Gli autori desiderano ringraziare l&#39;US Army Medical Research e Materiel Command (numeri di sovvenzione W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) per il sostegno finanziario e il dottor Shawn Rigby dal Fondo Iowa State Citometria a flusso per l&#39;Università la sua assistenza tecnica di esperti.

1. Raccolta macrofagi alveolari (AMɸ) dal mouse attraverso il lavaggio del polmone <ol><li> Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) come un camice da laboratorio, guanti monouso e protezione per gli occhi. </li><li> Preparare completa AMɸ (cAMɸ) mezzo prima dell&#39;inizio della raccolta. Aggiungere 2,5 ml di penicillina / streptomicina (pen / strep) soluzione, 250 pl di β-mercaptoetanolo (2-mercaptoetanolo), e 25 mL di calore inattivato siero fetale bovino (FBS), a 222,25 ml di Dulbelcco Modified Eaglès Medium (DMEM). Filtro-sterilizzare medie cAMɸ utilizzando un 0,2 micron pori del filtro bottiglia formato superiore sotto vuoto. </li><li> Eutanasia un topo sano CO 2 asfissia in una camera euthanization. Sebbene un topo C57BL / 6 (6-8 settimane) è stato utilizzato per gli scopi di questo progetto, questa tecnica lavaggio polmonare possono essere eseguite su qualsiasi ceppo di topo. Utilizzando una bombola di gas compresso, lasciate flusso di gas nella camera per 1 minuto prima immissione del topo nel capambra per assicurare che la camera è completamente carica con CO 2. Posizionare il mouse nella camera per almeno un minuto a eutanasia il mouse. Inoltre, ciascun topo exsanguinate tramite puntura cardiaca come metodo fisico per confermare la morte topo come descritto in 1,4. </li><li> Lay mouse sul retro (lato dorsale), a spruzzo con 70% etanolo, individuare lo sterno e, ad un angolo di 30 gradi con l&#39;addome, inserire un ago di 23 gauge (attaccato ad una siringa da 1 ml) di circa 50 mm nella cavità toracica . Con corretto posizionamento dell&#39;ago, dovrebbe essere possibile raccogliere tra 0,4 e 1 ml di sangue a seconda delle dimensioni del mouse. Esaminare l&#39;animale per la cessazione dei segni vitali. </li><li> Luogo del mouse sul banco di laboratorio in modo che è sdraiato sul suo addome (lato ventrale). Spray del mouse con il 70% di etanolo per sterilizzare l&#39;ambiente di lavoro. Pizzica la pelle circa a metà strada lungo la spina dorsale del mouse. Dissezione con forbici che sono stati sterilizzati con etanolo al 70%, fanno una piccola incisione attraverso la pelle. &lt;/ Li&gt; <li> Afferra la pelle su entrambi i lati dell&#39;incisione e tirare la pelle in direzioni opposte lungo il cranio-caudale asse del mouse. Se eseguita correttamente, la pelle viene rimosso dalla carcassa sottostante. </li><li> Il collo del mouse dovrebbe ora mostrare i muscoli e le ghiandole esposti. Tagliare con cautela che il tessuto e tirarlo verso la parte anteriore del mouse utilizzando una pinza, esponendo così la laringe, trachea, esofago e del mouse. Evitare di tagliare la vena giugulare o carotide. </li><li> La trachea è ora visibile ed è identificabile come il tessuto con anelli cartilaginei intorno ad esso. Delicatamente tenere la trachea con una pinza e delicatamente sollevare e separare la trachea dall&#39;esofago, che si trova sul lato dorsale. </li><li> Fai una piccola incisione anteriore al punto in cui si sostiene la trachea, ma posteriore alla laringe. L&#39;incisione dovrebbe essere effettuato a circa 45 ° gradi. Inoltre, non completamente transetto della trachea, in quanto ciò gli impedirà di rientro inla cavità del corpo. </li><li> Riempire una siringa da 1 cc munito di un catetere Cat Tom con PBS sterile in preparazione per inserire il catetere nel lume della trachea. Tenere la trachea utilizzando una pinza e con la mano tenere il catetere in prossimità della punta per aumentare il controllo e delicatamente inserirlo nel sito di incisione tracheale. Inserire delicatamente catetere nella trachea circa 20 mm. Afferrare la trachea che è attorno al tubo del catetere, liberando dall&#39;altro. </li><li> Uso di una siringa da 1 ml munito del catetere, delicatamente infondere 0,75 mL di temperatura ambiente, PBS sterile nei polmoni e poi delicatamente aspirare il retro PBS in siringa. Ripetere questa operazione per tre volte mentre esternamente massaggiare il torace. Scollegare la siringa dal catetere ed erogare il liquido di lavaggio in una provetta da centrifuga da 15 mL. Dopo aver riempito la siringa con 0,75 mL di PBS fresco e ricollegando la siringa al catetere, ripetere i punti 1,9 e 1,10 volte per ogni mouse. Il recupero del fluido può essere parziale, ottenendo inferiore VOLume infuso. Se la raccolta di cellule provenienti da più di un mouse, posizionare il tubo di 15 ml con le cellule raccolte sul ghiaccio fino a quando tutti lavaggi polmonari sono stati effettuati. </li></ol> 2. Elaborazione di lavaggio polmonare AMɸ Harvest <ol><li> Centrifugare liquido di lavaggio del polmone a 250 x g per 10 min a 4 ° C. </li><li> Usando una tecnica sterile, supernatante decantare in idoneo contenitore per rifiuti all&#39;interno di un armadio biosicurezza. Risospendere il pellet di cellule delicatamente rastrellando il tubo da centrifuga attraverso la parte superiore di un rack provetta. Aggiungere 1 mL di terreno cAMɸ per risospendere le cellule. </li><li> Enumerare le cellule utilizzando un contatore di particelle Coulter Z1 pipettando 20 microlitri di cellule in 10 ml di diluente ISOTON II in flaconcino contatore Coulter. Aggiungere 3 o 4 gocce di Zap-oglobin reagente litico II nel flaconcino, capovolgere delicatamente da 3 a 4 volte e poi caricare il flacone di campione sul bancone per ottenere una concentrazione cellulare. Assicurarsi di programmare il contatore con un fattore di diluizione di 2 x 10 4 per visualizzare ilconcentrazione cellulare come il numero di cellule per ml. </li><li> Diluire le cellule a 2,5 x 10 5 per mL utilizzando mezzo cAMɸ. </li><li> Distribuire 2 mL di 2,5 x 10 5 cellule / ml in ciascun pozzetto di una 6-ben piatto di coltura di tessuti. </li><li> Per arricchire per AMɸ, le piastre di coltura all&#39;interno di incubare a 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 ambiente per 6 h per permettere alle cellule di aderire al fondo del pozzo. Aspirare delicatamente il supernatante di non perturbare cellule aderenti. </li><li> Risciacquare le pozzetti usando PBS sterile (calcio e magnesio libero) per rimuovere le cellule non aderenti e detriti. Aggiungere 2 mL di terreno cAMɸ a ciascun pozzetto. </li><li> Incubare le cellule all&#39;interno notte a 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 ambiente prima dell&#39;aggiunta di stimolanti. Dopo questa fase di arricchimento, circa il 87% delle cellule sono positive per il macrofago CD11b marcatori e F4/80 (figura 2c). </li></ol> 3. Aggiunta di PolyanhydridNanoparticelle e trattamenti elettronici di controllo <ol><li> Fabbricare nanoparticelle tramite polianidride anti-solvente nanoencapsulation 15. In questo processo, il polimero viene sciolto in cloruro di metilene (4 ° C ad una concentrazione di 25 mg / mL) e si precipita in pentano (-20 ° C ad un rapporto 1:200 cloruro di metilene: pentano). </li><li> Pesare con nanoparticelle polianidride sterilizzato pesano carta su un saldo che può misurare con precisione gli importi microgrammi. Aggiungere particelle in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Risospendere le nanoparticelle in ghiacciata cAMɸ. I calcoli sono fatti in modo tale che non più di 0,3 mL di mezzo viene aggiunto a ciascun pozzetto per ottenere la concentrazione desiderata di nanoparticelle. Conservare le particelle risospeso in ghiaccio fino a quando le nanoparticelle sono aggiunti alla coltura bene. </li><li> Prima di aggiungere le nanoparticelle alle culture AMɸ, sonicare particelle utilizzando un sonicatore banco con una micropunta. Sterilizzare microtip a spruzzo con il 70% di etanolo e wiping con un Kimwipe sterile prima della sonicazione. Sottoporre ad ultrasuoni a 10-20 joule per 30 a 45 s mantenendo la provetta in ghiaccio. Osservare macroscopicamente la sospensione di nanoparticelle. Se le particelle non sono sufficientemente disperse, consentono di impostare la sospensione su ghiaccio per 1 a 2 min per garantire che le nanoparticelle sono sotto della temperatura di transizione vetrosa del polimero prima sonicazione nuovamente per 30 a 45 secondi. Lo scopo di questo passo è sonicazione per disperdere adeguatamente le nanoparticelle, come CPTEG 50:50: nanoparticelle CPH tendono ad aggregarsi quando esposto ad un ambiente acquoso. Tuttavia, alcuni piccoli aggregati di nanoparticelle possono rimangono in sospensione. </li><li> Sospensione di nanoparticelle (adeguatamente dispersa) dovrebbero essere tenuti in ghiaccio e possono essere usate immediatamente per prevenire prematura erosione superficiale o di aggregazione. </li><li> Rimuovere le capsule di Petri contenenti il ​​AMɸ da incubatore e il luogo nel quadro di biosicurezza. Piastra Tilt a circa un angolo di 45 gradi e fuori pipetta la quantità di medium che verrà aggiunto alla sospensione nanoparticelle (non dovrebbe superare 0,3 mL). Non disturbare le cellule aderenti durante la rimozione del mezzo. </li><li> Vortex la sospensione di nanoparticelle polianidride brevemente prima di aggiungerlo nei pozzetti appropriati. Pipettare la quantità di sospensione nanoparticelle (non più di 0,3 mL) nel bene specifico (s), tuttavia, non pipettare su e giù per miscelare. Questa azione potrebbe staccare l&#39;aderente AMɸ dal pozzo. Le particelle si depositano sul fondo del pozzo e contattare le cellule. Per gli studi indicati in questo rapporto, la concentrazione finale di nanoparticelle di co-coltura con l&#39;AMɸ era di 125 mg / mL. Procedere con pozzetti successivi e gruppi di trattamento desiderato. Include gruppi di controllo positivi e negativi, come unico mezzo e 200 ng / mL lipopolisaccaride (LPS) per pozzetti. </li><li> Riportare le piastre di coltura ai 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 nell&#39;atmosfera per 48 ore. Studi cinetici nel nostro laboratory hanno dimostrato 48 ore per essere il periodo di coltura ottimale per valutare sia espressione sulla superficie cellulare marcatore e secrezione di citochine in quanto permette di tempo adeguato per la trascrizione e la sintesi proteica a verificarsi. Sebbene maggiori livelli di citochine accumulano durante un prolungato periodo di coltura (cioè, 72 ore), valutando l&#39;espressione sulla superficie cellulare marcatore a questo punto nel tempo può essere confuso con il contributo degli elevati livelli di citochine. Le variazioni di espressione di superficie marcatore osservato non può essere direttamente attribuibile alla stimolazione con le stesse nanoparticelle. </li></ol> 4. La valutazione di attivazione AMɸ in citometria a flusso <ol><li> Preparare fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) tampone (0,1% di sodio azide e 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA)) in 0,1 M di fosfato di soluzione salina tamponata (pH 7,4) prima di raccogliere i macrofagi placcati che sono state co-coltivate con nanoparticelle or stimolanti. </li><li> Preparare soluzioni di lavoro del tampone di bloccaggio e gli anticorpi monoclonali. Per preparare il buffer blocco, diluire IgG di ratto (Sigma) e anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / ml e 10 ug / ml, rispettivamente, in tampone FACS. Diluire marcatore di superficie del pannello di anticorpi in un tampone FACS sia alla concentrazione consigliati dal produttore o la concentrazione utente ottimizzata. Per i risultati presentati in questo lavoro, il pannello marcatore di superficie è costituito da anticorpi contro MHC II, CD86, CD40 e il CIRE (CD209). Anti-topo anticorpi contro i marcatori macrofagi F4/80 e CD11b sono anche inclusi nel pannello di identificare il fenotipo macrofago durante l&#39;analisi dei dati. Si deve prestare attenzione nella scelta di anticorpi contro molecole MHC II, come ceppi di topi inbred spesso differiscono nelle loro aplotipi MHC II. Gli anticorpi selezionati dovranno reagire con le alloantigeni specifici MHC espresse dal ceppo di topi di interesse. </li><li> Dopo 48 h di incubazione con nanoparticelle e / ostimolanti, luogo di coltura di cellule piatti sul ghiaccio per 20 min. Per rimuovere i macrofagi aderenti dalle piastre, raschiare delicatamente pozzetti con un raschietto cella di 24 cm. </li><li> Usando una pipetta da 5 mL sierologica, aspirare delicatamente le cellule ed il mezzo su e giù cinque volte per generare una sospensione di cellule singole. Pipettare i contenuti dei singoli pozzetti in provette di polistirene 5 mL separati in modo da non mescolare le cellule provenienti da diversi trattamenti sperimentali. </li><li> Aggiungere 2 mL di tampone FACS a ciascuna provetta. </li><li> Provette da centrifuga di cellule a 250 x ga 4 ° C per 10 min. </li><li> Decantare il surnatante e Risospendere delicatamente pellet di cellule in liquido residuo da rastrellare i tubi nella parte superiore di un rack provetta. </li><li> Al fine di prevenire il legame non specifico degli anticorpi monoclonali, aggiungere 10 ul di tampone di bloccaggio (preparato in 4,2) a ciascun tubo di cellule. Tubi vortex e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di anticorpi monoclonali diluiti in ogni provetta e incubmangiato al buio in ghiaccio per 15 min. Tubi che contengono i campioni da analizzare deve ricevere la combinazione di anticorpi del pannello policromo (ottimizzazione precedente di combinazione di anticorpi deve essere eseguita da laboratori individuali). Altri gruppi di controllo dovrebbero essere inclusi per impostare correttamente i parametri di acquisizione sul citometro a flusso, compreso un tubo di cellule che non sono stati etichettati, e tubi di compensazione che corrispondono alle cellule marcate usando ogni singolo colore separatamente. Per impostare correttamente le porte per l&#39;analisi di citometria di flusso, la fluorescenza Minus One (FMO) controlli dovrebbero essere inclusi durante l&#39;acquisizione. Controlli FMO sono cellule marcate con tutti gli anticorpi fluorocromo-coniugati che vengono utilizzati sul pannello tranne uno che viene sostituito dal suo rispettivo controllo isotipico. Popolazioni positivi e negativi (ossia, separare le aliquote di cellule trattate con uno stimolante controllo positivo e medium da solo) dovrebbero essere inclusi in FMO provette di controllo e di compensazione. </li><li&gt; 2 mL di tampone FACS a ciascuna provetta vortice, e centrifugare a 250 x ga 4 ° C per 10 min. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in liquido residuo da rastrellare i tubi nella parte superiore di un rack provetta. </li><li> Se il pannello anticorpo è costituito da un anticorpo non coniugato direttamente ad un fluorocromo, ma è invece coniugato a biotina, un fluorocromo streptavidina coniugata è necessario per visualizzare il marcatore di superficie. In questa fase, aggiungere un volume appropriato di diluita fluorocromo streptavidina coniugata e incubare al buio per 15 min in ghiaccio. Come in 4,2, la streptavidina viene diluito ad una concentrazione raccomandata dal produttore o di una ottimizzata da parte dell&#39;utente. Questo passo è necessario solo per pannelli contenenti biotinilati anticorpi primari. </li><li> Eseguire una fase di lavaggio, come descritto in 4.10. </li><li> Diluire un volume adeguato di fissativo 01:03 BD stabilizzare in acqua deionizzata. Aggiungere 100 ml di fissativo diluito in ogni provetta mentre delicatamente vortexing per evitare grumi di cellule. Cellule marcate e può essere stabilmente fissato conservata al buio a 4 ° C per circa una settimana prima di acquisizione su un citometro a flusso. </li></ol> 5. Dati rappresentativi Nanoparticelle fabbricati in fase 3,1 avevano un diametro medio di 163 ± 24 nm e una morfologia coerente con quello ottenuto in studi precedenti 5,16. Nanoparticelle in soluzione prima e dopo sonicazione sono mostrati in Figura 1 per dimostrare la necessità di sonicazione per garantire un&#39;adeguata dispersione delle particelle. L&#39;analisi citofluorimetrica delle AMɸs raccolte ottenuta tramite lavaggio polmonare è mostrato in Figura 2. Etichettare cellule con una combinazione di anti-topo CD11b e anti-topo F4/80 anticorpi così come i controlli corrispondenti FMO permette di stabilire l&#39;etichettatura sfondo, identificando AMɸs e gating per ulteriori analisi. Trattamento dei macrofagi alveolari con polianidridenanoparticelle migliora attivazione come mostrato dalla maggiore intensità di fluorescenza media di MHC II, CD40, CD86, e CIRE (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanoparticelle prima (A) e dopo (B) 30 s di sonicazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi citofluorimetrica delle raccolte macrofagi alveolari contrassegnati con (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e il PE-Cy7 FMO Control, (B) Alexa Fluor 700 FMO controllo e la PE-Cy7 anti-F4/80 e (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e PE-Cy7 anti-F4/80. Il numero nell&#39;angolo in alto a destra rappresenta la percentuale di cellule positive doppio. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Figura 3. Istogrammi dimostrando un aumento della fluorescenza intensitàsità per l&#39;espressione superficie di MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) e CIRE (D) dopo co-coltura di macrofagi alveolari con 50:50 CPTEG: polianidride CPH nanoparticelle per 48 ore. Gli istogrammi rappresentano risultati per AMɸ etichettati come controlli (FMO <img alt="Grafico Linea 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Non trattata AMɸ marcato con anticorpi contro marcatori di superficie tutti i cellulari ( <img alt="Grafico Linea 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) E AMɸ coltivate con nanoparticelle ed etichettati con anticorpi contro marcatori di superficie tutti i cellulari ( <img alt="Grafico Linea 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Polianidride piattaforme vaccino nanoparticelle hanno dimostrato l&#39;efficacia se somministrato per via intranasale in regimi monodose 5. Misurazione l&#39;attivazione delle cellule fagocitiche popolazioni residenti nei polmoni indotti dalla piattaforma di mandata vaccino consente di valutare la potenziale capacità di promuovere in definitiva risposte immunitarie adattative. In particolare, la raccolta macrofagi alveolari del polmone dal liquido di lavaggio e trattarli con dive...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> CAM media </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM 2-mercaptoetanolo </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina 10.000 mg / ml di soluzione </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumina di siero bovino) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio Azide </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms MHC II aplotipo IA / IE, clone M5/114.15.2, coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) </td><td> EBIOScience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse CD86, clone GL-1, coniugata con alloficocianina (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse CD40, clone 1C10, coniugato con APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo CD209, clone 5H10 coniugati con biotina </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse CD11b, clone M1/70, coniugato con Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse F4/80, clone BM8, coniugato con ficoeritrina (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Texas red coniugato streptavidina </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Materiali di consumo e reagenti </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Utilizzato come 70% (v / v) </td></tr><tr><td> CO 2 compressa </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 1 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Sovereign 3 ½ &quot;Fr Catcatheter Tom </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Biosicurezza Cabinet </td><td> NUAIRE </td><td> Series 22 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione Forbici </td><td> Pescatore </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 1X senza calcio e magnesio </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 Tubi centrifuga ml con tappo a vite </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Sei ben Cultura tessuto trattato Piatti </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Racks tubi in plastica </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Cella Scraper 24 centimetri </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mL polistirene Round-Provetta a fondo </td><td> Falco </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettare-aid XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, e 2 ml Pipettes </td><td> Pescatore </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 e 10 microlitri Micropipettatrici </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 e 10 puntali pl </td><td> Pescatore </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD di stabilizzazioneFissativo </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> ISOTON II Diluente </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II reagente litico </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Fiale polistirene Coulter Counter </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Provette </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Attrezzatura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga refrigerata </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore umidificato CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Modello Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto Citofluorimetro </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Contatore di particelle Coulter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Sonicator Processing Equipment liquido con micropunta </td><td> Misonix </td><td> Modello No. S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

Nanoparticelle biodegradabili sono emersi come una piattaforma versatile per la progettazione e realizzazione di nuovi vaccini intranasali contro le malattie infettive respiratorie. In particolare, polianidride nanoparticelle composto di acido alifatico sebacico (SA), il aromatico 1,6-bis (p-carbossifenossi) esano (CPH), o il anfifilo 1,8-bis (p-carbossifenossi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) visualizzare massa unica e cinetica di erosione superficiale e 1,2 può essere sfruttata per rilasciare lentamente biomolecole funzionali (ad esempio, antigeni proteici, immunoglobuline, ecc) in vivo 3,4,5. Queste nanoparticelle possiedono anche attività adiuvante intrinseca, che li rende una scelta eccellente per una piattaforma di distribuzione vaccino 6,7,8. Al fine di chiarire i meccanismi che regolano l&#39;attivazione dell&#39;immunità innata a seguito di vaccinazione della mucosa nasale, bisogna valutare le risposte molecolari e cellulari della p antigenecellule risentirsi (APC) responsabili per l&#39;avvio di risposte immunitarie. Le cellule dendritiche sono le principali APC si trovano nella conduzione delle vie aeree, mentre i macrofagi alveolari (AMɸ) predominano nel parenchima polmonare 9,10,11. AMɸ sono altamente efficienti in compensazione nei polmoni di agenti patogeni microbici e detriti cellulari 12,13. Inoltre, questo tipo di cellule gioca un ruolo importante nel trasporto di antigeni microbici ai linfonodi drenanti, che è un primo passo importante nella apertura di una risposta immunitaria adattativa 9. AMɸ esprimono anche livelli elevati di pattern recognition innata e recettori scavenger, secernono mediatori pro-infiammatori, e prime cellule T naive 12,14. Una popolazione relativamente pura di AMɸ (ad esempio, superiore al 80%) può essere facilmente ottenuta mediante lavaggio polmonare per studi in laboratorio. Resident AMɸ raccolte da animali immuni competenti forniscano un fenotipo rappresentante dei macrofagi che encounter la particella vaccino basato in vivo. Qui, descriviamo i protocolli utilizzati per la raccolta e la cultura AMɸ da topi ed esaminare il fenotipo attivazione dei macrofagi in seguito al trattamento con le nanoparticelle polianidride in vitro.

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Qui, descriviamo i protocolli per la raccolta murini macrofagi alveolari, che risiedono le cellule immunitarie innate nei polmoni, e di esaminare la loro attivazione in risposta a co-coltura con nanoparticelle polianidride.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.7K Views.  Iowa State University. Qui, descriviamo i protocolli per la raccolta murini macrofagi alveolari, che risiedono le cellule immunitarie innate nei polmoni, e di esaminare la loro attivazione in risposta a co-coltura con nanoparticelle polianidride.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Ricerca

Bioingegneria

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

High-throughput sintesi dei carboidrati e funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

PLGA nanoparticelle formate da singola o doppia emulsione con Vitamina E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea (ureolysis) in naturally occurring environments through secretion of an enzyme urease. This process of ureolysis, through a chain of chemical reactions, leads to the formation of calcium carbonate precipitates. This is known as Microbiologically Induced Calcite Precipitation (MICP). The proper culture protocols for MICP are detailed here. Finally, visualization experiments under different modes of microscopy were performed to understand various aspects of the precipitation process. Techniques like optical microscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Photo-electron Spectroscopy (XPS)&#160;were employed to chemically characterize the end-product. Further, the ability of these precipitates to clog pores inside a natural porous medium was demonstrated through a qualitative experiment where sponge bars were used to mimic a pore-network with a range of length scales. A sponge bar dipped in the culture medium containing the bacterial cells hardens due to the clogging of its pores resulting from the continuous process of chemical precipitation. This hardened sponge bar exhibits superior strength when compared to a control sponge bar which becomes compressed and squeezed under the action of an applied external load, while the hardened bar is able to support the same weight with little deformation.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Microbiologicamente indotta Calcite Precipitazioni Mediata da<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produzione di nanoparticelle metalliche mediante ablazione laser pulsata nei liquidi: uno strumento per studiare le proprietà antibatteriche delle nanoparticelle

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...