Department of Defense (Idea Award W81XWH-07-0406) - Zum Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Um Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Um Ulus Atasoy University of Missouri Institutional Funds - Um Ulus Atasoy

Versuchsvorbereitung Vor Beginn Experiments ist es kritisch, alle Reagenzien, Behältern und Geräten RNase frei zu haben. Saures Glaswaren mit RNase-Inhibitor (RNaseZAP, Ambion) durch Spülen mit DEPC-behandeltem Wasser. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien wie RNase free bestätigt werden. Ein. Bereiten mRNP Lysate <ol><li> Züchten und zu ernten exponentiell wachsenden Gewebezellen zwischen 2-5 mg Gesamtprotein für jede RIP erzeugen. <ol class="lalpha"><li> Zwei P150 Kulturschalen sind in der Regel ausreichend. </li><li> Für jede RBP untersucht, müssen zelluläre Gesamt-Anzahl und Proteinmengen optimiert, um entsprechende Ziel-mRNA und RBP Wechselwirkungen zu maximieren. </li><li> RIP für qRT-PCR-Analyse erfordert möglicherweise weniger Zelllysat (ca. 400 pg Gesamtprotein) aufgrund seiner Amplifikation und Detektion Verfahren besonders für hohe Fülle RBPs wie HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Pellet-Zellen über Zentrifugation bei 200 xg für 8-10 min bei 4 ° C, dann dreimal mit eiskaltem PBS. </li><li> Nach dem letzten Waschen sanft Fingern an die Unterseite des Rohres und resuspendieren Zellpellet in gleichen Volumina von vorbereiteten Polysomen Lysepuffer (PLB) mit RNase und Proteaseinhibitoren. <ol class="lalpha"><li> Es wird empfohlen, zu messen, die genaue Volumen des Zellpellets. </li></ol></li><li> Gently Pipette Mischung (nicht vortexen) auseinander zu brechen Klumpen von Zellen und inkubieren Lysat auf Eis für 5 min. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 20 min bei 4 ° C, um das Lysat von Schutt zu löschen. </li><li> Sofortüberweisung Überstand gelöscht, um vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Keep on ice und bei -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Sofortige Einfrieren rundet das richtige Lyse der Zellen und verhindert unerwünschte Bindung. Fahren Sie mit dem RIP sofort folgende Beispiel Tauwetter und halten Proben auf Eis RNA-Abbau zu vermeiden. &lt;/ Li&gt; <li> Das Lysat kann gelagert werden bis zu sechs Monaten bei -80 ° C. Vermeiden wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen, wie dies an Protein und / oder mRNA-Abbau führen kann. </li></ol></li><li> Quantifizieren Proteinkonzentration im Lysat unter Verwendung von Standard Bradford Protein Assay. </li></ol> 2. Coat Protein A Sepharose Beads mit Antikörper und Wash <ol><li> Pre-Protein A-Sepharose Dünung (PAS)-Perlen über Nacht in NT2 Puffer (3-4 Volumina) mit 5% BSA. Lagerung bei 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Langzeitlagerung von bis zu mehreren Monaten bei 4 ° C ist möglich, wenn mit 0,1% Natriumazid ergänzt. </li><li> Protein Sepharoseperlen sollte basierend auf Isotyp des Antikörpers RBP Target ausgewählt werden. Proteine ​​A, G und A / G haben alle spezifischen Isotyp Ziele und unterscheiden sich in Ziel-Affinität. Protein A-Sepharose Kügelchen wurden basierend auf Isotyp Spezifität und Affinität für Protein HuR Antikörper verwendet. </li></ol></li><li> Vor Gebrauch entfernen überschüssiges NT2-Puffer, sodass die endgültige Perlen Puffer beträgt 1:1. </li><li> Verwendung von 1,5 ml RNAse-frei Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen 100 ul PAS Aufschlämmung und stell 30 ug Antikörper für jede einzelne IP-Reaktion (dh spezifische RBP und Isotyp-Kontrolle). </li><li> Fügen 100-200 ul NT2 Puffer Antikörper Beadgemisch. <ol class="lalpha"><li> Gemisch kann für mehrere Wochen bei 4 ° C gelagert werden, wenn sie mit 0,1% Natriumazid ergänzt. </li><li> Ein Isotyp-passenden Antikörper oder ganzen normalen Seren von derselben Spezies sollten parallel als ein Antikörper gegen Hintergrund Steuerung RNA verwendet werden. </li></ol></li><li> Fügen entsprechenden Antikörper zu Wulst-Mix und über Nacht inkubieren, Tumbling Ende über Ende bei 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Optimieren Antikörpertiter für spezifische Protein untersucht (1, 5, 10 oder 30 ug Antikörper ist normalerweise ausreichend). </li></ol></li><li> Planen Antikörper-beschichteten Kügelchen unmittelbar vor der Verwendung durch Waschen mit 1 mleiskalter NT2-Puffer 5 mal. <ol class="lalpha"><li> Waschen Beadgemisch durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 1-2 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die maximale Menge an Überstandes mit Hand Pipette oder Aspirator aber vorsichtig sein, zu verhindern, dass Pellets. </li><li> Waschen hilft bei der Entfernung ungebundenen Antikörper sowie RNase Verunreinigungen von Antikörper-Gemisch. </li></ol></li><li> Nach der letzten Wäsche abgeschlossen wurde, resuspendieren die Perlen in 700 ul eiskaltem NT2 Puffer durch Behandlung mit verschiedenen RNase-Inhibitoren gefolgt, um die Ziel-mRNAs, einschließlich 10 ul RNase Out bei 40 U / ul, 10 ul 100 mM zu schützen DTT und 15 ul EDTA (15 mM). Bringt Volumen 1.000 ul mit NT2 Puffer. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe werden nicht verwendet aufgrund Hemmwirkung von EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunpräzipitation und RNA Niederschlag <ol><li> Optional Preclear Schritt:<ol class="lalpha"><li> In den Hintergrund zu reduzieren, können Perlen und Kontroll-Antikörper vor, klare Lysat verwendet werden. Dies kann die Signal in der Ausgabe. </li><li> Dieser Schritt kann es notwendig sein Hintergrund zu reduzieren, wenn dabei IP mittels Microarray gefolgt. Es ist im Allgemeinen nicht notwendig, IP mittels qRT-PCR gefolgt. </li><li> Preclear mit 15 ug Isotypenkontrolle für 30 min / 4 ° C Taumeln Ende über Ende. </li><li> Fügen Sie 50 ul vorgequollenen PAS Perlen nicht mit Antikörper beschichtet ab Schritt 2,1. </li><li> Inkubieren 30 min / 4 ° C unter Rotation Ende über Ende </li><li> Zentrifugieren bei 10000 × g bei 4 ° C. Speichern Überstand für IP. </li></ol></li><li> Fügen Sie 100 ul der isolierten geklärte Lysat (ca. 2-5 mg) auf vorbereitete Antikörper-Mix. <ol class="lalpha"><li> Verdünnen Lysat wird dazu beitragen, Hintergrund und unspezifische Bindung zu reduzieren. </li><li> Anzahl der Lysat-Eingang kann je nach Nachweismethode und Fülle von RBP or Effizienz der RBP Antikörper, wie in Schritt 1.1.c. beachten </li></ol></li><li> (Optional) sofort mischen Rohr durch leichtes flicking mehrfach durch kurze Zentrifugation bei 10.000 × g bei 4 ° C bis Pellet Perlen und umgehend entfernen 100 ul des Überstandes als Gesamteingangsleistung mRNA Darstellung für qPCR Analyse unter Verwendung von Standard-Techniken RNA-Isolierung. <ol class="lalpha"><li> Dieser Schritt ist zu bestätigen, dass Eingangs-Lysat RNA ist optimal für IP und sollte nur als Prüfschritt oder als Schritt zur Problembehandlung nach RIP mit schlechter RNA Ergebnisse durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Wrap Rohr in Parafilm eindeutige Abdichtung und Inkubieren bei 4 ° C für 2 bis 4 Stunden zu gewährleisten, Taumeln Ende über Ende. <ol class="lalpha"><li> Timing der Inkubation sollte basierend auf dem Soll Fülle optimiert werden und sollte minimiert werden, um komplexe Umlagerung oder Zersetzung zu vermeiden. Für einige RBPs kürzere Inkubationen kann mehr optimal. </li></ol></li><li> Pellet Perlen bei 5.000 xgfoder 5 min bei 4 ° C und bis auf Potenzialanalyse Überstand durch Western blot. Shop Aliquots bei -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Aliquote des Überstandes mit hohen Mengen an restlichem Zielprotein kann auf ein Versagen des Proteins durch Sepharosebeads ausgefällt werden. </li></ol></li><li> Wie zuvor beschrieben, zu waschen Perlen 5 mal mit 1 ml eiskaltem NT2 Puffer und Zentrifugation (5.000 × g für 5 min bei 4 ° C) und dann mit der Hand zu entfernen Pipette oder einem Aspirator Überstand. <ol class="lalpha"><li> Strengere Waschverfahren kann verwendet werden, um Hintergrund durch Ergänzung NT2 Puffer mit Natriumdeoxycholat, Harnstoff oder SDS verringern. </li><li> Die Proben auf Eis so viel wie möglich und arbeiten schnell, um den Abbau der Ziel-mRNA zu minimieren. </li></ol></li><li> Optional: Speichern eines kleines Aliquot (10%) der Beadgemisch oder führen eine zusätzliche Probe parallel zur Kontrolle der Effizienz von IP Zielprotein mittels Western Blot-Analyse.</li></ol> 4. DNase und Proteinase K Behandlungen <ol><li> Nach dem Waschen resuspendieren Perlen mit 100 ul NT2-Puffer mit 5 ul RNase-freie DNase 1 (2 U / ul) ergänzt. </li><li> Halten bei 37 ° C für 5-10 min. 1 ml NT2 Puffer und Zentrifuge bei 5.000 xg für 1 min bei Raumtemperatur. <ol class="lalpha"><li> Eine kleine (~ 10%) Aliquot von Perlen verwendet werden, um die IP-Effizienz durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen. </li></ol></li><li> Resuspendieren PAS Pellet in 100 ul NT2-Puffer, 5 ul Proteinase K (10 mg / ml) und 1 ul 10% SDS. </li><li> Inkubieren der resuspendierten Kügelchen Mischung für 30 min bei 55 ° C in einem Wasserbad leicht auf jeder flicking 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinase K wird in der Veröffentlichung der RNP-Komponenten unterstützen. </li></ol></li><li> Pellet Perlen bei 5.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und den Überstand (~ 100 ul). </li><li> Fügen Sie 200 ul NT2 Puffer Perlen, Zentrifugenfuge 5.000 xg für 2 min bei RT, sammeln Überstand (~ 200 ul) und discard Perlen. </li><li> Kombinieren Überstände (100 ul und 200 ul) und 300 ul untere Schicht der Säure Phenol-CHCl 3. </li><li> Vortex, 1 min RT (oder 37 ° C im Shaker) und Zentrifuge bei 16.000 xg bei RT für 1 min. </li><li> Sammeln Sie 250 ul der oberen Schicht (nicht stören Schnittstelle), fügen Sie 25 ul Natriumacetat bei pH 5,2, 625 ul 100% EtOH und 5 ul glycoblue und gut mischen. </li><li> Bewahren Sie über Nacht bei -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Um eine einwandfreie Rückgewinnung der RNA zu gewährleisten, wird die Zugabe von glycoblue die Sichtbarkeit des RNA-Pellet, indem sie als Träger-Molekül zu erhöhen. </li></ol></li><li> Am folgenden Tag Spin Mischung Rohre durch Inversion 3-5 mal, bei 12.000 × g bei 4 ° C für 30 min und der Überstand verworfen. </li><li> 1 ml 70% EtOH auf die blaue Pellet und mischen durch Umdrehen oder Vortexen. </li><li> Zentrifuge 12.000 × g bei 4 ° C für 2 min. </li><li> Discard Überstand abzentrifugieren und 12.000 × g für 1 Minute bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie alle verbleibenden 70% EtOH mit einer Pipette und an der Luft trocknen Pellet bei RT für 5 min. </li><li> Resuspendieren in 20-40 ul RNase / DNase-freiem Wasser oder einem anderen geeigneten Volumen benötigt. <ol class="lalpha"><li> Probe ist nun bereit für weitere Downstream-Anwendungen wie qRT-PCR oder Microarray. </li><li> Nanodrop Spektrophotometrie kann bei der Beurteilung Probenkonzentration verwendet werden, jedoch mit wertvollen Proben kann es von Vorteil sein, nanodropping Proben zu vermeiden, da es sein kann, verschwenderisch und relativ ungenau. Wir schlagen vor, die Normalisierung Proben Housekeeping-Gen-Transkripte auf Reinheit und IP Effizienz für Edelsteine ​​oder geringe Ausbeute Proben zu beurteilen. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wenn das Verfahren optimiert und richtig ausgeführt, sollte der Immunpräzipitation ergeben signifikante Anreicherung von mRNA Ziele. Typisch, Abhängig von der RBP und seine mRNA Target (s), so sehen wir die Anreicherung von etwa 10 - bis 50-fache, wenn sie durch qRT-PCR untersucht. Viele Ziele RBPs kann en masse entdeckt werden mittels Microarray-Analyse. Jedoch ist dieses Verfahren anfällig für Degradation wie bei qRT-PCR verglichen. Abhängig von der RBP, die Anzahl von Zielen und den Wirkungsgrad der Reaktion kann Mikroarray offenbaren hunderte neuer Targets, oder es kann nur ein paar zu entdecken, wenn überhaupt. Beispielsweise einer der besseren dadurch RNA-Bindeproteinen HuR, post-transkriptionell reguliert die Expression und Translation von Genen viele wichtige physiologische 1, 2. Isolierung des HuR-ribonucleo-Komplexes mittels RIP-Chip in Brustkrebs-Zelllinien, beispielsweise offenbart Anreicherung von mehreren wichtigen bekannten HuR Ziele, einschließlich β-Actin-PCR unter Verwendung qRT wie in Abbildung 1 gezeigt. In beiden Krebszelllinien β-Aktin 12 angereichert - bis 15-fache. Normalerweise, wenn richtig durchgeführt sehen wir eine deutliche enrichment von β-Aktin in einer Vielzahl von Zelllinien. Allerdings, wenn die RIP nicht verraten keinen wesentlichen Bereicherung für β-Aktin deutet auf ein Problem mit dem RIP und das Verfahren kann wiederholt werden muss. Außerdem ergab Mikroarray-Analyse von immunpräzipitierten Proben aus diesen Zellinien deutliche Expression Teilmengen HuR Targets in verschiedenen Östrogenrezeptor (ER) positiven MCF-7 Krebszellen gegenüber ER negativen MB-231 Brustkrebs-Zelllinien, wie in 2 gezeigt, ein. Diese Ziele lassen sich in mehrere Kategorien: bekannte und unbekannte HuR Ziele, die entweder verbunden waren oder nicht im Zusammenhang mit Krebs. Zum Beispiel sind sowohl CALM2 und CD9 Krebsgene die nicht zuvor als HuR Targets identifiziert. Verwendung des Mikroarrays und Bestätigung mit qRT-PCR, CALM2 und CD9 erwiesen sich 5 - bis 180-fache in HuR Pellet angereichert, die eine Wechselwirkung zwischen dem prominenten HuR Protein und dieser Zielgene. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Abbildung 1&quot; /&gt; Abbildung 1. Immunpräzipitation und RIP in MB-231 (ER-) und MCF-7 (ER +) Brustkrebszellen. Immunpräzipitationen wurden von MB-231 oder MCF-7 Zelllysaten unter Verwendung von Anti-HuR monoklonalen Antikörper (3A2) und IgG1 Isotyp-Kontrolle. A. IP Western of HuR zeigte erwartete Größe band von 3A2 erkannt. Panel auf der rechten Seite zeigt Mengen von HuR im Eingang Lysate aus beiden Zelllinien verwendet, mit β-Tubulin als Ladekontrolle. B. Überprüfung durch quantitative RT-PCR zeigte fünfzehn und elf-fache Anreicherung von β-Aktin, ein bekannter HuR Ziel, in den 3A2 IPs von MB-231 und MCF-7, bzw.. Alle ΔΔCT Werte wurden auf GAPDH normalisiert. Experimente wurden in doppelter Ausführung (n = 2) erfolgt. <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. HuR RIP-CHIP identifiziert verschiedene genetische Profile in ER + und ER-Brustkrebszellen.HuR Immunpräzipitationen wurden von MB-231 MCF-7 oder Zelllysaten unter Verwendung HuR Antikörper und IgG1 Isotyp-Kontrolle hybridisiert Illumina Sentrix Arrays (47.000 Gene) durchgeführt. Steuersignale wurden abgezogen. Die Ergebnisse stellen die kumulativen Daten aus 12 verschiedenen Arrays. Experimente wurden in dreifacher Ausführung (n = 3) für jede Zelllinie mit passenden Kontrollen durchgeführt. Waagen sind log2.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Aufgrund der Natur dieses Experiments, Optimierung und Erfahrung wird die einzigen Möglichkeiten, um erfolgreich gewährleistet beschaffen die beabsichtigten Ergebnisse sein. In vielen Schritte dieses Verfahrens sind die Temperatur und effiziente Handhabung der Reagenzien und Produkte von entscheidender Bedeutung. Die richtige Planung und Ausführung der Technik wird dazu beitragen, sicherzustellen, dass das Experiment innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens an den optimalen Temperaturen empfohlen wurde durchgeführt. Ein Hauptproblem mit RNA Isolation Experimenten ist die Empfindlichkeit von RNAs den Abbau durch RNasen. Alle Reagenzien müssen RNase frei und gelagert oder verwendet in RNase-freiem Container sein. Dies ist ein entscheidender Schritt bei der Sicherstellung der Integrität Ihrer mRNA Probe. Selbst wenn das Experiment korrekt durchgeführt wird, kann jedoch das gewünschte Ergebnis nicht durch die Art der Wechselwirkung zwischen dem RBP und seiner Ziel-mRNAs erreicht werden. Ein potentielles Problem wird mit einer geringen oder gar kein Signal von der RNA durch die RIP-Chip isoliert.Obwohl es Signals von Gesamt-RNA sein kann, kann dies das Ergebnis einer unzureichenden Bindungsprotein ist heruntergezogen werden, die Perlen sein. Der erste Schritt bei der Fehlerbehebung ist zu bestätigen, dass die zelluläre Lysat verwendet adäquaten Ausdruck der spezifischen RBP hat. Nach Bestätigung kann Protein nach der endgültigen NT2 Waschen isoliert werden gewaschen und in Laemmli-Puffer oder einer anderen geeigneten denaturierenden Puffer und erhitzt bei 95 ° C für 5 min. Western-Blot-Analyse kann an diesen Proben in Koordination mit Eingangs Lysat sowie negative Kontrollen verwendet werden, um eine ausreichende Pulldown von assoziierten Protein. Darüber hinaus, weil Lysieren der Zelle ist erforderlich, um diese Komponenten zugreifen zu können, kann das Potential für abnorme und unerwünschte Wechselwirkungen zwischen normalerweise getrennten Proteine ​​und mRNA eingeführt werden. Diese Interaktionen könnten binden und &quot;tanken&quot; Ihre Ziel-mRNAs oder Proteine ​​durch unspezifische Wechselwirkungen. Zusätzlich Proteine ​​in diesen unterschiedlichen conditions kann in mehreren Varianten falten und ihre Bindungsmotive kann nicht zugegriffen werden, um ihre Ziel-mRNAs, die Verhinderung ihrer Wechselwirkungen. Beide stärken die Bedeutung der Zusammenarbeit effizient als auch die Nutzung der optimalen Temperaturen aufgeführt, um diese unerwünschte Wechselwirkungen zu begrenzen. Darüber hinaus wird die Optimierung der Waschbedingungen für jeden spezifischen Zielproteins kritisch sein, um die Reinheit der Wechselwirkung maximieren. Mehr stringenten Waschbedingungen erforderlich sein. Zum Beispiel kann der Waschpuffer mit SDS oder einer entsprechenden Menge an Harnstoff um unspezifische Wechselwirkungen und Hintergrund im Signalausgang reduzieren ergänzt werden. Dies wird völlig abhängig von der angestrebten Experimentator RBP sowie die Ziel-mRNA in ihrer einzigartigen physiologischen Bedingungen. Einige Bedingungen nicht geeignet sein für bestimmte mRNA-Analyse-Tools, die zur Vorbereitung von Proben von Bedeutung. Schließlich, obwohl RIP ist bei der Anreicherung von RNA erfolgreiche-RBP Interaktionen, ein gut bekanntes Problem mit RIP (CHIP)-Methode ist die Unfähigkeit, die spezifischen bindenden Domänen des RBP auf die vorübergehende mRNA Targets zu identifizieren. Mehrere Vernetzung Techniken können durch RIP einzigartige Sequenz Ziele zu isolieren verwendet befolgt werden, allerdings neigt die Verwendung von kurzwelligem UV-auf Nukleinsäure-Schäden führen. Ein neues Verfahren PAR-CLIP oder photoaktivierbaren Ribonukleosid Vernetzen und immuoprecipitation bekannt beschäftigt langwelligen UV bis in Thiouridin naszierende RNA, die eine Identifizierung der eindeutigen Bindungsstellen von sowohl stabil als auch transient RNA-Wechselwirkungen zu integrieren. Insgesamt hat RIP-Chip als hervorragendes Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen RNA-bindende Proteine ​​und ihre mRNA Zielsetzungen unserer Gruppe sowie viele andere Forschergruppen etabliert. Obwohl sensible Natur und Praxis wird ordnungsgemäße Durchführung dieses Verfahrens ergeben die Isolierung dieser RNP-Komplexe, die bis vor kurzem INACC habenessible für die Entdeckung und Analyse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1 M Dithiothreit </td><td> Fischer </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase-frei </td></tr><tr><td> Ethylendiamin Tetraccetic Säure </td><td> Fischer </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Fischer </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> Fischer </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Unten finden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysom ​​Lysis Buffer </td><td> * Unten finden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protein A-Sepharose Kügelchen </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Fischer </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Out RNase Inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Fischer </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fischer </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Fischer </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reagent Aufarbeitung </td></tr><tr><td> Planen Reagenzien in RNase / DNase-frei, DEPC behandeltem Glaswaren </td></tr><tr><td> Polysomen Lysepuffer </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 Einheiten / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 400 uM VRC </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail Tablette </td></tr><tr><td> 5 ml Lysepuffer Polysomen </td></tr><tr><td> Fügen Sie 50 ul 1 M HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 ul 1 M KCL </td></tr><tr><td> 25 ul 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 ul NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml RNase-DNase-freie H 2 O </td></tr><tr><td> 50 ul 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 ul 100 U / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 200 ul Protease-Inhibitor-Cocktail (gelöst laut Hersteller) </td></tr><tr><td> 10 ul 200 mM VRC (zum Zeitpunkt der Verwendung) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 l Puffer NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml 5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 ul NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml RNase-DNase-freie H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

Als Folge der Entwicklung von High-Throughput-Sequenzierung und effiziente Mikroarray-Analyse hat die globale Genexpressionsanalyse sich eine einfache und leicht zugängliche Form der Datenerfassung. In vielen Forschungs-und Krankheitsmodelle jedoch nicht steady state Ebenen der Zielgen-mRNA nicht immer direkt mit steady state Protein-Spiegel korrelieren. Post-transkriptionelle Genregulation ist eine wahrscheinliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen den beiden. Angetrieben durch die Bindung von RNA-bindende Proteine ​​(RBP), wirkt posttranskriptionale Regulierung mRNA Lokalisierung, Stabilität und Translation durch Bilden einer Ribonucleoprotein (RNP)-Komplex mit Ziel-mRNAs. Identifizierung dieser unbekannten de novo mRNA Targets aus Zellextrakten in der RNP-Komplex schwenkbar ist, um das Verständnis Mechanismen und Funktionen des RBP und deren resultierende Wirkung auf die Protein-Ausgang. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren genannt RNP Immunpräzipitations-Mikroarray (RIP-Chip), die für die Identifizierung von s ermöglichtpezifische mRNAs in der Ribonukleoproteinkomplex verbunden sind, unter wechselnden experimentellen Bedingungen, zusammen mit Optionen weiter zu optimieren, um ein Experiment für den einzelnen Forscher. Mit diesem wichtigen experimentelles Werkzeug, können die Forscher erkunden die komplizierten Mechanismen mit post-transkriptionellen Genregulation sowie andere ribonucleoprotein Wechselwirkungen verbunden.

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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K Aufrufe.  University of Missouri. Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Serie: Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Forschung

Biologie

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Phloem Sap Probenahme aus Brassica Napus für 3D-Seite von Protein und Ribonucleoprotein komplexe

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...