We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

1. Generazione e convalida delle Chimere proteina fluorescente <ol><li> Append proteina fluorescente verde (GFP) alla ammino o carbossile termini della proteina di interesse utilizzando strategie di DNA ricombinante standard di 13. NOTA: Anche se abbiamo utilizzato ampiamente GFP, altre varianti come la proteina ciano fluorescente (PCP), proteina fluorescente gialla (YFP), DsRed e mCherry possono essere impiegati. Miglioramenti in fluoroforo pieghevole efficienza, luminosità e fotostabilità vengono costantemente effettuati, e gli investigatori devono avvalersi dei costrutti di ultima generazione. <ol><li> Confermare sequenza di DNA corretta e assicurarsi che la frazione GFP è in cornice con la proteina di interesse. Eseguire sequenziamento utilizzando strategie di DNA ricombinante normali 21. NOTA: Molte istituzioni hanno servizi DNA di base, che il ricercatore è incoraggiato a contattarci per ulteriori informazioni. </li><li> Per proteine ​​di membrana passaggio singole o doppie, generareentrambe le versioni terminali ammino- e carbossilici delle proteine ​​di fusione 19. </li><li> Per le proteine ​​di multi-spanning inserire GFP all&#39;interno di cicli extramembrane putativi, così come il termini. Prestare particolare attenzione quando si generano chimere transmembrana con la proteina di fusione fluorescenti attaccato al capolinea amino della proteina bersaglio come sequenze di segnali sono spesso spaccati dalla proteolisi una volta che la proteina è passato attraverso il translocon ER. </li><li> Nel caso di sequenze di segnali esistenti, inserire la proteina di fusione fluorescenti distale al sito di scissione in modo da generare una proteina matura contenente una proteina fluorescente tag intatto ammino-terminale. Impiegare strategie DNA ricombinante standard per la generazione di chimere 21. </li></ol></li><li> Determinare la presenza del segnale fluorescente sufficienti opportunamente localizzata nella linea cellulare di interesse. <ol><li> Osservare le cellule sotto epifluorescenza utilizzando la fluorescenza intrinseca di GFP sotto ademangiato condizioni di filtro impostato. Per set di filtri GFP che comprendono 510-560 nm, confermano che i filtri corretti sono utilizzati per il fluoroforo impiegato. NOTA: Un segnale sufficiente si ottiene quando la valutazione ad occhio fornisce un segnale abbastanza forte che la struttura cellulare all&#39;interno della quale risiede il segnale viene facilmente risolto sopra sfondo. Inoltre il pattern di colorazione della proteina-GFP deve essere coerente con quello dei marcatori per la organello appropriata, e preferibilmente identica a quella della proteina nativa non etichettato. </li></ol></li><li> Determinare se un approccio stabile o transiente trasfezione sarà utilizzato basa la proteina in corso di valutazione. NOTA: trasfettanti stabili generalmente offrono bassi livelli di espressione rispetto ai sistemi transitori. Sebbene espressione transiente produce espressione elevato livello di proteine ​​e aumento dell&#39;intensità di segnale (~ 5-24 ore dopo la trasfezione seconda proteina), può anche portare ad artefatti iperespressione come proteine ​​aggregation o la saturazione di proteine ​​di targeting percorsi, portando a localizzazione subcellulare erronea. </li></ol> 2. Trasfezione delle cellule e colture cellulari NOTA: Una varietà di cellule sono suscettibili di analisi FPP, tra cui HEK293, HeLa, COS-7 e cellule CHO 14. La seguente descrizione è basata su esprimenti proteine ​​di membrana in cellule HEK293. <ol><li> Grow cellule umane embrionali renali (HEK293) come monostrati aderenti a 6 ml di Dulbecco modificato (DMEM), integrato con siero 5% fetale bovino (FBS), 1% piruvato di sodio, e 250 mg / ml di penicillina / streptomicina a 37 ° C con il 5% di CO 2. Eseguire il lavoro con le cellule in coltura tissutale cappa a flusso laminare. Grow cellule in mezzo di coltura fino ~ 80% confluenti in un pallone T-75. </li><li> Cellule trasfettare utilizzando qualsiasi alta efficienza standard metodo trasfezione bassa tossicità, compresi lipid-, tecnologie viral- o basati elettroporazione, per generare transient o espressione stabile. Tipicamente 2 mg di plasmide DNA per 1 x 10 6 cellule dà buona espressione proteica riproducibili. Mantenere cellule per 5-48 ore in appropriate terreni di coltura tissutale a 37 ° C in un CO 2 in grado di coltura tissutale incubatore. </li><li> Monitorare le cellule per l&#39;espressione della proteina GFP-fusion con epifluorescenza, utilizzando il segnale di fluorescenza intrinseca di GFP, utilizzando appositi set di filtri secondo il protocollo del produttore. Segnale di fluorescenza di solito raggiunge un massimo entro 24-72 ore dopo trasfezione. Utilizzare cellule quando il segnale di fluorescenza raggiunge un livello massimo. Monitorare i livelli di espressione della proteina mediante analisi immunoblot utilizzando anticorpi diretti contro la proteina o di interesse o porzione GFP. </li><li> Per le celle sperimentali piastra analisi su vetrini rivestiti. Visualizza sia sotto una configurazione live-cell o dopo la fissazione e montare su vetrini microscopia. Cellule piastra per raggiungere il 60% -80% di confluenza entro 24-48 ore. <ol><li> Coprioggetto Coat con la soluzione di poli-lisina (0,1 mg / ml), in modo che l&#39;intera superficie è coperta. Incubare per 30 minuti sotto una luce ultravioletta a temperatura ambiente, seguito da 60 minuti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C. Rimuovere l&#39;eccesso poli-lisina e lavare i coprioggetti in PBS 3 volte. </li><li> In alternativa, piastra le cellule su una copertura in vetro a camera composta da piastre di coltura cellulare con un fondo di vetro ottico per consentire l&#39;imaging diretto con obiettivi ad immersione in olio. La configurazione effettiva microscopia dipende apparecchiature disponibili al ricercatore, ma dovrebbe essere in grado di soluzione cambia rapidi. A seconda della forma tipo di cellula e cellula, cellule dovrebbe essere circa 60-90% confluenti al momento del dosaggio FPP. </li></ol></li></ol> Setup 3. microscopia a fluorescenza <ol><li> Utilizzare una apertura numerica (NA) dell&#39;obiettivo alta ad immersione in olio per la raccolta del segnale massima e risoluzione spaziale, come ad esempio un 60X, 1,42 NA obiettivo ad immersione. Usa the dopo il laser per stimolare i fluorofori: gas Argon 488 nm (GFP e YFP) e 561 diodo (RFP, mCherry). </li><li> Determinare l&#39;esposizione, il guadagno e la cattura tasso ottimale di immagini per ogni costrutto. Regolare intensità del laser e tempo di esposizione per minimizzare photobleaching (vedi punto 7.1.2). </li><li> Per gli studi che utilizzano più fluorofori (ad esempio, un marker solubile per permeabilizzazione della membrana in concerto con un pennarello proteina di membrana), scegliere filtro appropriato imposta per ridurre al minimo segnale di cross-talk e massimizzare rapporti segnale-rumore. </li></ol> 4. Stabilire le condizioni ottimali per membrana plasmatica Permeabilization <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura di cellule da cellule che esprimono solo proteine ​​fluorescenti solubili (es EGFP, DsRed). Lavare le cellule 3 volte (1 min ciascuno) in tampone KHM (110 mM potassio acetato, 3 mM MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Effettuare esperimenti con cellule e tutti i reagenti a temperatura ambiente. </li><li> Luogo cellule on coprioggetto (vedi punto 2.4) in tampone KHM su un palco microscopio a fluorescenza e raccolgono la prima immagine, che rappresenta il controllo &#39;non-permeabilizzate&#39; stage. </li><li> Per permeabilize selettivamente la membrana plasmatica, aggiungere digitonina (30 mM) in tampone KHM alle cellule. Profumato cellule con tampone (buffer + digitonina) ad una velocità di 5 ml / min per 10-60 sec. </li><li> Determinare la concentrazione ottimale digitonina aumentando gradualmente la concentrazione di digitonina. La concentrazione digitonina ottimale si ottiene quando vi è perdita completa del segnale di fluorescenza da EGFP solubile entro 10-60 secondi di applicazione digitonina. Per molte cellule applicazione di 10-50 mM digitonina è sufficiente permeabilize membrana cellulare. <ol><li> Per tutte le applicazioni utilizzano la concentrazione più bassa possibile di digitonina. Raccogliere le immagini dopo digitonina permeabilizzazione per permeabilizzate segnale di fondo. </li></ol></li><li> Verificare che la chimera GFP-proteina di interesse è membranategrated confermando ritenzione cellulare del segnale di fluorescenza seguente permeabilizzazione digitonina della membrana plasmatica 16. <ol><li> Esprimere una proteina fluorescente organello specifico 23. Proteine ​​mitocondriali funzionano bene in questo senso 16, ad esempio, pDsRed2-Mito vettoriale. Determinare le condizioni ottimali di espressione come descritto al punto 2.1. </li><li> Verificare che la concentrazione digitonina è appropriato per il tipo cellulare impiegato assicurando che la morfologia di organelli intracellulari rimane costante nel prolungato (fino a 60 min) esposizione a digitonina. NOTA: utilizzare protocolli standard di immunofluorescenza con anticorpi contro vari compartimenti cellulari, come lisosomi (es LAMPADA1), Golgi (ad esempio, TGN38), reticolo endoplasmatico (ad esempio, calnexina), endosomi (ad esempio, Rab5), mitocondri (ad esempio, citocromo c). Se organelli intracellulari modifiche morfologia / integrità drammaticamente over 60 min, è probabile che la concentrazione digitonina era troppo alta, e richiede una riduzione della concentrazione digitonina e / o tempo di esposizione. NOTA: Digitonin è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (DPI). </li></ol></li></ol> 5. Protease Trattamento di proteine ​​fluorescenti <ol><li> Lavare le cellule in tampone KHM e quindi aggiungere proteasi (proteasi K; 50 mg / ml in tampone KHM) direttamente sulle celle. Profumato cellule ad una velocità di flusso di 5 ml / min usando un sistema di perfusione a gravità alimentata alla vasca continuamente la preparazione. <ol><li> Soluzioni negozio in 50 ml siringhe e tubi di polietilene collegati serbatoi indipendenti ad un collettore con una singola presa al bagno (portata 5 ml / min). Posizionare una pipetta di aspirazione per mantenere una (0,5 ml) Volume vasca costante e conseguire scambio soluzione commutare manualmente i serbatoi di perfusione. </li></ol></li><li> Raccogliere immagini per determinare se il fluorSegnale escent persiste o si degrada. Una perdita di&gt; 90% dell&#39;intensità del segnale iniziale tramite 30-60 sec è coerente con la degradazione proteolitica della chimera GFP-proteina (vedi Risultati rappresentativi). </li><li> Se nessuna degradazione del segnale si osserva con proteinasi K, quando si prevede tale perdita, sostituire la soluzione di proteinasi K con tripsina (4-8 mM) in tampone KHM. Se necessario, utilizzare una miscela di proteinasi K e tripsina. Non vi è alcuna necessità di spegnere l&#39;attività della proteasi. </li></ol> 6. Approccio per plasma proteine ​​di membrana con domini esterni Alternative <ol><li> Per proteine ​​di membrana plasmatica, eseguire il test per le proteine ​​fluorescenti esterni chimere prima di digitonina permeabilizzazione. Lavare le cellule su vetrini in tampone KHM (5 ml / min x 3 min), e prendere una immagine per il trattamento pre-proteasi e quantificare segnale di fluorescenza pre-proteasi come al punto 7. </li><li> Esporre le cellule di proteasi (proteinasi K; 50 mg / ml o tripsina 4-8 mm in tampone KHM) in tha assenza di digitonina mediante perfusione le cellule con KHM supporto contenente proteasi (portata 5 ml / min). Raccogliere immagini della proteina fluorescente, per determinare quanto velocemente il segnale scompare e per quanto tempo il segnale persiste. </li><li> Prima permeabilizzazione digitonina, spegnere tutte le attività della proteasi, lavando le cellule tre volte (1 min ciascuno) in mezzi di coltura cellulare contenente siero 10% (FBS). </li><li> Lavare le cellule mediante perfusione con tampone KHM (velocità di flusso di 5 ml / min) per 2 min. Acquisire un&#39;immagine pre-permeabilizzazione. Permeabilize la membrana cellulare, come descritto al punto 4. </li><li> Raccogliere le immagini seguenti proteasi Inoltre, come descritto al punto 5. </li></ol> Analisi 7. Immagine <ol><li> Utilizzare un microscopio invertito in grado di &quot;cellule vive&quot; di registrazione, in cui la perdita del segnale di fluorescenza può essere monitorato in tempo reale. Per il monitoraggio continuo, impiegare parametri identici (tempo di esposizione, il guadagno, intensità laser, ecc). <ol><li> Determinare experparametri imental osservando il segnale di fluorescenza dalla GFP-proteina di interesse in condizioni di controllo (ad esempio, KBH tampone da solo). Regolare le impostazioni di tempo guadagno, intensità di esposizione laser e sul microscopio computer guidato per garantire che non vi è alcuna perdita apprezzabile di intensità del segnale in un periodo di 10-20 minuti. NOTA: intensità del segnale non è un valore assoluto, ma si basa sul sistema microscopio e impostazioni disponibili per ciascun PI. Monitorare i cambiamenti di intensità di fluorescenza relativa. </li></ol></li><li> In alternativa, il trattamento di cellule a set punti temporali in digitonina seguito da proteasi, e fissare le cellule prima del montaggio su vetrini per l&#39;imaging. Determinare punti di tempo a seguito empiricamente procedure nei passaggi 4 e 5. Per l&#39;indagine iniziale, partono da 0, 30, 60, 120 e 300 sec dopo aggiunta di digitonina o proteasi. <ol><li> Fissare cellule (20 min a temperatura ambiente) con una quantità sufficiente di fissativo (3,7% paraformaldeide in PBS) per immergere completamente thcellule e. </li><li> Quench paraformaldeide residua sciacquando cellule con PBS contenente glicina 20 mm (3 x 5 min). </li><li> Mount coprioggetto rimuovendo il liquido in eccesso dal vetrino e invertendo il vetrino su un supporto di montaggio 50 microlitri su un microscopio Vetrini per l&#39;imaging. Lasciare i vetrini si asciughino durante la notte prima di imaging. </li></ol></li><li> Raccogliere immagini al microscopio a fluorescenza (sotto i filtri appropriati imposta compatibile con il fluoroforo utilizzato) utilizzando la funzione di cattura dell&#39;immagine video su un microscopio a fluorescenza computer controllato. </li><li> Quantificare intensità di segnale fluorescente in funzione della condizione di incubazione. Ottenere l&#39;intensità dei pixel media all&#39;interno di una regione di interesse (ROI) che racchiude una singola cella. </li></ol>

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	<li>Sevier, C. S., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+transfer+of+disulphide+bonds+in+living+cells.">Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).</li><li>Brodsky, J. L., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum:+Recent+lessons+from+yeast+and+mammalian+cell+systems.">Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems.</a> Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+displaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.</a> J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Ott, C. M., Lingappa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+protein+biosynthesis:+why+topology+is+hard+to+predict.">Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict.</a> J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).</li><li>Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topological+analysis+of+integral+cytoplasmic+membrane+proteins.">The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins.</a> The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).</li><li>Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+transmembrane+alpha-helices+in+prokaryotic+membrane+proteins:+the+dense+alignment+surface+method.">Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method.</a> Protein Eng. 10, 673-676 (1997).</li><li>Geest, M., Lolkema, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+topology+and+insertion+of+membrane+proteins:+search+for+topogenic+signals.">Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).</li><li>Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+topology+mapping+by+the+substituted+cysteine+accessibility+method+(SCAM(TM)):+application+to+lipid-specific+membrane+protein+topogenesis.">Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis.</a> Methods. 36, 148-171 (2005).</li><li>Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+membrane+topology+by+glycosylation+site+insertion.">Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion.</a> J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Zamyatnin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells.">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li><li>Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+protease+protection+of+GFP+chimeras+to+reveal+protein+topology+and+subcellular+localization.">Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization.</a> Nat Methods. 3, 205-210 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+you+know+the+sex+of+your+cells?+American+journal+of+physiology.">Do you know the sex of your cells? American journal of physiology.</a> Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).</li><li>Wang, H., Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transmembrane+Ser/Thr+kinase+complexes+with+protein+phosphatase-1+and+inhibitor-2.">A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2.</a> J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).</li><li>Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+protease+protection+reveals+the+topology+of+the+integral+membrane+protein+Lemur+Tyrosine+Kinase+2+(LMTK2).">Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2).</a> Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).</li><li>Tagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+trafficking+of+caveolar+domains+in+the+cell:+caveolae+as+stable,+cargo-triggered,+vesicular+transporters.">Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters.</a> J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues.">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells.">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Curr Biol. 5, 635-642 (1995).</li><li>Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+phenotyping+of+secretory+and+nuclear+prion+proteins+associated+with+inherited+prion+diseases.">Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases.</a> J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).</li><li>Ben-Gedalya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin-A-induced+prion+protein+aggresomes+are+dynamic+quality-control+cellular+compartments.">Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments.</a> J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).</li><li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+of+the+Syrian+hamster+prion+protein+utilizing+chimeric+and+mutant+genes+in+a+vaccinia+virus+expression+system.">Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.</a> J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).</li><li>Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+mislocalization+of+a+tail-anchored+GFP+redefines+the+identity+of+peroxisomal+ER.">Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER.</a> Traffic. 4, 491-501 (2003).</li><li>Brandee, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+and+degradation+of+human+P23H-Rhodopsin-GFP+in+knockin+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa.">Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

L&#39;orientamento e la topologia corretta delle proteine ​​di membrana è essenziale per il loro corretto funzionamento. Nonostante l&#39;importanza di comprendere la topologia proteina di membrana, ci sono molte proteine ​​per i quali i dati sono del tutto carenti. FPP fornisce un modo semplice ed efficace per determinare topologia proteina di membrana, e uno che può essere eseguita dalla maggior parte dei laboratori. L&#39;approccio FPP offre vantaggi significativi rispetto ai metodi precedenti per la determ...

Le membrane plasmatiche, nonché numerose membrane intracellulari, servono come barriere che separano due compartimenti acquosi. Nel caso della membrana plasmatica, la separazione è tra l&#39;esterno e l&#39;interno della cella; per organelli intracellulari che è tra il citoplasma e il lume organelli. Ad esempio, la membrana del reticolo endoplasmatico (ER) separa un ambiente ossidante all&#39;interno del lume del ER da un citosolico riducendo ambiente 1. Le proteine ​​di membrana sono sintetizzate sui ribosomi ER-associata, e raggiungere il loro topologia finale entro la membrana ER 2. L&#39;acquisizione di un adeguato orientamento membrane e topologia per le proteine ​​è fondamentale per la loro normale funzione. Topologia corretta permette pertinenti domini di proteine ​​di membrana per interagire con i partner di legame, permette critici modificazioni post-traduzionali a verificarsi, e nel caso delle proteine ​​di membrana di plasma, permette alla cellula di interagire con e rispondere to suo ambiente. Per apprezzare appieno la funzione di una proteina di membrana, è chiaramente indispensabile sapere come tale proteina è orientato rispetto alla membrana entro cui risiede, cioè la sua topologia membrana. Oltre alla acquisizione di conoscenze scientifiche di base, comprendere la topologia di una proteina di membrana e quali aspetti di una superficie proteine ​​sono esposte ad ambienti differenti ha segnato implicazioni cliniche poiché proteine ​​di membrana sono la maggioranza dei bersagli farmacologici 3. Fino a poco tempo, approcci per determinare la topologia di proteine ​​di membrana hanno richiesto un notevole investimento di tempo e di denaro o hanno richiesto reagenti che sono difficili da trovare. Sia approcci sperimentali e in silico sono stati impiegati per determinare la topologia di proteine ​​di membrana che risiedono all&#39;interno della membrana plasmatica. Dal momento che le prime previsioni di domini di membrana attraversa basati sulla idrofobicità valutato di indiviaminoacidi doppio 3, numerosi algoritmi predittivi sono ora disponibili su internet, e semplicemente richiedono la conoscenza della sequenza aminoacidica della proteina. Tuttavia, le ipotesi sono spesso al centro di tali programmi di modellazione, ipotesi che possono portare alle assegnazioni errate di topologia 4,5. Inoltre, mentre le previsioni basate su computer è possibile assegnare provvisoriamente le regioni che vanno a membrana, che non sempre determinano se la amino o carbossi-terminale di proteine ​​sono nel citoplasma, lume organelli o esterno cella. Anche con maggiore potenza di calcolo, e l&#39;uso di algoritmi di apprendimento macchina 6, tali dati è ancora un modello, e deve essere convalidato utilizzando i dati acquisiti sperimentalmente. Determinazione diretta sperimentale di topologia di membrana è stata effettuata utilizzando pannelli di anticorpi monoclonali con epitopi noti distribuite in tutta la proteina, in cui è stata effettuata la valutazione della loro immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione cellulare. Questoapproccio richiede una serie di anticorpi, che non possono essere disponibili per la proteina di interesse. Una strategia alternativa è quella di progettare etichette epitopi quali myc o emoagglutinina (HA) in varie località in tutta la proteina, ancora una volta seguita da determinazione della immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione della membrana. Oltre ai tag immunogenico, tag enzimatici (compresi fosfatasi alcalina, β-galattosidasi, o β-lattamasi) e modificazioni chimiche come la scansione cisteina sono stati tutti impiegati per determinare membrana proteica topologia 7,8. Un ulteriore metodo impiegato per la mappatura topologica delle proteine ​​di membrana plasmatica si basa su un approccio leggermente diverso per tag epitopi. In questo metodo la sequenza di tag è la sequenza di consenso glicosilazione N-linked NXS / T. Poiché glicosilazione avviene solo quando tale sequenza è presente nel lume della via biosintetica, la presenza del tag in un luminale controun compartimento citosolico è facile osservare come spostamento di massa su gel SDS-PAGE. Tale approccio è stato applicato al canale ionico multispanning CFTR 9. Mentre tutti questi approcci sono stati utilizzati, è chiaro che tutti richiedono notevoli investimenti nel campo della biologia molecolare per generare e la sequenza dei costrutti molteplici. Per determinare le informazioni topologiche riguardanti proteine ​​transmembrana situati all&#39;interno organelli intracellulari ha dimostrato di essere più impegnativo. L&#39;applicazione di tecnologie basate fluorescenza tuttavia, ha fatto la determinazione della topologia di membrana molto più semplice. La tecnica di bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) si basa sulla interazione tra due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente, ripristinando le proprietà fluorescenti di quella proteina 10. Sebbene inizialmente descritto per determinare le interazioni proteina-proteina in vivo 10, questo approccio è anche stato utilizzatoper determinare membrana proteica topologia nelle cellule vegetali 11. Tuttavia questo approccio è anche tempo intenso in quanto richiede la generazione non solo di proteine ​​di fusione con la proteina di interesse, ma anche una varietà di proteine ​​di fusione mirati al citosol o organelli lume, e richiede la cui conoscenza intracellulare membrane proteina di interesse risiede in . Un approccio alternativo alla semplice determinazione topologia proteina di membrana è stato descritto 12. Il saggio di fluorescenza proteasi protezione (FPP) richiede la generazione di una proteina di fusione tra GFP e il gene di interesse. L&#39;approccio è basato sulla relativa accessibilità di proteasi non specifici per la frazione GFP; a seconda che GFP è protetto dalla proteolisi risiedendo nel lume di organelli intracellulari o è esposto alla proteolisi essendo presenti nel citosol. Pertanto, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia citoplasma, sarà esposto aattività proteasica e il segnale di fluorescenza persi. Al contrario, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia un ambiente &#39;protetto&#39; dalla proteasi (come il lume Golgi) allora il segnale di fluorescenza persisterà. Per consentire proteasi di entrare nella cellula, ma non immettere compartimenti intracellulari membrana farmaco vincolante colesterolo digitonina viene utilizzato. Il colesterolo è sterolo dominante in vertebrati, ed è specificamente arricchito nella membrana plasmatica rispetto al compartimenti intracellulari. La tossina glicoside, digitonina, viene estratto dalla pianta Digitalis purpurea. Digitonin ha un&#39;affinità per colesterolo ricchi membrane, dove si porta a membrana selettiva permeabiliztion 14,16 (figura 1). Oltre a consentire l&#39;uscita dei piccoli componenti citosolici, permeabilizzazione digitonina permette anche l&#39;ingresso di molecole esogene quali proteinasi K o tripsina. Il protocollo FPP sfrutta il fact che la membrana plasmatica contiene fino al 80% del colesterolo cellulari 17, mentre altri organelli, come ER, Golgi, endosomi, i mitocondri, che hanno molto basso contenuto di colesterolo, rimangono intatti 14. L&#39;incorporazione selettiva di colesterolo nella membrana plasmatica è stata osservata in molte cellule eucariotiche, permettendo l&#39;uso di digitonina-dipendente permeabilizzazione della membrana plasmatica in tali diverse specie eucariotica come S. cerevisiae di umana 14,18. Il dosaggio FPP fornisce un mezzo semplice, rapido e abbastanza robusti di determinazione (a) se una proteina è legato alla membrana / o associati liberamente diffusibile nel citosol e (b) che dominio di una proteina di membrana affronta citosol o organelli lumen. Qualora una proteina di membrana avere più orientamenti, il segnale sorgerà dalla forma dominante e non verrà rilevato forme minori. Mentre ci può essere qualche preoccupazione che l&#39;aggiunta di una frazione GFP alla proteina di interesse può influire sulla sua funzione e/ O localizzazione subcellulare, questo è in realtà più teorica che reale. Infatti molti studi hanno chiaramente dimostrato che il tag GFP non altera le proprietà della proteina 19,20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="370">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:111px;">Name</td>
			<td style="width:80px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cav1-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td align="right">44433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAcGFP-1 Golgi</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">632464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polylysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>cS704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Plasma permeabilizzazione della membrana Efficient permeabilizzazione della membrana plasmatica è determinato mediante l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti solubili (ad esempio, GFP, DsRed) (Passaggio 4). Queste proteine, quando espresso in cellule, sono liberi di diffondere nel citosol, e vengono persi quando la membrana plasmatica è permeabilizzate con digitonina (Figura 2). Una completa scomparsa del segnale fluorescente dovrebbe avvenire entro 10-...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Research

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Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.6K Views.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Ricerca

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine ​​di membrana

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.