Istruzioni per la preparazione Il tampone di incubazione, tampone del saggio, e 0,6 N Soluzione TCA sono forniti pronti per l&#39;uso-solutions. La FITC-caseina substrato - Si consiglia di aliquota con FITC caseina substrato in volumi più piccoli al loro arrivo al fine di evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. Se il FITC-caseina substrato è sottoposta a ripetuti cicli di gelo e disgelo, un leggero aumento del fondo avverrà, quindi, abbassando la sensibilità. Le aliquote devono essere conservati a -20 ° C e al riparo dalla luce. Ogni campione, reazione vuoto, o di controllo richiede 20 microlitri della FITC-caseina substrato. Gelo / disgelo e vigorosa miscelazione o agitazione può causare la FITC a separarsi dal caseina con conseguente maggiore sfondo lettura e causando meno substrato ad essere disponibile per la scissione della proteasi. L&#39;isotiocianato di fluoresceina (FITC) Soluzione di controllo-Il controllo FITC può essere ricostituito nel tampone del saggio alla concentrazione adeguata. Questa soluzione deve essere fresco e al riparo dalla luce. Soluzione finale della tripsina di controllo - Aggiungere 100 ml di 1 mM HCl al flaconcino di tripsina, proteasi Control (Product Code T 6567). Miscelare brevemente per garantire la tripsina è sciolto. Aggiungere 900 ml di tampone di incubazione e mescolare bene. In alternativa, i buffer possono essere utilizzati altri se lo si desidera per il test. La concentrazione finale di lavoro della tripsina è di 20 mg / mL. Quando si è pronti per preparare la soluzione di controllo tripsina, combinano una aliquota della soluzione acida tripsina con la giusta quantità di Incubation Buffer (1 tripsina acidificato parte a 9 tampone parti). Memorizzazione della tripsina in condizioni acide aumenta la stabilità della tripsina. La soluzione di controllo tripsina è sensibile alla temperatura e non è stabile a basse concentrazioni. Si prega di rivedere bollettino tecnico del kit per la conservazione e la stabilità di queste soluzioni preparate. Procedura <ol><li> È più facile preparare i controlli, spazi vuoti, e tutti i campioni in una sola volta. Per ogni campione, aggiungere 20 ml di tampone di incubazione, 20 l di FITC-caseina substrato, e 10 ml di campione in una provetta da microcentrifuga. Per i campioni di prova con l&#39;attività della proteasi alta diluizione del campione può essere richiesto. </li><li> Preparare i campioni di controllo appropriate (vedere Esempi di controllo) con l&#39;aggiunta di 20 l di tampone di incubazione, 20 l di FITC-caseina substrato, e 10 ml di campione di controllo di una provetta. </li><li> Preparare un campione in bianco con l&#39;aggiunta di 20 l di tampone di incubazione, 20 l di FITC-caseina substrato, e 10 ml di acqua ultrapura in una provetta da microcentrifuga. </li><li> Mescolare delicatamente ogni tubo ed incubare a 37 ° C al buio per 60 minuti. Fare attenzione a non mescolare troppo energicamente, come turbolenza eccessiva può causare alta fluorescenza di fondo e di ridurre la sensibilità del test. Nota: il tempo di incubazione può essere prolungato fino a 24 ore per aumentare la sensibilità. Fare attenzione a non superare 24 ore come FITC-caseina può cominciare a degradare, portando ad alta fluorescenza di fondo. </li><li> Dopo l&#39;incubazione aggiungere 150 microlitri della soluzione 0,6 N di acido tricloroacetico ad ogni provetta. TCA è molto corrosivo e deve essere maneggiato mentre indossa l&#39;equipaggiamento protettivo idoneo. </li><li> Mescolare delicatamente e incubare a 37 ° C al buio per 30 minuti. </li><li> Centrifugare le provette per 10 minuti a 10.000 x g. Il supernatante contiene il solubile acido, frammenti marcato con FITC ed è utilizzato per la misurazione della fluorescenza. </li></ol> Misure di fluorescenza Questi metodi possono essere scalato verso l&#39;alto o verso il basso a seconda delle esigenze della strumentazione disponibile. Per il confronto con una curva standard preparata con i campioni di controllo adeguati, sottrarre la lettura di fluorescenza del campione in bianco (FLUblank) dal valore di ciascun campione (FLUtest). Cuvette <ol><li> Pipettare 10 ml di surnatante (passo 7) e 1 ml di tampone del saggio nella cuvetta adatto e mescolare delicatamente. Nota: la soluzione del Buffer surnatante e di analisi possono essere conservati al buio a 2-8 ° C fino a 24 ore prima di misurare la fluorescenza. </li><li> Registrare l&#39;intensità di fluorescenza con eccitazione a 485 nm e il monitoraggio della lunghezza d&#39;onda di emissione di 535 nm. </li></ol> Pozzetti Piastre <ol><li> Pipettare 10 ml di nota surnatante (punto 7) e 1 ml di tampone del saggio in un tubo adatto o fiala e mescolare delicatamente: la soluzione del Buffer surnatante e di analisi possono essere conservati al buio a 2-8 ° C al massimo a 24 ore prima di misurare la fluorescenza. </li><li> Trasferire 200 ul di un pozzo nero di una piastra da 96 pozzetti. Registrare l&#39;intensità di fluorescenza con eccitazione a 485 nm e il monitoraggio della lunghezza d&#39;onda di emissione di 535 nm. O </li></ol><ol><li> Pipettare 2 ml di surnatante (passo 7) e 200 microlitri della B AssayUffer in un pozzo nero di una piastra da 96 pozzetti. Nota: la soluzione del Buffer surnatante e di analisi possono essere conservati al buio a 2-8 ° C fino a 24 ore prima di misurare la fluorescenza. </li><li> Registrare l&#39;intensità di fluorescenza con eccitazione a 485 nm e il monitoraggio della lunghezza d&#39;onda di emissione di 535 nm. </li></ol> Campioni di controllo La soluzione di controllo Tripsina può essere utilizzato per confermare il test funziona correttamente, per determinare il limite di rilevazione, o creare una curva generale standard. Per l&#39;analisi di un diverso, specifico della proteasi, si consiglia di preparare una soluzione di controllo contenente le proteasi specifica nel buffer di incubazione appropriato. Il limite di rilevazione del test è la quantità di proteasi che produce una lettura significativa fluorescenza al di sopra del valore ottenuto con il campione bianco. Il limite di rilevazione varia a seconda della sensibilità della strumentazione. Diluizioni seriali della soluzione di controllo Tripsina possono essere utilizzati per generare le soluzioni di controllo. Una lettura pari al 120% del valore ottenuto con il campione in bianco è considerato significativo. Di routine, un limite di rilevazione di 5 ng di tripsina è stato ottenuto con questa procedura. Si raccomanda che almeno un 5 ng controllo tripsina essere eseguita per ogni dosaggio. Una soluzione di controllo di tripsina con una concentrazione di 0,5 mg / ml porterebbe alla desiderato 5 ng di tripsina nel saggio. A 40 volte la diluizione della soluzione di controllo tripsina (20 mg / ml) si traduce in un mcg / 0,5 ml soluzione di controllo, cioè una parte della soluzione di controllo tripsina a 39 parti di tampone di incubazione. <img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 (curva standard di attività tripsina): La soluzione di controllo tripsina (20 mg / ml) può anche essere usato per generare una curva standard, rendendo diluizioni seriali (vedi Figura 1). La lettura della fluorescenza di ciascun campione di controllo è stato corretto sottraendo la lettura di fluorescenza del campione in bianco (FLUblank) dal valore di ciascun campione di controllo (FLUcontrol). Tipica curva standard per la tripsina (Codice prodotto T 6567) utilizzando questo kit e campioni di controllo che vanno da 0,15 mg / ml (1,5 ng) a 2,5 mg / ml (25 ng). Questa curva è stata generata seguendo la procedura descritta, con un tempo di incubazione di 30 minuti per il punto 4. Misure di fluorescenza sono state effettuate in un piatto pozzetti. Isotiocianato di fluorescina viene fornito come un controllo per la calibrazione dello strumento possibile (vedere le istruzioni del produttore appropriato) o la determinazione del range di linearità del segnale FITC.

<ol>
	<li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes.">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li></ol>

L&#39;autore è un dipendente della Sigma Aldrich che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Abbiamo appena mostrato un saggio esempio utilizzando la fluorescenza Detection Kit della proteasi per rilevare l&#39;attività della proteasi in un campione biologico. Questo kit è stato ottimizzato per rilevare una vasta gamma di proteasi presenti nelle applicazioni fisiologiche. È adatto per il rilevamento di serina, cisteina, metallo, e aspartico proteasi, tuttavia, le modifiche possono essere tenuti a rilevare alcuni proteasi specifiche.

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=PF0100%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346&quot;&gt;Protease Fluorescent Detection Kit&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=H1758%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347&quot;&gt;Hydrochloric Acid&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr></tbody></table>

use of the protease fluorescent detection kit to determine protease activity

Il fluorescente Detection Kit proteasi fornisce pronti per l&#39;uso-reagenti per la rilevazione della presenza di attività della proteasi. Questo semplice test per rilevare l&#39;attività della proteasi utilizza la caseina marcato con isotiocianato di fluorescina (FITC) come substrato. L&#39;attività della proteasi risultati nella scissione del substrato caseina coniugati con fluoresceina in frammenti più piccoli, che non precipitare in condizioni di acidità. Dopo l&#39;incubazione del campione proteasi e substrato, la reazione è acidificato con l&#39;aggiunta di acido tricloroacetico (TCA). La miscela viene poi centrifugato con il substrato digerito formando una pallina e la più piccola, frammenti di acido solubile rimane in soluzione. Il supernatante viene neutralizzata e la fluorescenza della marcata con FITC frammenti viene misurato. La procedura descritta kit rileva il controllo della proteasi tripsina ad una concentrazione di circa 0,5 mg / ml (5 ng di tripsina aggiunto al test). Questa sensibilità può essere aumentata con un tempo di incubazione più lungo, fino a 24 ore. Il test viene eseguito in provette da microcentrifuga e le procedure sono previste per la rilevazione di fluorescenza utilizzando cuvette o piastre a pozzetti multipli.

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Il fluorescente Detection Kit proteasi è progettato per la misurazione dell&#39;attività della proteasi con fluorometria. E &#39;anche adatto per il rilevamento di tracce di contaminazione della proteasi. Il metodo si basa sulla hydroysis proteolitica di una formulazione proprietaria di un marcato con FITC substrato di caseina.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.1K Views.  Sigma Aldrich. Il fluorescente Detection Kit proteasi è progettato per la misurazione dell'attività della proteasi con fluorometria. E 'anche adatto per il rilevamento di tracce di contaminazione della proteasi. Il metodo si basa sulla hydroysis proteolitica di una formulazione proprietaria di un marcato con FITC substrato di caseina.

Video: Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Purificazione del DNA plasmidi da colonie batteriche Utilizzando il kit Qiagen Miniprep

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Ricerca

Biologia

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunoistochimica: sezioni di paraffina Utilizzando il Vectastain ABC Kit Labs Vector

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Ricerca sul cancro

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Biochimica

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Un'analisi di clivaggio Peptide fluorogenico alla schermata per attività proteolitica: applicazioni per coronavirus spike l'attivazione della proteina

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensori per rilevare attività della proteasi In Vivo per la diagnostica non invasiva

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Bioingegneria

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Un saggio di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi

1. Designing and Preparing the Peptides

	Acquire the sequence of the fusion protein of interest from a public database such as NCBI ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An In Vitro Assay for Measuring Neutrophil Serine Protease Activity Using a Fluorescent Reporter

Source: Frey, D. L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62193">Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an in vitro assay to quantify neutrophil serine protease activity in sputum samples. The sample containing secreted protease is incubated with a fluorescent reporter bearing a recognition motif. Cleavage of the motif by the protease enables individual fluorescence emission by the donor and acceptor fluorophore of the reporter, indicating protease activity in the sample.

Un test in vitro per misurare l'attività della proteasi della serina neutrofila utilizzando un reporter fluorescente

NOTE: The following protocols describe the sample preparation and the quantification of neutrophil serine proteases (NSPs) activity. The experimental ...

Fluorescent Peptide Zymography: A Modified Technique to Detect Protease Activity Using Fluorogenic Substrates in Zymogram Gels

Source: Deshmukh, A. A. et al. <a href="https://www.jove.com/video/58938" target="_blank">Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we perform zymography, an electrophoretic technique, to analyze the proteolytic activity within biological samples.

Zimografia peptidica fluorescente: una tecnica modificata per rilevare l'attività della proteasi utilizzando substrati fluorogenici in gel per zimogrammi

Source: Deshmukh, A. A. et al. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we perform zymography, ...

L'uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l'attività della proteasi

Riepilogo

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