di lavorare efficacemente, nonché utilizzando le temperature ottimali elencati limitare queste interazioni indesiderate. Inoltre, l&#39;ottimizzazione delle condizioni di lavaggio per ogni proteina bersaglio specifico sarà fondamentale per massimizzare la purezza dell&#39;interazione. Condizioni di lavaggio più severi può essere necessaria. Per esempio, il tampone di lavaggio può essere integrato con SDS o una quantità appropriata di urea per ridurre le interazioni non specifiche e sfondo nel segnale di uscita. Questo sarà completamente dipendente RBP bersaglio dello sperimentatore nonché l&#39;mRNA bersaglio nelle loro condizioni fisiologiche uniche. Alcune condizioni non sarà adatto a determinati strumenti di analisi di mRNA, che devono essere conosciute per la preparazione dei campioni. Infine, anche se è riuscito a RIP l&#39;arricchimento di RNA-RBP interazioni, un problema ben noto con RIP (CHIP) metodo è l&#39;incapacità di identificare i domini di legame specifico del RBP sui bersagli mRNA transitori. Diverse tecniche di reticolazione può essere utilizzata seguita da RIP isolare obiettivi sequenza univoci, tuttavia, l&#39;uso di onde corte UV tende a portare a danni acido nucleico. Un nuovo metodo noto come PAR-CLIP, o reticolazione ribonucleoside fotoattivabile e immuoprecipitation, impiega onda lunga UV per incorporare thiouridine in RNA nascenti che consentono l&#39;identificazione di siti di legame unici sia da stabili e transitori interazioni RNA. Nel complesso, RIP-Chip è stato stabilito come un ottimo strumento utilizzato per isolare e studiare le interazioni tra proteine ​​legano l&#39;RNA e ai loro obiettivi di mRNA dal nostro gruppo, così come molti altri gruppi di ricerca. Anche se di natura sensibile e pratica, la corretta esecuzione di questa procedura produrrà l&#39;isolamento di questi complessi RNP, che fino a poco tempo fa, sono stati inaccessible per la scoperta e l&#39;analisi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 1 M ditiotreitolo </td><td> Pescatore </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNasi 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNasi libero </td></tr><tr><td> Etilendiammina Acid Tetraccetic </td><td> Pescatore </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glicogeno </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Pescatore </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> Pescatore </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Vedere di seguito </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lysis Buffer polisomi </td><td> * Vedere di seguito </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi cocktail compresse </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Proteina A Sepharose Beads </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Pescatore </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi Out inibitore della RNasi </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / pl </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Pescatore </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio dodecil solfato </td><td> Pescatore </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Pescatore </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Complessi ribonucleosidi Vanadil </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Workup </td></tr><tr><td> Preparare i reagenti in RNasi / DNasi-free, trattata con DEPC vetro </td></tr><tr><td> Lisi buffer polisomi </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> HEPES 10 mM (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 unità / ml RNasi Out </td></tr><tr><td> 400 pM VRC </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi tablet cocktail </td></tr><tr><td> 5 ml di tampone di lisi polisomi </td></tr><tr><td> Aggiungere 50 ml di 1 M HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 microlitri di 1 M KCl </td></tr><tr><td> 25 ml di 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 pl di NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml DNasi RNasi-free H 2 O </td></tr><tr><td> 50 ml di 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 microlitri di 100 U / ml RNasi Out </td></tr><tr><td> 200 pl cocktail di inibitori delle proteasi (dissolto secondo costruttore) </td></tr><tr><td> 10 pl 200 mM VRC (al momento dell&#39;uso) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 L di tampone NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml di Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml di NaCl 5 M </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 NP40 pl </td></tr><tr><td> 820 ml DNasi RNasi-free H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

Come risultato dello sviluppo di alta sequenziamento e analisi microarray efficiente, globale analisi di espressione genica è diventata una forma semplice e facilmente disponibile di raccolta dati. In numerose ricerche e modelli di malattia tuttavia, i livelli allo stato stazionario di mRNA target gene non sempre direttamente correlata con i livelli stabili di proteine ​​di Stato. Regolazione post-trascrizionale del gene è una probabile spiegazione della divergenza tra i due. Spinto dal legame di RNA binding proteins (RBP), regolazione post-trascrizionale riguarda la localizzazione mRNA, la stabilità e la traduzione formando un Ribonucleoproteina (RNP) complesso con mRNA bersaglio. Identificare questi obiettivi sconosciuti de novo da mRNA estratti cellulari nel complesso RNP è fondamentale per la comprensione dei meccanismi e delle funzioni del RBP e la loro conseguente effetto sulla produzione di proteine. Questo protocollo descrive un metodo denominato RNP immunoprecipitazione-microarray (RIP-Chip), che consente l&#39;identificazione di smRNA SPECIFICHE associato nel complesso ribonucleoproteina, alle mutevoli condizioni sperimentali, insieme con la possibilità di ottimizzare ulteriormente un esperimento per il singolo ricercatore. Con questo importante strumento sperimentale, i ricercatori possono esplorare i complessi meccanismi connessi con regolazione post-trascrizionale del gene, nonché le interazioni ribonucleoproteina altri.

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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.5K Views.  University of Missouri. Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Video: Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Ricerca

Biochimica

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetica

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biologia

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Metodo per l'isolamento e l'identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Riepilogo

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Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

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Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

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