Questo lavoro è stato supportato da NHI R01 concessione GM59690 assegnato a KLV.

1. Caratterizzazione e considerazioni <ol><li> Formazione di biofilm è generalmente influenzata dalla densità delle cellule e il tasso di crescita. Pertanto, è necessario determinare il tasso di crescita (aumento della densità ottica (OD) nel tempo) e resa (numero di cellule finale) del ceppo (s) di interesse eseguendo semplice curva di crescita delle cellule e saggi di placcatura. Difetti di crescita, o una mancanza di correlazione tra OD e il numero di cellulare, deve essere preso in considerazione quando si interpretano i risultati di esperimenti di macchie. </li><li> Includere gli opportuni controlli positivi e negativi sulla stessa lastra al momento di valutare la formazione di rughe colonia, di importanza minore piastra-to-plate variazione può influenzare lo sviluppo di biofilm. </li><li> Identificare le condizioni migliori per avvistare, cioè quelli che rivelano le differenze più distinte tra il controllo e il mutante (s) di interesse. Coltivare ceppi in coltura liquida in varie condizioni, quali mezzi diversi o temperature, e per diverso stadios di crescita (fase esponenziale e stazionaria) prima di spotting. Spot 10 pl di cultura a densità cellulari vari sui mezzi di comunicazione appropriati, e incubare alla temperatura desiderata morfologie di colonia fino a diventare evidente. </li><li> Il punto finale saggio comporta la valutazione della formazione della colonia rugosa in un punto predeterminato tempo dopo aver individuato (cioè, 48 ore). Questa valutazione è utile per i ceppi che presentano (o si propone di esporre) gravi difetti nella formazione del biofilm. </li><li> Il test valuta corso del tempo la formazione di rughe colonia per un periodo di tempo (cioè, ogni ora) post-spotting. Questo saggio permette una valutazione semiquantitativa di formazione di biofilm, consentendo la determinazione di inizio della formazione di colonie rugose e sviluppo pattern su un periodo di tempo. La durata dell&#39;esperimento e numero di punti di raccolta per un corso di tempo è determinata in esperimenti preliminari. </li><li> Per tenere facilmente traccia del tempo post-spotting, fissato aimer a contare. </li></ol> 2. La valutazione microscopica di Morfologia Colony spiegazzato in V. fischeri <ol><li> Inoculare V. cellule fischeri in 5 ml di LB-Salt (LBS) media 13 (1% [w / v] triptone, 0,5% [w / v] di estratto di lievito, 2% [w / v] di cloruro di sodio, 50 mM Tris-HCl [ pH 7.5]) che contiene gli antibiotici necessari e incubare, con agitazione, per tutta la notte a 28 ° C. Al mattino, sottocolture le cellule con una diluizione 1:100 in 5 ml di terreno fresco LBS e incubare alle stesse condizioni finché le cellule hanno raggiunto la desiderata OD 600 (ad esempio, OD 600 = 0,2 o 0,5). </li><li> Pipettare 1 ml di coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifuga in un insieme microcentrifuga alla massima velocità per un minuto. Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Lavare le cellule per rimuovere eventuali residui e componenti extracellulari risospendendo il pellet in 1 ml di acqua di mare sterili 70 sulla artificiali (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) e ripetendo la centrifugazione. Risospendere il pellet lavato in 1 ml del 70% ASW. </li><li> Assicurarsi che ogni campione contiene lo stesso numero di cellule, come stimato dalla DO a 600 nm. Apportare le modifiche necessarie diluendo i campioni più concentrati con l&#39;aggiunta del 70% ASW. In esperimenti preliminari, culture loco a vari valori iniziali di DO per determinare una ottimale OD di partenza per un dato insieme di ceppi o condizioni. I migliori risultati sono ottenuti per V. fischeri, quando i punti sono generati da colture con un diametro esterno di circa 0,2. </li><li> Spot 10 microlitri di cellule lavate LBS su piastre contenenti gli antibiotici necessari. Quando si macchia di una cultura su un piatto, assicurarsi di costante la pipetta (con il dito) appena sopra la superficie agar. Spot verticalmente, non ad angolo, ed espellere il liquido lentamente per la distribuzione uniforme della macchia. In genere ogni ceppo è macchiato una volta per piastra (fino a 6 punti per piastra), with piastre multiple (2-3) per esperimento. </li><li> Per assicurare che la cultura maculato rimane uniformemente distribuito, consentono il punto di asciugare prima di spostare la piastra alla incubatrice. Capovolgere le piastre e incubare a 28 ° C. </li><li> Monitorare la morfologia del luogo dell&#39;inizio crescente oraria a 12-15 ore dopo l&#39;inoculazione. Usiamo un ambito dissezione (Zeiss STEMI 2000-C) con un attacco della fotocamera (Progres C10 PLUS) e la CapturePro Progres e programmi software ImageJ per osservare e documentare la morfologia delle colonie e per valutare l&#39;inizio e la progressione della formazione di colonie rugosa. </li><li> Per la configurazione specifiche di cui al punto 2.5, i punti vengono illuminate dal basso attraverso una fase di vetro trasparente con una sorgente di luce CL 1500 CE fredda, mentre le immagini vengono catturate da sopra. Questa configurazione è ottimale per lo sviluppo delle colonie di imaging rugosa perché V. colonie fischeri (macchie) sono traslucidi. </li><li> In assenza di attrezzature specifiche di cui vep 2,5, monitor colonia morfologia rugosa con qualsiasi microscopio da dissezione, che consente la visualizzazione completa delle colonie e ha una sorgente di luce regolabile e, idealmente, una fotocamera collegata. Se necessario, una fotocamera digitale può essere utilizzato anche in assenza di una fotocamera collegata, ma questo non è ottimale. </li><li> Per visualizzare meglio sviluppo rugosa colonia, è necessario regolare sia l&#39;intensità luminosa e l&#39;angolo di riflessione sotto le colonie batteriche tali che la morfologia tridimensionale delle biofilm sviluppo possono distinguere. Determinare le ottimali condizioni di illuminazione che forniscono il più forte contrasto tra la colonia individuato e lo sfondo agar circostante, in modo tale che l&#39;architettura (rughe) della colonia è chiaramente distinguibile. </li><li> In alcuni casi, il colore della colonia maculato devono essere prese in considerazione, come alterazioni di colore colonia può verificarsi durante la formazione di biofilm. Regolare l&#39;intensità e l&#39;angolo della sorgente luminosa per rivelarequesti cambiamenti sottili nella colorazione. Una volta che le impostazioni appropriate vengono raggiunti, a mantenere per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Nota quanto tempo trascorre dal momento dell&#39;inoculazione al momento in cui la formazione di colonie rugosa avvia per ogni ceppo o condizione. Definire l&#39;inizio della formazione della colonia rugosa come il punto temporale in cui la formazione di patterning e strutture 3D (cioè, striature formando sul bordo esterno o &#39;increspature&#39; che si verificano nel centro) è prima apparente. Le cellule mutanti possono mostrare ridotto o aumentato il tempo di inizio di formazione di colonie rugosa (ad esempio, Fig. 2). </li><li> Documentare l&#39;avvio e lo sviluppo della formazione di colonie spiegazzata catturando appropriate immagini digitali. È importante utilizzare lo stesso ingrandimento quando la raccolta di immagini durante l&#39;esperimento. Passare la vista dal oculare del microscopio allo schermo del computer utilizzando la leva posta sul retro della macchina. Quando si passa tra ocularee la visualizzazione sullo schermo del computer, regolare la visualizzazione e mettere a fuoco di conseguenza. </li><li> Prima di imaging culture macchiati, il coperchio della piastra di Petri è tipicamente rimosso per fornire l&#39;immagine più chiara. Tuttavia, questo passaggio è facoltativo, in quanto le culture maculati possono essere esposte attraverso il coperchio con la configurazione descritta nei passi 2.5 e 2.6. </li><li> Ad ogni punto di tempo dopo l&#39;inizio della formazione di colonie rugosa, prendere nota del modello di sviluppo della colonia rugosa. L&#39;architettura può svilupparsi dall&#39;interno verso l&#39;esterno, o fuori pollici Questa valutazione fornisce un meccanismo per distinguere i biofilm formati da differenti ceppi o in condizioni diverse. </li><li> Misurare il diametro della colonia sviluppo in ogni punto. Questo può essere fatto manualmente, o digitale utilizzando un programma software associato. Se fatto in digitale, utilizzare il software Progres CapturePro programma e prima calibrare la barra di scala per l&#39;ingrandimento specifico utilizzato nell&#39;esperimento. Includere la barra della scala in ogni immagine catturata. </li><li> Per calcolare il diametro colonia utilizzando il programma software ImageJ, aprire ogni file di immagine. Standardizzare la barra della scala come segue: Selezionare l&#39;opzione &quot;linea retta&quot; dalla barra degli strumenti. Sovrapporre il barra della scala incorporato con una linea retta della stessa lunghezza e larghezza. Selezionare &quot;Scala Set&quot; dalla scheda &quot;Analizza&quot;. Nella &quot;nota distanza&quot; box, inserire la lunghezza corrispondente (come determinato dalla barra scala originale, cioè, 2 mm) e selezionare &quot;OK&quot;. </li><li> Utilizzare la &quot;linea retta&quot; opzione per inserire una linea orizzontale attraverso il posto. Sotto la scheda Analizza, selezionare &quot;Measure&quot;. Nella nuova finestra risultati, la lunghezza calcolata sarà fornita. Ottenere una seconda misura inserendo una linea perpendicolare attraverso il punto. Ricalcolare il diametro. Registrare la media delle due misure. Grafico del diametro medio per ogni posto ad ogni momento utilizzando un programma software come Excel. </li><li> La fine dell&#39;esperimento si verifica sia in un punto temporale specificato o quando vi è alcuna altrasviluppo del biofilm. Una volta che il fine è raggiunto, consolidare le immagini in una figura (s) per visualizzare il modello di sviluppo nel tempo utilizzando un programma di software come Powerpoint. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi In questi esperimenti abbiamo usato V. fischeri come organismo modello per studiare la formazione di biofilm valutando lo sviluppo di colonie rugose su una superficie solida agar. Biofilm producono ceppi di V. formano colonie fischeri con una vasta architettura 3D all&#39;interno di 40 h (Fig. 1) 8,9,14. Quando esaminata per un corso di tempo, risulta evidente che la formazione di colonie rugosa dal ceppo di controllo inizia già circa 12 h post-inoculazione (a seconda delle condizioni specifiche) (Fig. 2) 9. Al contrario, la formazione di biofilm da un mutante rappresentante è ritardato di circa 4 h, non avviare fino a circa 16 h post-inoculazione 9. Ripetts di questi esperimenti suggerito che la temporizzazione era relativamente costante, rendendo questa valutazione semi-quantitativa 9. Un secondo semi-quantitativa misura della formazione del biofilm fa uso della variazione di diametro della colonia sviluppo nel tempo. Come mostrato in Fig. 3A, un rappresentante biofilm-competente ceppo forma colonie che aumento di complessità e diametro rispetto a un ceppo rappresentativo che non forma biofilm. Misurazioni accurate nel tempo dei diametri delle colonie formate da questi due ceppi ha rivelato che la dimensione dei biofilm-competenti colonie aumentata ad un tasso maggiore dei biofilm-negativi colonie, e nel punto di tempo finale di due differiva di circa il 2 - piega (Fig. 3B). Pertanto, anche se le immagini di un tempo rappresentativo tardiva o morfologia &quot;end-point&quot; colonia frequentemente sono riportati nella letteratura, supplementari semi-quantitativi dati possono essere raccolti che permetterà una migliore comprensione del difetto biofilm.<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Figura 1. End-point saggio. Questa figura è un esempio di un end-point dosaggio con rappresentativi non-biofilm formanti (sinistra) e biofilm-formatura (destra) ceppi di V. fischeri. Queste immagini sono state raccolte in 40 h post-spotting. Queste immagini sono state generate con wild-type V. fischeri contenente un controllo vettoriale (non-biofilm di formazione) o una parte PSR sovraespressione plasmide (biofilm di formazione) e sono dei set di dati raccolti per Morris et al., 2011. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Figura 2. Time-corso test. Il pannello superiore contiene immagini rappresentative della formazione di biofilm da un biofilm-competente ceppo di controllo di V. fischeri su un percorso di tempo selezionato. Avvio della formazione di biofilm è evidente a 12 h. Il pannello inferiore contiene rappresentante imaghi di un ceppo mutante di V. fischeri che presenta un ritardo (4 h) l&#39;inizio della formazione della colonia rugosa nel tempo, con formazione di biofilm avvio a 16 h post-inoculazione. Si noti che in 40 ore i ceppi simile nell&#39;intensità ed il modello della formazione di biofilm, mentre le differenze sottili tra questi ceppi sono osservati solo in corrispondenza dei punti temporali precedenti. Queste immagini sono state generate con sovraespressione PSR wild-type e mutante sypE V. cellule fischeri e facevano parte del set di dati raccolti per Morris et al., 2011. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Figura 3. Diametro Colony come analisi semiquantitativa di formazione di biofilm. (A) Naturalmente il tempo della formazione di biofilm da un rappresentante biofilm di formazione (pannello superiore) e non-biofilm di formazione (pannello inferiore) ceppi di V. fischeri. Si noti che il biofilm-formatura ceppo mostra un aumento maggioredi diametro nel corso del tempo rispetto al ceppo non-biofilm formatura. Queste immagini sono state generate con wild-type V. fischeri contenente una parte PSR sovraespressione plasmide (biofilm di formazione) o un controllo vettoriale (non-biofilm di formazione) e sono dei set di dati raccolti per Morris et al., 2011. (B) Una rappresentazione grafica l&#39;aumento del diametro delle colonie nel corso del tempo dai due ceppi nel pannello A. Questi dati sono stati generati utilizzando il software ImageJ ed Excel, come indicato nel protocollo.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In questo lavoro, si descrive un metodo semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm utilizzando V. fischeri come organismo modello. In particolare, ci avvaliamo di un microscopio da dissezione con attacco telecamera per monitorare la formazione di biofilm e sviluppo, formazione di colonie rugosa nel corso del tempo su una superficie solida agar. In questo protocollo, si delineano due tipi specifici di metodi usiamo comunemente per valutare la formazione di rughe colonia. Il primo è il test end-point, che ci permette di osservare il finale, architettura complessiva 3D, modellazione, e il diametro di una cultura macchiato in un punto di scelta &quot;finale&quot; del tempo. Questo approccio è particolarmente utile per valutare i ceppi mutanti o condizioni che portano a difetti drammatici nella formazione di biofilm. Tuttavia, questo approccio non distingue tra più sottili differenze che si verificano ad intervalli di tempo prima della scelta end-point. Per monitorare più da vicino la formazione di rughe colonia, si usa un saggio di sviluppo nel tempo, che ci permette di identificare l&#39;inizio di wrinkled formazione di colonie e guardare il suo sviluppo nel tempo. Come risultato di questo approccio, più sottili differenze nei tempi di formazione della colonia rugosa, architettura 3D, e patterning può essere identificato. Abbiamo usato questo test andamento nel tempo di generare due semi-quantitative saggi di formazione di biofilm. In primo luogo, il tempo in cui un ceppo inizia a svilupparsi architettura 3D può essere paragonato a quello di ceppi di controllo. Abbiamo trovato che il ritardo nella formazione di biofilm di un mutante particolare nelle stesse condizioni è abbastanza consistente 9. Ad esempio, nei dati mostrati nella fig. 2, il mutante costantemente esposto su un ritardo 4 h in avviare la formazione di biofilm. Un secondo semi-quantitativa misura della formazione del biofilm è il cambiamento delle dimensioni del diametro della colonia rugosa (spot). Abbiamo trovato che il diametro delle colonie rugose progressivamente differisce da quella di non-biofilm colonie, raggiungendo circa 2 volte differenza nel punto di fine (Fig. 3 </strong&gt;) (Morris e Visick, dati non pubblicati). Fino ad oggi, non abbiamo osservato un fenotipo senza l&#39;altra (cioè la formazione di biofilm senza un aumento del diametro delle colonie) (dati non pubblicati), anche se rimane possibile alcuni mutanti si comporterà in modo diverso. Infatti, è stato riportato per V. cholerae che qualche risultato rugosa colonie in un sostanziale aumento del diametro delle colonie, mentre altri no 15. Tuttavia, valutando la variazione di diametro nel corso del tempo potrebbe aiutare nella caratterizzazione di mutanti biofilm potenziali e / o fornire un&#39;ulteriore misura quantitativa di mutanti con ritardi nello sviluppo. Dei due misure della formazione di biofilm (tempo e diametro), determinando l&#39;inizio della formazione della colonia rugosa è più sensibile, ma anche più personale, di determinare il diametro dello spot. Anche così, entrambe le misure forniscono una valutazione semiquantitativa di un fenotipo che è estremamente utile per i ricercatori biofilm ma non facilmente suscettibili di quantification. Quando si esegue maculati test in coltura, è importante considerare le condizioni ambientali in cui vengono coltivati ​​i ceppi maculati. Formazione di colonie Rugosa è spesso influenzata da varie condizioni ambientali, compresa la disponibilità di nutrienti, temperatura e umidità. Per ridurre la variabilità tra esperimenti, è utile standardizzare queste condizioni il più possibile (cioè standardizzazione delle piastre di agar a un determinato volume e coltivando i ceppi maculati a temperatura controllata). Per un ulteriore controllo per la variabilità tra esperimenti avvistamento, è importante includere i appropriati ceppi di controllo all&#39;interno di ciascuna serie di esperimenti. Infine, l&#39;interpretazione dei dati ottenuti in questi test, è necessario eseguire una qualsiasi esperimento più volte (3 +), specialmente nel valutare sottili differenze di formazione di colonie rugosa (ad esempio, un ritardo nella formazione di biofilm o differenze patterning). Alcune limitazioni di questo protocollo sono: 1) deterING se le cellule hanno un difetto nella crescita può essere difficile: la crescita delle cellule in coltura liquida possono non corrispondere accuratamente i tassi di crescita su terreni solidi, e una determinazione accurata di crescita del biofilm che formano le cellule, che possono stare insieme, potrebbe non essere possibile; 2) ceppi con difetti di crescita sarà problematico da analizzare; 3) può non essere possibile distinguere differenze di diametro tra ceppi con fenotipi biofilm sottili, 4) per ceppi che non crescono in un anello concentrico può non essere possibile misurare accuratamente cambiamenti di diametro, 5) mentre patterning possono essere osservati durante la formazione di biofilm, non vi è alcun modo per quantificare il modellamento del biofilm risultante, e 6) non c&#39;è modo per misurare la Z-dimensione del biofilm con questa configurazione sperimentale . Nonostante questi limiti, questo protocollo prevede tuttavia un mezzo per ottenere dati numerici per aiutare a valutare la formazione di rughe colonia. In questo protocollo, ci avvaliamo di un imaging specifichesistema (ad esempio, un microscopio Zeiss dissezione e Progres CapturePro software di imaging), di osservare e valutare la formazione di rughe colonia. Il sistema di imaging descritto qui è potente: la capacità di rilevare l&#39;inizio della formazione della colonia rugosa, e quindi valutare lo sviluppo con un approccio corso di tempo, è notevolmente aumentata con l&#39;uso di un microscopio da dissezione. Tuttavia, se questa tecnologia non è disponibile, il protocollo può essere adattato per l&#39;uso con altre apparecchiature, tra cui una semplice macchina fotografica digitale con un obiettivo zoom. Mentre questo protocollo si concentra sulla valutazione di sviluppo colonia rugosa, potrebbe anche essere modificato per valutare la formazione di pellicola, una forma di biofilm che si sviluppa quando le cellule crescono staticamente in coltura liquida. Questo protocollo può rivelarsi utile anche per valutare altri indicatori della formazione di biofilm, tra cui l&#39;incorporazione di coloranti specifici nelle colonie macchiati durante lo sviluppo di biofilm. Questi includono, ma non sono limitati a, coloranti come Congo Red e calcofluo che possono legarsi alla cellulosa, un componente comune di biofilm batterici 16. Inoltre, questo protocollo, anche se sviluppato per l&#39;uso con V. fischeri, non è limitata a questo organismo, ma può essere generalizzato per studiare la formazione di biofilm in numerose differenti organismi, come Bacillus subtilis 4, 5 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus 6, 7 e Pseudomonas aeruginosa, che mostra tutti formazione di colonie rugosa. Infine, può anche essere adattato per studiare morfologie di colonia altri che hanno un modello di sviluppo, come, potenzialmente, il patterning che si verifica durante la crescita del Myxococcus xanthus 17 e sviluppo struttura aerea in Pseudomonas aeruginosa 18. Questo protocollo è quindi di uso generale per i ricercatori di microbiologia e di biofilm.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome delle apparecchiature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C dissezione Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Ottenuta tramite microscopio Lukas) </td></tr><tr><td> Progres C10 PLUS </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Attacco per fotocamera (ottenuta tramite microscopio Lukas) </td></tr><tr><td> CL 1500 CE sorgente a luce fredda </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Ottenuta tramite microscopio Lukas) </td></tr><tr><td> Progres CapturePro </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> Il software libero con la telecamera registrata </td><td> Programma per computer per l&#39;acquisizione di immagini </td></tr><tr><td> Immagine J </td><td> NIH </td><td> Software gratuito da:ij / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Programma informatico per la misurazione del diametro </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilm, o superficie collegati comunità di cellule incapsulate in una matrice extracellulare, rappresentano uno stile di vita comune per molti batteri. All&#39;interno di un biofilm, le cellule batteriche spesso mostrano alterata fisiologia, anche una maggiore resistenza agli antibiotici e altri stress ambientali 1. Inoltre, i biofilm possono svolgere ruoli importanti in interazioni ospite-microbo. I biofilm si sviluppano quando i batteri passaggio da individuo, le cellule planctoniche a formare complessi e multi-cellulari comunità 2. In laboratorio, biofilm sono studiate valutando lo sviluppo di biofilm fenotipi specifici. Un fenotipo biofilm comune comporta la formazione di colonie batteriche o rugose rugose su agar solido media 3. Formazione di colonie Rugosa fornisce uno strumento particolarmente semplice e utile per identificare e caratterizzare i ceppi batterici che presentano fenotipi alterati biofilm, e per studiare le condizioni ambientali che la formazione di biofilm impatto. Wrila formazione di colonie nkled serve come un indicatore della formazione di biofilm in una varietà di batteri, inclusi sia batteri Gram-positivi, come Bacillus subtilis 4, e batteri Gram-negativi, come Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, e Vibrio fischeri 8. Il batterio marino V. fischeri è diventato un modello per la formazione del biofilm a causa del ruolo cruciale dei biofilm durante la colonizzazione host: biofilm prodotto da V. fischeri promuovere la sua colonizzazione delle Hawaii Bobtail calamari Euprymna 8-10 scolopes. È importante sottolineare che, fenotipi biofilm osservati in vitro correlano con la capacità di V. fischeri cellule di colonizzare efficacemente animali ospiti: ceppi di handicap per la formazione del biofilm in vitro in possesso di un difetto colonizzazione 9,11, mentre i ceppi esibendo un aumentofenotipi biofilm sono stati migliorati per la colonizzazione 8,12. V. fischeri fornisce quindi un sistema semplice modello per valutare i meccanismi con cui i batteri regolano la formazione di biofilm e come biofilm ospite colonizzazione impatto. In questo rapporto, descriviamo un metodo semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm utilizzando V. fischeri come sistema modello. Questo metodo comporta l&#39;attenta individuazione di colture batteriche a concentrazioni e volumi definiti su un supporto di agar solido, una cultura maculato è sinonimo di una singola colonia batterica. Questa tecnica di &#39;cultura spotted&#39; può essere utilizzato per confrontare i fenotipi biofilm lordi a singoli, specifici punti temporali (end-point saggi), o per identificare e caratterizzare i fenotipi biofilm sottili attraverso il tempo portate saggi di sviluppo biofilm e misurazioni del diametro colonia , che è influenzata dalla formazione di biofilm. Così, questa tecnica fornisce una analisi semiquantitativa di formazione di biofilm, permitting valutazione dei tempi e patterning di sviluppo della colonia rugosa e le dimensioni relative della struttura in via di sviluppo, caratteristiche che si estendono al di là della semplice morfologia complessiva.

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A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Noi forniamo un semplice, semi-quantitativa metodo per studiare la formazione di biofilm<em&gt; In vitro</em&gt;. Questo metodo sfrutta il STEMI Zeiss 2000-C dissezione Microscopio (con l&#39;attacco della fotocamera) per monitorare sia i tempi e il modello di formazione di biofilm, come dimostrato dallo sviluppo di colonie rugose.

Un approccio semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm mediante lo sviluppo spiegazzato Colony

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

23.2K Views.  Loyola University Medical Center. Noi forniamo un semplice, semi-quantitativa metodo per studiare la formazione di biofilm In vitro. Questo metodo sfrutta il STEMI Zeiss 2000-C dissezione Microscopio (con l'attacco della fotocamera) per monitorare sia i tempi e il modello di formazione di biofilm, come dimostrato dallo sviluppo di colonie rugose.

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l&#39;esplorazione del Biblioteche composto naturale

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

Quantificazione degli effetti degli antimicrobici sull'architettura del biofilm in vitro utilizzando il software COMSTAT

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Un approccio semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm mediante lo sviluppo spiegazzato Colony

Riepilogo

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