Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (sia per RGM).

A. Materiali necessari: vedere la tabella 1 (reagenti) prima della preparazione <ol><li> HBSS (P / S): 100 HBSS 10X ml + 900 ml di H 2 0 + 1% di penicillina / streptomicina (conservato in frigorifero o tenuta in ghiaccio). </li><li> 20% magazzino BSA è fatto in acqua e aliquotati e conservati a -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml HBSS 1X (P / S) + 3 ml di 20% BSA (concentrazioni finali BSA 0,3%) </li><li> Islet media: RPMI + 10% FBS + glutammina 1% + 1% penicillina / streptomicina </li><li> Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque </li><li> Sutura 4-0 (McKesson): tagliato in 2 pezzi ¾ pollici e conservati in una capsula di Petri cm 10 </li><li> Strumenti: Piegare la pinza da Strumenti Scienza Belle a 90 °, e limare i denti seghettati di tutte e tre le coppie di pinze. L&#39;obiettivo è quello di attutire i denti, non per rimuoverli. </li><li> Cannula per la somministrazione di collagenasi / proteasi miscela: 27G ½ pollici aghi, 30 ½ polliciago, PE50 tubi tagliati a 12 in pezzi. File entrambi gli aghi fino ad una estremità arrotondata liscia che non presenta spigoli vivi. Inserire l&#39;ago 27G in una estremità di un 12 pollici pezzo di tubo PE50. Rimuovere l&#39;ago 30G dal corpo rompendo l&#39;involucro con un paio di pinze, ruotando il corpo di ¼ di giro ogni volta. Rimuovere l&#39;ago con le pinze dall&#39;involucro e inserirlo nella estremità del tubo PE50 sotto un microscopio di dissezione. Assicurarsi di non piegare il tubo quando si inserisce l&#39;ago nel tubo PE50. L&#39;ago 27G è la fine che si allega la siringa di collagenasi. </li><li> Collagenasi (CI zyme MA) e Neutral proteasi (enzima CI BP). Ricostituire il TDE le istruzioni del produttore. Fare riferimento al Certificato lotto specifico di analisi per calcolare la concentrazione dell&#39;enzima attività. Trasferimento per un totale di 350.000 degradanti attività collagene (CDA) unità della collagenasi ricostituito e 100.000 unità di proteasi neutre del reconstitbuite Protease BP in una provetta conica e si diluisce a 15 ml in totale HBSS (P / S) </li></ol> B. Step-by-Step protocollo 1. L&#39;inflazione di pancreas con collagenasi / Proteasi Miscela <ol><li> Eutanasia del mouse per dislocazione cervicale, saturare il busto del mouse con il 70% EtOH, aperta cavità addominale completamente da ano a membrana con le forbici di dissezione e pinze. </li><li> Posizionare il mouse sulla piattaforma di un microscopio di dissezione. </li><li> Tirare il cieco e del colon ascendente fuori e metterli al di fuori della cavità del corpo alla vostra sinistra. Vedere la Figura 1 per una sintesi dei seguenti passaggi. </li><li> Posizionare i lobi del fegato contro il diaframma, che devono rimanere lì se la cavità corporea è aperto abbastanza lontano. Trova l&#39;arteria epatica, la vena porta ed il dotto biliare fagotto che porta nel fegato afferrando il duodeno con pinze curve. Con un&#39;altra coppia di pinze curve, mani sotto la vena arteria, e condotto bundle e tirare un 2 ¾ in pezzo di filo di sutura 4-0 sotto, arteria vena, dotto biliare e legare una volta e tirare il più vicino al fegato il più possibile. </li><li> Utilizzando due coppie di pinze curve, accuratamente afferrare il duodeno e trovare il dotto biliare attaccato al duodeno al papilla. Utilizzare una pinza della pinza per colpire attraverso il pancreas e proprio tessuto connettivo sotto la chiusura dotto biliare alla papilla. Ficcare il forcipe rapidamente attraverso l&#39;organo di fare un buco e poi mettere entrambe le pinze di pinza attraverso e prendere un altro 2 ¾ pollici pezzo di filo di sutura 4-0 e legarlo con una volta e tirarlo in un piccolo cerchio, ma non tirare. </li><li> Passare alla 90 ° pinze e le forbici Superfine Vännäs. Con i 90 ° pinza, pizzicare e tirare con cura l&#39;intestino tenue fino a quando il dotto biliare è teso. Fai un taglio orizzontale attraverso la papilla con le forbici a coltellate le forbici aperte nell&#39;intestino e poi il taglio con un unico movimento. Provate a fare solo one attraversano la papilla senza staccare il dotto biliare dalla papilla. </li><li> Tenendo ancora l&#39;intestino con le pinze 90 °, inserire la cannula nel dotto biliare fino a metà della lunghezza del dotto biliare, e quindi estrarre delicatamente la sutura stretto intorno alla cannula. </li><li> Riempire una siringa da 3 ml con 2,0 ml di collagenasi / proteasi o della miscela e iniettare nella cannula ad un passo lento e costante. </li><li> Dopo l&#39;inflazione del pancreas, rimuovere cannula dal dotto biliare e utilizzare le pinze curve e forbici a molla curve per rimuovere il pancreas gonfio iniziando dal colon discendente e snipping il tessuto connettivo, come si tira su l&#39;intestino. Continuare a rimuovere il pancreas dall&#39;intestino fino a raggiungere il dotto biliare, quindi rimuovere il pancreas dalla milza, poi lo stomaco e poi dai visceri della cavità addominale. Completare la rimozione tagliandoli via i punti di sutura. Aggiungere il pancreas a una provetta da 50 ml contenente 5 ml di HBSS(P / S). Questo tubo deve essere su ghiaccio. </li><li> Ripetere la procedura per ogni animale fino a quattro animali. Per ottenere risultati ottimali, si dissociano solo quattro pancreas contemporaneamente. In genere, mentre i primi quattro sono in 37 ° C bagno d&#39;acqua, si gonfia un altro pancreas quattro. </li></ol> 2. Pancreas dissociazione <ol><li> Posizionare le provette da 50 ml contenenti il ​​pancreas in un bagno di acqua 37 ° C per 15 min. </li><li> Agitare delicatamente il tubo e verificare la dissociazione dei tessuti, assicurati tessuto si smonta facilmente, quindi agitare il tubi di 12 volte mentre si sta tenendo il tubo con il coperchio. </li><li> Aggiungere non più di 30 ml di HBSS (BSA) (questo può essere una quantità inferiore, a seconda di quanto è necessario per bilanciare i tubi per la fase di centrifugazione), e centrifugare a 290 xg per un min. </li><li> Aspirare il surnatante con cura e lasciare una piccola quantità di surnatante (2-3 ml) in basso in modo da non disturbare il pellet. </li><li> Usando una siringa da 30 ml attached a 14G ago, aggiungere non più di 10 ml di HBSS (BSA) e aspirare la sospensione su e giù per 2 volte. </li><li> Filtrare la miscela cellulare attraverso un colino di plastica in una provetta da 50 ml e lavare con altri 10 millilitri HBSS (BSA). </li><li> Centrifugare a 330 xg per 2 minuti. </li><li> Sopranatante e invertire tubi di scarico su un tovagliolo di carta assorbente per 1 min. </li><li> Risospendere ogni provetta in 10 ml di freddo 1100 HISTOPAQUE. </li><li> Sovrapporre il HISTOPAQUE con 10 ml di HBSS (BSA) e centrifugare a 900 xg per 18 min. </li><li> Rimuovere l&#39;intero 20 ml di surnatante con un ampio passaggio pipetta 25 ml e passare il surnatante attraverso un filtro invertiti 70 pm. </li><li> Sciacquare le isole in una piastra da 10 cm Petri pipettando 10 media delle isole ml attraverso il filtro tenendolo a destra verso l&#39;alto sopra il piatto. </li><li> Cultura gli isolotti a 37 ° C, 5% di CO 2 coltura tissutale incubatore fino al momento per la sperimentazione. In genere, le isole sono raccolte a mano e contate prima di compeimentation. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Rendimenti Islet, morfologia, e la qualità sono i parametri generali utilizzati per valutare il successo di isolamento delle isole. Nelle nostre mani, rese isolotto dalla media C57BL / 6 topo sono nella gamma di 150-250 isolotti usando questo protocollo (vedere Tabella 2), e sono paragonabili ai dati ottenuti usando ottimizzato Sigma collagenasi tipo XI. Tuttavia, le rese possono variare a seconda del ceppo di topo utilizzato e l&#39;età del mouse. La maggior parte degli animali che utilizziamo sono nella fascia di età 8-16 settimane Questo protocollo è stato testato su diversi ceppi di topi, compresi C57BL / 6 (180-250 isole / topo), CD1 (200-300 isole / topo), 129 / B6 (200-300 isole / mouse), BLKS-db/db (120-200 isole / mouse), NOD (10 settimane di età, 100-150 isole / mouse), e NOD-SCID (100-150 isole / topo ). Isolotto morfologia tipica è mostrata in figura 2, in cui isole hanno un ciclo di forma allungata, con dimensioni relativamente uniforme (anche se le dimensioni uniformity può variare da ceppo a ceppo). La figura 3 mostra la nostra analisi tipica di glucosio-stimolata la secrezione di insulina da C57BL / 6 isole di topo isolate utilizzando TDES purificati vs Sigma collagenasi tipo XI. Tipicamente, una elevata qualità dei risultati delle isole preparazione in una stimolazione di insulina a 25 mM di glucosio che è 6-20 volte maggiore di quello osservato con 2,5 mM di glucosio. Altre applicazioni possono anche essere utilizzati per verificare la qualità di isole isolate, e questi includono l&#39;uso di tecniche perifusion, Ca 2 + imaging (con Fura2), e trascrizione inversa PCR, tra gli altri 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Una sintesi della cannulazione del dotto biliare. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Aspetto tipico delle isole C57BL / 6 a 24 ore di isolamento seguente. Immagini sono state acquisite su un amicroscopio convertito con ingrandimento 40X. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Glucosio secrezione di insulina stimolata di C57BL / 6 isole. At 24 hr isolamento seguente, 100 isolotti sono stati incubati in un piatto da 12 pozzetti per 1 ora a 37 ° C in Krebs-Ringer Hepes tamponata soluzione contenente 2,5 mM di glucosio. Isolette sono state poi trasferite Krebs-Ringer Hepes a 2,5 mM di glucosio per una ulteriore ora, dopo che è stato raccolto il surnatante per la misura insulina utilizzando due immunospecifico sito enzimatico immunoenzimatico (ELISA) (Crystal Chem). Gli isolotti stessi sono stati successivamente trasferiti Krebs-Ringer Hepes-soluzione tamponata contenente 25 mM di glucosio, e il rilascio di insulina nel mezzo è stata misurata mediante ELISA dopo 1 ora di incubazione.

<ol>
	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDS, SAT, e RGM non hanno nulla da rivelare. AGB Autore è un dipendente VitaCyte. Autore RCM ha un interesse di proprietà in VitaCyte.

In questo protocollo, abbiamo descritto la nostra procedura per l&#39;incannulazione, perfusione con collagenasi, e la dissociazione del pancreas murino, con lo scopo di isolare le isole di Langerhans. Tecnicamente, il nostro metodo, una volta appreso, dovrebbe consentire l&#39;isolamento del pancreas entro 4 min eutanasia degli animali, e per 1 ora dovrebbe comportare l&#39;isolamento di isole da un singolo animale. La rapidità della tecnica ci permette di isolare isolotti da fino a 12 topi a un tratto tipico, ottenendo in tal modo l&#39;isolamento di fino a 3.000 isolotti. A differenza di altri protocolli che utilizzano preparazioni grezze di collagenasi, il nostro protocollo è caratterizzata dall&#39;uso di proteasi purificata, CI zyme Collagenasi MA CI enzima proteasi e BP. Variazioni nella consistenza dei preparati TDE che sono commercialmente disponibili richiede che ciascun lotto singolarmente testato e ottimizzato prima uso generale. Questo lotto a lotto variabilità ci ha portato a prendere in considerazione l&#39;uso di PuriTDES cati da VitaCyte. Questi TDES altamente purificate sono caratterizzati da più metodi tra cui l&#39;uso di sensibili saggi fluorescenza substrato marcato. Il saggio di fluorescenza CDA è più sensibile alle diverse forme molecolari di collagenasi che hanno differenti cinetiche in degradante collagene nativo. Saggi storici substrato peptidico fornire una valutazione incompleta di collagenasi. Caratterizzare collagenasi con metodi diversi assicura una maggiore attività enzimatica tra i lotti. Sulla base della nostra in-house test utilizzando una varietà di preparazioni collagenasi disponibili in commercio, abbiamo trovato che le combinazioni di enzimi purificati prodotto riproducibili da lotto a lotto risultati. I vantaggi principali di usando TDES altamente purificata e rigorosamente caratterizzato in questa applicazione sono una composizione enzimatica ottimale è definito, il lotto a lotto costanza delle prestazioni è assicurato. Tale coerenza elimina il laborioso processo di qualificazione partita normalmente richiestocollagenasi per prodotti grezzi o arricchito. TDES purificati anche consentire ulteriori modifiche della composizione per migliorare la resa e la qualità di isolotti recuperati da differenti ceppi di topi. Notifica composizioni enzimatiche ottimali per l&#39;isolamento di isolotti da diversi ceppi di topi possono essere più efficacemente comunicata. Questo, a sua volta, porta ad un uso più produttivo delle risorse e maggiore flessibilità nel disegno sperimentale. Ci sono molti passaggi critici che possono influenzare il risultato di isolamenti delle isole con il nostro protocollo. La prima è la necessità di ottenere un gonfiaggio efficace del pancreas durante la perfusione del preparato enzimatico. È importante iniziare il gonfiaggio con forza dolce sulla siringa, e aumentare la forza come si gonfia pancreas. E &#39;utile per spostare l&#39;intestino e sollevare il pancreas durante il gonfiaggio in modo che la collagenasi perfusione l&#39;intero organo. Un altro passo importante è la forza con cui si scuote il afte tubir incubazione a 37 ° C (fase 2.2). Abbiamo trovato che scuotendo il pancreas duro contro il tappo della provetta provoca frammentazione di isolotti, ma senza alcuna forma di dissociazione meccanica in questa fase, i rendimenti insule può cadere drammaticamente. È inoltre indispensabile che durante la fase di dissociazione con la siringa (passo 2.5), un livello medio forza viene applicata durante il movimento su e giù con lo stantuffo, questo assicura un&#39;adeguata dissociazione tessuto prima della fase di filtrazione (2,6), dove poco il tessuto deve essere trattenuta dal filtro colino da tè. Infine, l&#39;ultimo passo da seguire con attenzione è l&#39;aspirazione di tutta la 20 ml delle isole HISTOPAQUE frazionati. Anche se isole sono in genere a livello di interfaccia del HISTOPAQUE e HBSS, abbiamo scoperto che si perde isole quando cerchiamo di rimuovere solo l&#39;interfaccia, invece, ora rimuovere l&#39;intero 20 ml con un ampio passaggio pipetta 25 ml. Abbiamo aggiunto la filtrazione attraverso il filtro inverso 70 micron (passo 2.11) per eliminare la necessità di centrifuge le isolette più volte per lavare via il HISTOPAQUE.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td></td><td> Catalogo # </td></tr><tr><td> HBSS 10X </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 sutura 100 m rotolo </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g smussato &#39;ago </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vännäs Superfine SCISS </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici curve Primavera </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve (di 90 °) </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G mezzo ago pollici </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G ago 1/2 pollice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE tubo </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP Proteasi </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml siringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 30 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 pm filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Tè colino in plastica </td><td> Ogni cucina di alimentazione </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti Tabella 1. E attrezzature </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma tipo XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110329) </td><td> MA (081104) BP (100823) </td><td> MA (091211) BP (101109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Rendimenti isole media (± DS) con un sacco TDE diverse * * I dati rappresentano i rendimenti medi delle isole di almeno 10 topi. I numeri di lotto tra parentesi </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

L&#39;interrogazione di espressione genica delle cellule beta e funzione in vitro è spostato esattamente negli anni dallo studio di linee cellulari tumorali roditore allo studio di isole isolate roditori. Isole principali offrono il vantaggio che più rispecchiano fedelmente la biologia di vie di segnalazione intracellulare e risposte secretorie. Considerando che il metodo di isolamento delle isole utilizzando tessuti dissociando enzimatici (TDE) preparativi è stato ben definito in molti laboratori di 1-4, le variazioni nella consistenza della resa delle isole e di qualità da qualsiasi ceppo roditore dato limitare la portata e la fattibilità di studi delle isole principali. Queste variazioni si verificano spesso come risultato delle TDES grezzi parzialmente purificati utilizzati nella procedura di isolamento isolotto; TDES spesso presentano lotto a lotto variazioni nell&#39;attività e spesso richiedono adattamenti della dose di enzima impiegato. Un piccolo numero di report hanno utilizzato purificato TDES per isolamenti cellulari roditore 5, 6 </sup&gt;, ma la pratica non è diffusa, nonostante l&#39;uso di routine ed i vantaggi di purificato TDES per isolamenti delle isole umane. In collaborazione con VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), abbiamo sviluppato un protocollo modificato isolotto topo isolamento basato su quello descritto da Gotoh 7, 8, in cui vengono perfuse le TDES direttamente nel dotto pancreatico di topi, seguito da frazionamento tessuto greggio attraverso un gradiente Histopaque 9, e l&#39;isolamento di isolotti purificato. Una differenza significativa nel nostro protocollo è l&#39;uso di collagenasi purificata (CI zyme MA) e neutro proteasi (CI zyme BP) combinazione. La collagenasi è caratterizzato dall&#39;uso di un collagene 6 degradante attività di fluorescenza (CDA) saggio che utilizzato contrassegnati in modo fluorescente solubili fibrille vitello come substrato 6. Questo substrato è più predittiva della cinetica di degradazione del collagene nella matrice del tessuto perché si basa su collagene nativo come substrato. La proteasi è characterized con un sensibile test di fluorescenza cinetica 10. Utilizzando questi saggi migliori insieme con la più tradizionale analisi biochimiche consentire la TDE da produrre in modo più coerente, con conseguente miglioramento delle prestazioni la coerenza tra i lotti. Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per la massima resa isolotto e morfologia isolotto ottimale utilizzando topi C57BL / 6. Durante lo sviluppo di questo protocollo, diverse combinazioni di collagenasi e proteasi neutre stati valutati a diverse concentrazioni, e il rapporto finale di collagenasi: proteasi neutra di 35:10 rappresenta enzima prestazioni paragonabili a Sigma tipo XI. Poiché significativa variabilità delle rese insule media da diversi ceppi di topi e ratti sono stati riportati, ulteriori modifiche della composizione TDE dovrebbe essere fatto per migliorare la resa e la qualità di isolotti recuperati da diverse specie e ceppi.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease at JoVE.com

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Research

JoVE Journal

Biology

43.2K Views.  Indiana University School of Medicine. Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.

Video: Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murino pancreatica isolamento Islet

Ricerca

Biologia

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...