1. Preparazione del gel <ol><li> Pesare la massa appropriato di agarosio in una beuta. Gel di agarosio sono preparati con p / v soluzione di percentuale. La concentrazione di agarosio in un gel dipenderà dalle dimensioni dei frammenti di DNA da separare, con la maggior parte gel comprese tra lo 0,5% -2%. Il volume del buffer non deve essere superiore a 1/3 della capacità del pallone. </li><li> Aggiungere tampone di corsa alla agarosio contenente pallone. Mescolare. Il gel più comune buffer di esecuzione sono TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Sciogliere l&#39;agarosio / buffer miscela. Questo è più comunemente fatto da riscaldamento in un forno a microonde, ma può anche essere eseguita su una fiamma Bunsen. A intervalli di 30 s, togliere i il contenuto della beuta e agitare bene. Ripetere fino l&#39;agarosio si è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere etidio bromuro (EtBr) ad una concentrazione di 0,5 ug / ml. In alternativa, il gel può anche essere tinta dopo elettrophoresis in esecuzione tampone contenente 0,5 mg / ml EtBr per 15-30 min, seguito da decolorazione in tampone di corsa per la stessa durata di tempo. </li></ol> Nota: EtBr è un sospetto cancerogeno e devono essere adeguatamente smaltite da regolamento dell&#39;istituzione. I guanti devono essere sempre indossati quando si maneggiano gel contenenti EtBr. Coloranti alternativi per la colorazione del DNA sono disponibili, ma EtBr rimane il più popolare grazie alla sua sensibilità e il costo. <ol start="5"><li> Lasciare raffreddare agarosio sia sul piano del banco o da incubazione in un bagno di acqua 65 ° C. In caso contrario, sarà deformare la mascherina. </li><li> Collocare il vassoio gel nell&#39;apparato casting. In alternativa, si può anche fissare le estremità aperte di un vassoio gel per creare uno stampo. Inserire un pettine appropriato nello stampo gel per creare i pozzi. </li><li> Versare l&#39;agarosio fuso nello stampo gel. Lasciare il agarosio per impostare a temperatura ambiente. Rimuovere il pettine e posizionare il gel nella casella gel. In alternativa, la gel può anche essere avvolto nella pellicola e conservati a 4 ° C fino all&#39;uso (Fig. 1). </li></ol> 2. Approntamento delle apparecchiature Gel e separazione di frammenti di DNA <ol><li> Aggiungere colorante di caricamento dei campioni di DNA da separare (Fig. 2). Gel loading dye è tipicamente effettuata concentrazione 6X (0,25% blu di bromofenolo, cyanol xilene 0,25%, 30% glicerolo). Loading dye aiuta a tenere traccia di quanto il campione di DNA ha viaggiato, e permette anche il campione ad affondare nel gel. </li><li> Programma l&#39;alimentazione a tensione desiderata (1-5V/cm tra gli elettrodi). </li><li> Aggiungere tampone di corsa sufficiente a coprire la superficie del gel. È importante utilizzare lo stesso buffer esecuzione come quello utilizzato per preparare il gel. </li><li> Collegare i cavi della scatola gel alla rete elettrica. Accendere l&#39;alimentazione e verificare che sia casella di gel e l&#39;alimentazione stanno lavorando. </li><li> Togliere il coperchio. Lentamentee accuratamente caricare il campione di DNA (s) nel gel (Fig. 3). Un appropriato marcatore di dimensioni DNA dovrebbe sempre essere caricato con campioni sperimentali. </li><li> Sostituire il coperchio alla scatola gel. Il catodo (cavi neri) dovrebbe essere più vicino ai pozzi che l&#39;anodo (cavi rossi). Doppio controllare che gli elettrodi sono collegati alle apposite fessure nella sezione di alimentazione. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione. Eseguire il gel fino a quando il colorante è migrata ad una distanza adeguata. </li></ol> 3. Osservando frammenti di DNA separati <ol><li> Quando elettroforesi ha completato, spegnere l&#39;alimentazione e rimuovere il coperchio della scatola gel. </li><li> Rimuovere il gel dalla scatola gel. Scolare il tampone in eccesso dalla superficie del gel. Collocare il vassoio gel su carta assorbente per assorbire eventuali buffer di più in esecuzione. </li><li> Rimuovere il gel dal vassoio gel e esporre il gel a luce UV. Questo è più comunemente eseguita utilizzando un sistema di documentazione gel (Fig. 4). Bande di DNA dovrebbe mostrarecome arancio bande fluorescenti. Scatta una foto del gel (Fig. 5). </li><li> Smaltire il gel e tampone di corsa da regolamento dell&#39;istituzione. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Figura 5 rappresenta un tipico risultato dopo elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti di PCR. Dopo la separazione, i frammenti di DNA risultanti sono visibili come bande chiaramente definiti. Lo standard o DNA ladder devono essere separati in una misura che consente la determinazione utile delle dimensioni delle bande del campione. Nell&#39;esempio illustrato, frammenti di DNA di 765 bp, 880 bp e di 1022 bp sono separati su un gel di agarosio 1,5% con un 2-log scala DNA. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Figura 1. Un gel solidificato agarosio dopo la rimozione del pettine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Figura 2. Uno studente l&#39;aggiunta di colorante carico ai suoi campioni di DNA. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Figura 3. Uno studente caricamento del campione di DNA in un pozzo nel gel. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Figura 4. Un esempio di un sistema di documentazione gel. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;immagine di un posto elettroforesi su gel. EtBr è stato aggiunto al gel elettroforesi prima ad una concentrazione finale di 0,5 ug / ml, seguito da separazione a 100 V per 1 ora. Il gel è stato esposto a luce UV e la foto con un sistema di documentazione gel.

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Elettroforesi su gel di agarosio ha dimostrato di essere un modo efficiente ed efficace di separare acidi nucleici. Elevata forza di gel di agarosio permette per la movimentazione di gel basse percentuali per la separazione di frammenti di DNA di grandi dimensioni. Setacciatura molecolare viene determinata dalla dimensione di pori generati dai fasci di agarosio 7 nella matrice gel. In generale, maggiore è la concentrazione di agarosio, minore è la dimensione dei pori. Tradizionali gel di agarosio sono più efficaci alla separazione dei frammenti di DNA da 100 bp e 25 kb. Per separare frammenti di DNA più grandi di 25 kb, si dovranno usare elettroforesi su gel di impulsi di campo 6, che consiste nell&#39;applicazione di corrente alternata da due diverse direzioni. In questo modo i frammenti più grandi di DNA di dimensioni sono separati dalla velocità con cui si riorientare con i cambiamenti di direzione della corrente. Piccoli frammenti di DNA di 100 bp sono più efficacemente separati usando elettroforesi su gel di poliacrilammide. A differenza digel di agarosio, la matrice di gel di poliacrilammide è formato attraverso una reazione radicali liberi chimica condotta. Questi gel sono più sottili di una maggiore concentrazione, sono gestite in verticale ed avere una migliore risoluzione. Nella moderna sequenziamento del DNA elettroforesi capillare viene utilizzato, quale tubi capillari sono riempiti con una matrice di gel. L&#39;impiego di tubi capillari consente l&#39;applicazione di tensioni elevate, consentendo la separazione di frammenti di DNA (e la determinazione della sequenza di DNA) rapidamente. Agarose può essere modificato per creare fusione basso agarosio attraverso hydroxyethylation. Agarosio a bassa fusione viene generalmente utilizzata quando l&#39;isolamento di frammenti di DNA separati si desidera. Hydroxyethylation riduce la densità di impaccamento dei fasci di agarosio, riducendo le dimensioni dei pori 8. Ciò significa che un frammento di DNA della stessa dimensione avrà più di muoversi attraverso un gel di agarosio a bassa fusione rispetto a un normale gel di agarosio. Poiché i fasci associarsiattraverso interazioni non covalenti 9, è possibile rifondere un gel di agarosio dopo che è impostato. EtBr è il reagente più comune utilizzato per colorare DNA in gel di agarosio 10. Se esposto a luce UV, elettroni l&#39;anello aromatico della molecola etidio vengono attivati, che porta alla liberazione di energia (luce) come ritorno elettroni allo stato terra. EtBr funziona intercalando stessa nella molecola di DNA in maniera dipendente dalla concentrazione. Ciò consente una stima della quantità di DNA in una banda di DNA particolare sulla base della sua intensità. A causa della sua carica positiva, l&#39;uso del EtBr riduce il tasso di migrazione DNA del 15%. EtBr è un sospetto mutageno e cancerogeno, quindi si deve fare attenzione quando si maneggiano gel di agarosio che lo contengono. Inoltre, EtBr è considerato un rifiuto pericoloso e deve essere smaltito in modo appropriato. Macchie alternative per DNA in gel di agarosio sono SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet e blu metile. Di questi,Metile blu e Crystal Violet non richiedono l&#39;esposizione del gel di luce UV per la visualizzazione delle bande di DNA, riducendo così la probabilità di mutazione se il recupero del frammento di DNA dal gel è desiderata. Tuttavia, la loro sensibilità è inferiore a quello di EtBr. SYBR oro e SYBR green sono entrambi molto sensibili, coloranti uv dipendenti con minore tossicità rispetto EtBr, ma sono notevolmente più costosi. Inoltre, tutti i coloranti alternativi o non può essere o non funzionano bene quando aggiunto direttamente al gel, il gel pertanto dovrà essere tinto posto dopo elettroforesi. A causa dei costi, facilità d&#39;uso e sensibilità, EtBr rimane ancora la tintura di scelta per molti ricercatori. Tuttavia, in determinate situazioni, come ad esempio quando lo smaltimento dei rifiuti pericolosi è difficile o quando i giovani studenti eseguono un esperimento, un colorante meno tossico può essere preferito. Caricamento dei coloranti utilizzati in elettroforesi su gel risponde a tre obiettivi principali. In primo luogo si aggiunge la densità al campione, Permettendo così di sprofondare nel gel. In secondo luogo, i coloranti fornire colore e semplificare il processo di caricamento. Infine, i coloranti muovono a velocità standard attraverso il gel, consentendo la stima della distanza che frammenti di DNA sono migrati. Le dimensioni esatte di frammenti di DNA separati può essere determinata tracciando il logaritmo del peso molecolare per diverse bande di DNA standard contro la distanza percorsa da ciascuna banda. Lo standard DNA contiene una miscela di frammenti di DNA di predeterminate dimensioni che possono essere confrontati con i campioni di DNA sconosciuti. È importante notare che diverse forme di DNA muovono attraverso il gel a velocità diverse. DNA plasmidico superavvolto, a causa della sua conformazione compatta, si muove attraverso il gel più veloce, seguito da un frammento di DNA lineare della stessa dimensione, con la forma circolare aperta viaggiare più lenta. In conclusione, dopo l&#39;adozione di gel di agarosio in 1970 per la separazione del DNA, hadimostrato di essere una delle tecniche più utili e versatili ricerca scienze biologiche.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> I agarosio </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Acido borico </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Blu di bromofenolo </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Bromuro di etidio </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Cancerogeno-ha bisogno di essere smaltiti come rifiuti pericolosi </td></tr><tr><td> Acido acetico glaciale </td><td> Pescatore </td><td> BP2401-212 </td><td> Corrosivo </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xilemae cyanol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris di base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigator / FX gel documentazione del sistema </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Owl Easycast B1 mini sistema di elettroforesi su gel </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 alimentazione </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

Elettroforesi su gel di agarosio è il modo più efficace per separare frammenti di DNA di dimensioni variabili da 100 bp a 25 kb 1. Agarosio è isolato dalle alghe generi Gelidium e Gracilaria, e consiste di agarobiose ripetute (L-galattosio e D-) subunità 2. Durante la gelificazione, polimeri agarosio associano in modo non covalente e formare una rete di fasci cui pori formati determinare proprietà molecolari setacciatura di un gel. L&#39;uso di elettroforesi su gel di agarosio rivoluzionato la separazione del DNA. Prima dell&#39;adozione di gel di agarosio, il DNA è stato principalmente separati impiegando densità centrifugazione gradiente di saccarosio, che ha fornito solo un&#39;approssimazione di dimensioni. Per separare DNA usando elettroforesi su gel di agarosio, il DNA viene caricato in prefabbricati pozzetti nel gel e una corrente applicata. Lo scheletro di fosfato del DNA (e RNA) molecola è caricato negativamente, quindi quando posti in un campo elettrico, frammenti di DNA migrerà al positively carica anodo. Poiché il DNA ha una massa uniforme / carica rapporto, molecole di DNA vengono separati da una dimensione in un gel di agarosio in uno schema tale che la distanza percorsa è inversamente proporzionale al log del suo peso molecolare 3. Il modello importante per il movimento DNA attraverso un gel di agarosio è &quot;polarizzato reptation&quot;, per cui il bordo si muove in avanti e tira il resto della molecola lungo 4. La velocità di migrazione di una molecola di DNA attraverso un gel è determinata dalla seguente: 1) dimensione della molecola di DNA; 2) concentrazione di agarosio; 3) DNA conformazione 5; 4) tensione applicata, 5) presenza di bromuro di etidio, 6) Tipo di agarosio e 7) tampone di elettroforesi. Dopo la separazione, le molecole di DNA possono essere visualizzati sotto luce UV dopo colorazione con un colorante appropriato. Seguendo questo protocollo, gli studenti dovrebbero essere in grado di: <ol><li> Comprendere il meccanismo mediante il quale vengono separati frammenti di DNA all&#39;interno di una matrice gel </li><li> Capire come conformazione delMolecola di DNA a determinare la sua mobilità attraverso una matrice di gel </li><li> Identificare una soluzione di agarosio di concentrazione adeguato alle loro esigenze </li><li> Preparare un gel di agarosio per elettroforesi su campioni di DNA </li><li> Sistemare il dispositivo di elettroforesi su gel e alimentazione </li><li> Selezionare una tensione appropriata per la separazione di frammenti di DNA </li><li> Comprendere il meccanismo attraverso il quale permette di bromuro di etidio per la visualizzazione delle bande di DNA </li><li> Determinare le dimensioni dei frammenti di DNA separati </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Un protocollo di base per la separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio descritto.

Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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763.5K Views.  University of California Los Angeles. Un protocollo di base per la separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio descritto.

Video: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and others. However, the traditional SGE protocol is quite tedious, and the experiment takes a long time. Moreover, the chemical consumption in SGE experiments is very high. This work proposes a simple method for the separation of DNA fragments based on an SGE chip. The chip is made by an engraving machine. Two plastic sheets are used for the excitation and emission wavelengths of the optical signal. The fluorescence signal of the DNA bands is collected by smartphone. To validate this method, 50, 100, and 1,000 bp DNA ladders were separated. The results demonstrate that a DNA ladder smaller than 5,000 bp can be resolved within 12 min and with high resolution when using this method, indicating that it is an ideal substitute for the traditional SGE method.

Traditional slab gel electrophoresis (SGE) experiments require a complicated apparatus and high chemical consumption. This work presents a protocol that describes a low-cost method to separate DNA fragments within a short timeframe.

Monitoraggio in tempo reale della separazione del frammento di DNA tramite smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

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Biochimica

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

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Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

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Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

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DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of agarose, and within the gel, charge particles will migrate and separate based on size. The negatively charged phosphates of the DNA backbone cause DNA fragments to move toward the anode - a positively charged electrode.
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DNA Gel Electrophoresis: Concept, Procedure, and Applications

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Metodi di base in biologia cellulare e molecolare

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

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This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

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Elettroforesi capillare microfluidica per il dimensionamento dei frammenti dei prodotti PCR: una tecnica di separazione elettroforetica basata su microchip per separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni

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JoVE Encyclopedia of Experiments

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DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.
Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.
In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.
To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.
Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.
The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

Agarose Gel Electrophoresis for Separation of DNA Fragments

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Unità 2

Studio del DNA e dell'RNA

TERMINI E CONCETTI CHIAVE

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

To begin this procedure, add 250 microliters of a previously prepared protein sample solution to each slot of a 13-centimeter IPG strip holder. Place an 18-centimeter IPG strip, gel-side down, onto each protein sample solution, taking care to avoid bubbles. Then, add 3 to 4 milliliters of mineral oil to cover each IPG strip.
Next, assemble each IPG strip holder into an isoelectric focusing system, with the pointed end on the back plate, and the square end on the front plate. After rehydrating the IPG strips for 18 hours at room temperature, set the IEF parameters on the isoelectric focusing system with a total runtime of 7.5 hours and 36,875 volt hours.
After IEF, take out each IPG strip from the isoelectric focusing system, and remove the excess mineral oil with an insoluble paper towel. Then, wrap each strip in a sheet of plastic wrap, and store at -80 degrees Celsius.
To cast a 12% PAGE gel, add double-distilled water, 1.5 molar Tris-hydrochloric buffer, 40% acrylamide/bisacrylamide stock solution, 10% ammonium persulfate, and TEMED to a beaker. Mix the gel solution gently, taking care to avoid bubbles.
Gently pour the gel solution into a multi-casting chamber, up to the expected gel height of 19 centimeters. Immediately, add about 3 milliliters of double-distilled water to the multi-casting chamber to cover each resolving gel, and allow each gel to polymerize for about one hour.
This step is very important to prepare a high-quality SDS-PAGE gel. An equal volume water must be immediately added on the top of each gel.
Prepare two liters of electrophoresis buffer, then, add the buffer to an electrophoresis separation unit buffer tank.
After removing the focused IPG strips from the freezer, place them in a plastic vessel containing 1 milliliter of reducing equilibrium buffer and a trace of bromophenol blue, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking. After removing the reducing equilibrium buffer, add 4 milliliters of alkylation equilibrium buffer, and a trace of bromophenol blue to the IPG strips, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking.
During gel equilibrium, disassemble the multi-casting chamber, and remove the prepared resolving gel cassette. Rinse the gel cassette three times with double-distilled water, then, remove excess water from the gel cassette with an insoluble paper towel, and place it in a gel stander.
Following this, rinse the equilibrated IPG strips with electrophoresis buffer, and remove excess liquid on each IPG strip surface with an insoluble paper towel. Place an IPG strip onto the resolving SDS-PAGE gel, allowing the IPG strip&#39;s plastic side to contact the longer glass plate, with the pointed end to the left.
Now, quickly add 3 to 4 milliliters of hot 1% agarose and SDS electrophoresis buffer, to seal the IPG strip on the top of each SDS-PAGE gel, and place the top side of the IPG strip down on the top of the shorter glass plate, taking care to avoid bubbles.
These steps are very important to seal the IPG strip to an SDS-PAGE gel. The hot agarose solutions must be immediately added, and the IPG strip must be immediately placed into the top of the SDS gel.
After polymerization, insert the assembled gel cassette vertically between the plastic gaskets and a vertical electrophoresis system. Place the top of the gel with the IPG strip next to the cathode. Next, adjust the level of electrophoresis buffer to immerse the gel cassette by adding the appropriate volume of buffer to the electrophoresis system.
Connect and set the power supply in constant voltage mode, and run at 200 volts for about 370 minutes while monitoring the dye. After the run is complete, take the gel cassette out of the electrophoresis system and gently remove the gel from the gel cassette, taking care to avoid tearing the gel.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale: una tecnica di separazione per l'analisi delle proteine in una miscela proteica complessa basata sulla carica e sul peso molecolare

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Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

Prepare two separating gels as described in the text manuscript. Pour the gel between the glass plates using a 1-milliliter pipette, ensuring that the upper 2 centimeters are free of the mixture. Add 70% ethanol on top of the separating gel, creating an even interface between the two layers.
Once the separating gels have polymerized, prepare the stacking gels using instructions in the text manuscript. Then, remove the ethanol from the separating gels, and add the stacking gel solution. Carefully insert a comb with the desired number of pockets, without introducing air bubbles, and allow the gel to polymerize for 20 to 30 minutes.
Load 4 microliters of each sample, as well as the protein ladder, into separate wells. Then, run the gel in Tris-Glycine running buffer at 144 volts for 45 minutes at room temperature. Use pre-warmed Fairbanks solution A to stain the gels on a rocker for 30 minutes, and pre-warmed Fairbanks solution D to decolor the gels on a rocker until the desired background is achieved.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare