Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCR sovvenzione 1R01DE019796.

Le presentati leo-flussi di lavoro consentono una etichettatura degli isotopi stabili di proteine ​​e peptidi sintetici digerisce. Questi esperimenti tempo (Figura 1) sono applicabili a comparativi e quantitativi studi di proteomica e la ricerca della proteasi. Ogni flusso di lavoro è costituito da due fasi sperimentali (Figura 2): A) Il tempo di campionamento risolta del rispettivo 18 O-isotopi stabili con codifica reazione (proteasi-catalizzata clivaggio peptide; proteasi-catalizzata carbossilico reazione di scambio di ossigeno, acido-catalizzata scambio di ossigeno carbossilico reazione) e B) analisi mediante spettrometria di massa e la rappresentazione grafica di 18-O incorporazione cinetica. A. TimeCourse Esperimenti I. Paleo-TimeCourse: Proteasi-catalizzata etichettatura dei cleavages proteolitici <ol><li> (Opzionale) legami disolfuro di proteine ​​(10 mM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale 2.5 mM)in 25 mM NH 4 HCO 3 (sia preparata) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C. </li><li> (Facoltativo) cisteine ​​libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> A seconda della proteasi di interesse, di proteine ​​/ peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare PepClean colonne C-18 di spin (Thermo) per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori (Sartorius) per scambiare i buffer per campioni di proteine. </li><li> Ridisciogliere / peptidi / proteine ​​di cambio in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell&#39;aggiunta della proteasi: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamicoacido matrice (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Caricare il campione su un Opti-TOF 384 piastra segnale MALDI (AB SCIEX) e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 minuti). </li><li> Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con la proteasi di interesse (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura raccomandata per il particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come campione di controllo. La prima aliquota rappresenta un campione standard di proteasi-catalizzata 18 O-etichettatura e può essere utilizzato per l&#39;identificazione di peptidi e proteine, rilevamento di attività proteolitiche e monitoraggio delle reazioni di scissione proteolitica. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è indotta dalla proteasi, quindi, né etichettatura né scissione è prevista per questo esempio. </li><li> Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come described sotto passaggio 5 a intervalli di tempo, come sembra in forma. Le condizioni di reazione descritte sopra sono usati per controllare una reazione proteolitica fino a quattro giorni (circa 24 punti). Avviare il campionamento ogni 5 min fino al 30 min, quindi individuare ogni 30 minuti fino a 2 ore, poi ogni ora fino a 8 ore e ogni 8 ore fino a 4 giorni. Prodotti di scissione dovrebbe apparire entro i primi 12 ore e il supporto deve essere completamente idrolizzato dopo 24 ore. Estesa tempi di incubazione di reazione permettono di definire i prodotti di reazione stabili che sono discreti da intermedi di reazione, che vengono ulteriormente elaborati. Seconda domanda di ricerca e di proposta enzima-substrato coppie, i tempi di individuazione e temperatura di incubazione devono essere modulata per assicurare campionamento ottimale reazione. </li><li> Dopo l&#39;ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistamento, la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B). </li></ol> II. Paleo-TimeCourse: Postdigetichettatura estion di Termini proteolitici <ol><li> (Facoltativo) legami disolfuro di proteine ​​(10 pM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale di 2,5 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 (entrambi preparati) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C. </li><li> (Facoltativo) cisteine ​​libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> A seconda della proteasi di interesse, di proteine ​​/ peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare le colonne PepClean C-18 di spin per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori per lo scambio delle proteine ​​buffer. </li><li> Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici / proteine ​​in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi tripsina (es: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) e digerire con proteasi di interesse al completamento (es. tripsina: 0,04 nM; 37 ° C, 12 ore). </li><li> Scissione Cleanup con colonne PepClean C-18 di spin. Questo passo sarà eliminare le attività residue della proteasi. </li><li> Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 O. 18 </li><li> Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell&#39;aggiunta di enzima: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Spot campione su una piastra MALDI e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 min). </li><li> Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con proteasi di interesse (ad esempio tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura consigliata per la particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come controllo. Il primoUn&#39;aliquota rappresenta un campione standard per proteasi-catalizzata 18 O-postdigestion etichettatura e può essere utilizzato per la quantificazione delle proteine ​​e peptidi. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è catalizzata dalla proteasi, pertanto, alcuna etichettatura è prevista per questo esempio. </li><li> Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come descritto al punto 7.) Ad intervalli di tempo, come sembra in forma. Per esempio, abbiamo scoperto inizialmente ogni 5 minuti fino a 30 minuti e ogni 15 minuti dopo che per monitorare il carbossile reazione di scambio di ossigeno catalizzata da tripsina. </li><li> Dopo l&#39;ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistare la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B). </li></ol> III. Aleo-TimeCourse: acido-catalizzata etichettatura dei gruppi carbossilici <ol><li> Incubare singoli peptidi (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-acqua arricchita in tegli presenza o assenza (controllo) del 0,1% (v / v) finale di acido trifluoroacetico (volume totale 30 microlitri). </li><li> I prodotti di reazione del campione al giorno per 48 giorni per co-spotting una aliquota 0,5 microlitri della miscela con 0.5μl di alfa ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% TFA) direttamente su un bersaglio MALDI piastra. </li><li> Tra gli intervalli di spotting e dopo aver individuato il punto finale tempo di reazione presenta una piastra segnale per MALDI-TOF/TOF MALDI MS / MS, come descritto di seguito nella sezione B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS di acquisizione dati e analisi <ol><li> Gli spettri di massa sono invece acquistati su MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Prima dell&#39;analisi, lo strumento è tarato con una miscela di standard peptide (Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti), con una tolleranza massima di errore di massa di misura di ± 50 ppm e un numero minimo di sei picchi da abbinare. </li><li> MS (range di massa400 - 4.000 m / z) sono acquisiti in triplice copia utilizzando la modalità di ioni positivi con una intensità del laser regolabile (3.400 - 3.800; passo di 50) con un accettabile campo di intensità base del picco di 2.000 - 45.000. Scatti singoli vengano acquistate per sub-spettri, con 400 colpi totali / spettro, stop condizioni entreranno in vigore dopo 800 sub-spettri vengono acquisiti (positivo o negativo) o 400 sub-spettri criteri di accettazione passaggio. In caso di bassa abbondanti campioni o in presenza di complessi ambienti biologici l&#39;estremità inferiore del campo di rilevamento MS dovrebbe essere portato a 800 m / z. Inoltre, può essere necessario rimuovere sale e altri composti che interferiscono con un passo di pulitura campione come descritto in precedenza, o mediante separazione LC. </li><li> MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla serie 4000 di acquisizione dati e software Explorer importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, che utilizza il software Distiller MASCOT (Matrix Science) per l&#39;elaborazione spettrale e il rilevamento di picco. Buste isotopichesono deconvoluto e 18 O-incorporazione coefficienti determinati automaticamente utilizzando un algoritmo simile a quello descritto da Mason et al. 12 e adattato dal nostro gruppo 9. Alternativamente, strumenti software come ZoomQuant Viper 13 e 14, nonché pacchetti software commerciali quali come Bioworks Xpress (Thermo Fisher Scientific) e Mascot Distiller quantificazione Toolbox (Matrix Science) può deconvolute 18 O-tipo di dati 15,16. 18 O-incorporazione rapporti sono espressi come i contributi relativi delle singole specie isotopi peptide (cioè, peptidi contenenti almeno il 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) per la busta isotopica. </li><li> Per ogni esperimento TimeCourse, le masse molecolari ([M + H] +) per tutte le specie peptidiche rilevati vengono estratti dai file di dati associati MS ed i valori categorizzata in una larghezza 100 ppm di massa. </li><li> Lat almeno tre [M + H] + sono impostati per essere tenuti a compilare un bidone. Nel caso di supporti noti, l&#39;elenco bin filtrato viene confrontato con l&#39;elenco dei prodotti di scissione proteolitica previsto dalla sequenza di peptide substrato utilizzando lo strumento ExPASy FindPept 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) e 200 ppm di massa tolleranza di errore di accettazione. </li><li> MS / MS sono acquisiti per tutti i valori di massa dei prodotti di scissione previsti dallo strumento FindPept e per valori bin che hanno 18 O-incorporazioni essi associati. MS / MS dati sono stati acquisiti in MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer in modalità riflettore 1 kV ione positivo, con una intensità del laser fissa di 4200 e CID-gas in modalità off. 50 scatti vengono acquisiti in un modello randomizzato per ogni sub-spettri fino a un totale di 40 sotto-spettri per spot (producendo un totale di 2.000 scatti / spot). </li><li> MS / MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla Serie 4000 Explorer software di acquisizione dati e importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, i picchi vengono rilevati e MS / MS liste di punta sono associati con i corrispondenti dati raggruppate MS. </li><li> Per l&#39;identificazione peptide, MS / MS liste di picco sono confrontati con il database SwissProt utilizzando il motore di ricerca MASCOT con i seguenti parametri di ricerca: nessuna specificità dell&#39;enzima, 150 ppm di ione precursore e 0,2 Da frammento tolleranze di massa di ioni. </li><li> Identificazioni peptidi possono inoltre essere convalidati utilizzando il software Data Explorer (AB SCIEX) confermando le caratteristiche 18 O-incorporazione modelli in tutto y serie frammenti ionici come descritto da Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Preparazione del Tempo spettrale e 18 O-incorporazione Personaggi Grafici spettrali tempo: MS file di dati (. T2D file) per ogni punto il tempo di reazione vengono esportati dal software Data Explorer come ASCII-file utilizzando unmacro e importato in un programma di analisi dei dati e software di grafica (ad esempio origine OriginLab) e visualizzati come grafici a cascata (Figura 3). 18 O-incorporazione piazzole: Per ogni prodotto peptide cestinate scissione, dei contributi delle singole specie isotopi peptide (16 O 18 O 18 O 1 o 2) vengono estratti attraverso punti di tutti i tempi di reazione e funzione del tempo (Figura 4).

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J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Combinando etichettatura isotopo stabile e ad alta risoluzione spettrometria di massa in un tempo risolto modo, il paleo-TimeCourse metodo permette una analisi dinamica della generazione di prodotti peptidici. Il saggio può essere utilizzato per generare peptidi marcati con isotopi stabili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica e di valutare la cinetica con cui vengono generati peptidi proteotypic. Inoltre, Paleo-TimeCourse è progettato per valutare percorsi proteolitici sotto specifica, fisiologicamente r...

<table border="1"><tbody><tr><td> Denominazione del prodotto </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Colonne PepClean C-18 Spin </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI obiettivo piastra </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Materiali <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Alfa ciano-4-idrossicinnamico acido </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> L&#39;endotelina-1 enzima di conversione (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsina Oro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Acqua-18 O, 97% atomo 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Isotopi stabili sono strumenti essenziali in spettrometria di massa biologica. Storicamente, 18 O-isotopi stabili sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi catalitici di enzimi proteolitici 1-3. Con l&#39;avvento di spettrometria di massa a base di proteomica, la enzimaticamente catalizzata incorporazione di 18 atomi di O-da stabile l&#39;acqua arricchita con isotopi è diventato un metodo popolare per confrontare quantitativamente i livelli di espressione di proteine ​​(recensione da Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-etichettatura costituisce un&#39;alternativa semplice ea basso costo per chimica (ad esempio iTRAQ, ICAT) e metaboliche (es. SILAC) tecniche di etichettatura 7. A seconda della proteasi utilizzato, 18 O-etichettatura può provocare l&#39;incorporazione di fino a due atomi di O-18 nel C-terminale gruppo carbossilico del prodotto di scissione 3 </sup&gt;. La reazione di marcatura può essere suddiviso in due processi indipendenti, la scissione del legame peptidico e il carbossile reazione di scambio di ossigeno 8. Nel nostro Paleo (p rotease-a ssisted e Abeling l mploying 18 O arricchita di acqua) l&#39;adeguamento delle enzimatica 18 O-etichettatura, abbiamo utilizzato il 50% 18 O arricchita di acqua per ottenere le firme isotopiche distintive. In combinazione con alta risoluzione matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo spettrometria di massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), le buste isotopici caratteristici possono essere utilizzati per identificare prodotti di taglio con un elevato grado di specificità. Abbiamo in precedenza hanno usato il Paleo-metodologia per individuare e caratterizzare proteasi endogene 9 e monitorare le reazioni proteolitici 10-11. Poiché Paleo codifica l&#39;essenza stessa della reazione taglio proteolitico, la configurazione sperimentale è enri semplice e biochimichepassi chment di prodotti di dissociazione può essere aggirato. Il Paleo-metodo può essere facilmente esteso per esperimenti di tempo (i) del corso che controllano la dinamica delle reazioni taglio proteolitico e (ii) l&#39;analisi della proteolisi in campioni biologici complessi che rappresentano le condizioni fisiologiche. Paleo-TimeCourse esperimenti di aiuto per identificare il tasso di limitazione fasi di lavorazione e prodotti intermedi di reazione in complesse reazioni pathway proteolitici. Inoltre, il paleo-reazione ci permette di identificare enzimi proteolitici come la tripsina serina proteasi che è in grado di associare nuovamente i suoi prodotti di scissione e catalizzare l&#39;incorporazione di un secondo 18 O-atomo. Tali &quot;doppio&quot; etichettatura enzimi possono essere usati per postdigestion 18 O-etichettatura, in cui i peptidi sono etichettati esclusivamente dalla reazione carbossile scambio di ossigeno. La terza strategia si estende l&#39;etichettatura impiegando 18 O arricchita di acqua al di là degli enzimi e utilizza condizioni di pH acido per introdurre 18 O-stabile segno isotopoture in peptidi.

Abbiamo usato il Paleo-TimeCourse flusso di lavoro per monitorare in modo dinamico l&#39;incorporazione di 18 O-isotopi stabili in prodotti di dissociazione peptidici generati dagli enzimi proteolitici. L&#39;approccio presentato è uno strumento versatile per studiare comparativamente percorsi di elaborazione proteolitici per substrati diversi e combinazioni di proteasi. Campionando reazioni proteolitici ripetutamente nel corso della reazione, il paleo-TimeCourse esperimento fornisce istantanee risolta nel t...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Isotopi stabili flussi di lavoro in materia di etichettatura che impiegano<sup&gt; 18</sup&gt; O-acqua arricchita (Leo-flussi di lavoro) sono strumenti versatili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica. In flussi di lavoro proteasi assistite (Paleo),<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomi sono introdotti da scissione proteolitica e carbossilici reazioni di scambio dell&#39;ossigeno mediata da proteasi. Nel acido-catalizzata (Aleo) del flusso di lavoro,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomi sono introdotti da scambio di ossigeno carbossile a pH basso.

Flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi Impiegando<sup&gt; 18</sup&gt; O arricchita di acqua

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

11.9K Views.  Boston Biomedical Research Institute. Isotopi stabili flussi di lavoro in materia di etichettatura che impiegano 18 O-acqua arricchita (Leo-flussi di lavoro) sono strumenti versatili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica. In flussi di lavoro proteasi assistite (Paleo), 18 O-atomi sono introdotti da scissione proteolitica e carbossilici reazioni di scambio dell'ossigeno mediata da proteasi. Nel acido-catalizzata (Aleo) del flusso di lavoro, 18...

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Morris Water Maze Esperimento

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases, which is what we do during our quality control procedures. In this assay, casein acts as a substrate. When the protease we are testing digests casein, the amino acid tyrosine is liberated along with other amino acids and peptide fragments. Folin and Ciocalteus Phenol, or Folin's reagent primarily reacts with free tyrosine to produce a blue colored chromophore, which is quantifiable and measured as an absorbance value on the spectrophotometer. The more tyrosine that is released from casein, the more the chromophores are generated and the stronger the activity of the protease. Absorbance values generated by the activity of the protease are compared to a standard curve, which is generated by reacting known quantities of tyrosine with the F-C reagent to correlate changes in absorbance with the amount of tyrosine in micromoles. From the standard curve the activity of protease samples can be determined in terms of Units, which is the amount in micromoles of tyrosine equivalents released from casein per minute.
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Sigma&#039;s Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases.

Sigma non specifiche attività di analisi della proteasi - caseina come substrato

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Etichette fluorescenti di Drosophila Cuore Strutture

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

GC-based Detection di acetato derivatizzata Glucosamina e muramico Acid Aldononitrile per la determinazione dei residui microbica nel terreno

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Flussi di lavoro GST, analisi dei risultati e gestione dei dati con un approccio di visione artificiale

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Autore in primo piano: Un approccio basato sulla visione artificiale ai flussi di lavoro della microscopia elettronica a trasmissione, all'analisi dei risultati e alla gestione dei dati  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.