Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

Questo protocollo è un'alternativa facile ed economica all'uso del bromuro di etidio per il rilevamento del DNA durante l'elettroforesi. Rimuovendo il bromuro di etidio, la luce UV o la luce blu possono essere utilizzate per il rilevamento. La luce blu non è dannosa per il DNA, il che migliora le possibilità di successo per gli esperimenti a valle.

È davvero facile provarlo. Devi solo sostituire il bromuro di etidio nei tuoi gel con l'arancia tiazolo. Per iniziare, preparare mini-gel all'1% mescolando circa 0,7 grammi di agarosio in 70 millilitri di tamponi tris-acetato-EDTA o tris-borato.

Quindi, sciogliere l'arancione tiazolo in DMSO per creare una soluzione stock 10.000X. Sebbene non particolarmente sensibile alla luce, conservare l'arancione tiazolo al buio quando non è in uso. Per la conservazione a lungo termine, fare aliquote della miscela tiazolo arancione-DMSO e congelarle.

Quindi, aggiungere l'arancia tiazolo a una concentrazione finale di 1,3 microgrammi per millilitro e microonde la miscela di tampone di agarosio e arancia tiazolo per sciogliere l'agarosio per circa 60 secondi. Versare la miscela di agarosio in un apparecchio di fusione del gel contenente un pettine appropriato e lasciare che la soluzione di agarosio si solidifichiamo in un gel. Per caricare il gel, posizionare prima il gel nell'apparato di elettroforesi, se non già presente.

Quindi aggiungere il buffer di corsa TAE o TBE per coprire la superficie del gel. Successivamente, utilizzando un colorante di carico, caricare 10 microlitri di un campione di DNA. Includere una scala di dimensionamento del DNA come riferimento.

Fissare il coperchio e gli elettrodi ed eseguire il mini-gel a 100 volt fino a quando la tintura di carico viaggia di circa quattro-sette centimetri per un mini-gel. Se l'arancia tiazolo non è stata applicata prima della fusione del gel, macchiare il gel immergendolo nel tampone contenente arancia tiazolo con agitazione delicata per circa 20 minuti o fino a quando le bande non sono completamente rilevate. Per visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore UV, rimuovere il gel dall'apparato di elettroforesi e posizionarlo sul transilluminatore UV.

Per visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore a luce blu o una torcia elettrica, posizionare il gel sul transilluminatore a luce blu o dirigere la torcia a LED blu sul gel dall'alto o dal basso. Utilizzare un filtro ad emissione ambra per filtrare la luce blu, consentendo la visualizzazione della fluorescenza dai complessi arancioni tiazole del DNA e per proteggere i coloranti. Per un'ulteriore digestione o legatura, tagliare le bande di DNA desiderate dal gel e procedere all'estrazione del DNA utilizzando un kit o un protocollo prontamente disponibile.

Selezionare le impostazioni di eccitazione ed emissione appropriate nell'apparato gel-imaging. In assenza di un sistema di imaging con filtri appropriati, posizionare un filtro ambra tra la fotocamera e la sorgente di eccitazione gel blu-luce. I limiti di rilevamento sono simili tra bromuro di etidio, arancione tiazolo e un comune colorante di DNA commerciale rilevabile dalla luce blu, con il limite di rilevamento per tutti e tre i coloranti da uno a due nanogrammi per corsia in un mini-gel.

Il gel di agarosio tinto arancione tiazolo di un digest di restrizione è rilevabile quando è eccitato con un UV o un transilluminatore a luce blu o con una torcia a luce blu. Mentre l'arancione tiazolo sembra essere meno pericoloso del bromuro di etidio, i dispositivi di protezione individuale standard come guanti e occhiali dovrebbero ancora essere indossati.