Questo lavoro è stato supportato da NHI R01 concessione GM59690 assegnato a KLV.

1. Caratterizzazione e considerazioni <ol><li> Formazione di biofilm è generalmente influenzata dalla densità delle cellule e il tasso di crescita. Pertanto, è necessario determinare il tasso di crescita (aumento della densità ottica (OD) nel tempo) e resa (numero di cellule finale) del ceppo (s) di interesse eseguendo semplice curva di crescita delle cellule e saggi di placcatura. Difetti di crescita, o una mancanza di correlazione tra OD e il numero di cellulare, deve essere preso in considerazione quando si interpretano i risultati di esperimenti di macchie. </li><li> Includere gli opportuni controlli positivi e negativi sulla stessa lastra al momento di valutare la formazione di rughe colonia, di importanza minore piastra-to-plate variazione può influenzare lo sviluppo di biofilm. </li><li> Identificare le condizioni migliori per avvistare, cioè quelli che rivelano le differenze più distinte tra il controllo e il mutante (s) di interesse. Coltivare ceppi in coltura liquida in varie condizioni, quali mezzi diversi o temperature, e per diverso stadios di crescita (fase esponenziale e stazionaria) prima di spotting. Spot 10 pl di cultura a densità cellulari vari sui mezzi di comunicazione appropriati, e incubare alla temperatura desiderata morfologie di colonia fino a diventare evidente. </li><li> Il punto finale saggio comporta la valutazione della formazione della colonia rugosa in un punto predeterminato tempo dopo aver individuato (cioè, 48 ore). Questa valutazione è utile per i ceppi che presentano (o si propone di esporre) gravi difetti nella formazione del biofilm. </li><li> Il test valuta corso del tempo la formazione di rughe colonia per un periodo di tempo (cioè, ogni ora) post-spotting. Questo saggio permette una valutazione semiquantitativa di formazione di biofilm, consentendo la determinazione di inizio della formazione di colonie rugose e sviluppo pattern su un periodo di tempo. La durata dell&#39;esperimento e numero di punti di raccolta per un corso di tempo è determinata in esperimenti preliminari. </li><li> Per tenere facilmente traccia del tempo post-spotting, fissato aimer a contare. </li></ol> 2. La valutazione microscopica di Morfologia Colony spiegazzato in V. fischeri <ol><li> Inoculare V. cellule fischeri in 5 ml di LB-Salt (LBS) media 13 (1% [w / v] triptone, 0,5% [w / v] di estratto di lievito, 2% [w / v] di cloruro di sodio, 50 mM Tris-HCl [ pH 7.5]) che contiene gli antibiotici necessari e incubare, con agitazione, per tutta la notte a 28 ° C. Al mattino, sottocolture le cellule con una diluizione 1:100 in 5 ml di terreno fresco LBS e incubare alle stesse condizioni finché le cellule hanno raggiunto la desiderata OD 600 (ad esempio, OD 600 = 0,2 o 0,5). </li><li> Pipettare 1 ml di coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifuga in un insieme microcentrifuga alla massima velocità per un minuto. Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Lavare le cellule per rimuovere eventuali residui e componenti extracellulari risospendendo il pellet in 1 ml di acqua di mare sterili 70 sulla artificiali (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) e ripetendo la centrifugazione. Risospendere il pellet lavato in 1 ml del 70% ASW. </li><li> Assicurarsi che ogni campione contiene lo stesso numero di cellule, come stimato dalla DO a 600 nm. Apportare le modifiche necessarie diluendo i campioni più concentrati con l&#39;aggiunta del 70% ASW. In esperimenti preliminari, culture loco a vari valori iniziali di DO per determinare una ottimale OD di partenza per un dato insieme di ceppi o condizioni. I migliori risultati sono ottenuti per V. fischeri, quando i punti sono generati da colture con un diametro esterno di circa 0,2. </li><li> Spot 10 microlitri di cellule lavate LBS su piastre contenenti gli antibiotici necessari. Quando si macchia di una cultura su un piatto, assicurarsi di costante la pipetta (con il dito) appena sopra la superficie agar. Spot verticalmente, non ad angolo, ed espellere il liquido lentamente per la distribuzione uniforme della macchia. In genere ogni ceppo è macchiato una volta per piastra (fino a 6 punti per piastra), with piastre multiple (2-3) per esperimento. </li><li> Per assicurare che la cultura maculato rimane uniformemente distribuito, consentono il punto di asciugare prima di spostare la piastra alla incubatrice. Capovolgere le piastre e incubare a 28 ° C. </li><li> Monitorare la morfologia del luogo dell&#39;inizio crescente oraria a 12-15 ore dopo l&#39;inoculazione. Usiamo un ambito dissezione (Zeiss STEMI 2000-C) con un attacco della fotocamera (Progres C10 PLUS) e la CapturePro Progres e programmi software ImageJ per osservare e documentare la morfologia delle colonie e per valutare l&#39;inizio e la progressione della formazione di colonie rugosa. </li><li> Per la configurazione specifiche di cui al punto 2.5, i punti vengono illuminate dal basso attraverso una fase di vetro trasparente con una sorgente di luce CL 1500 CE fredda, mentre le immagini vengono catturate da sopra. Questa configurazione è ottimale per lo sviluppo delle colonie di imaging rugosa perché V. colonie fischeri (macchie) sono traslucidi. </li><li> In assenza di attrezzature specifiche di cui vep 2,5, monitor colonia morfologia rugosa con qualsiasi microscopio da dissezione, che consente la visualizzazione completa delle colonie e ha una sorgente di luce regolabile e, idealmente, una fotocamera collegata. Se necessario, una fotocamera digitale può essere utilizzato anche in assenza di una fotocamera collegata, ma questo non è ottimale. </li><li> Per visualizzare meglio sviluppo rugosa colonia, è necessario regolare sia l&#39;intensità luminosa e l&#39;angolo di riflessione sotto le colonie batteriche tali che la morfologia tridimensionale delle biofilm sviluppo possono distinguere. Determinare le ottimali condizioni di illuminazione che forniscono il più forte contrasto tra la colonia individuato e lo sfondo agar circostante, in modo tale che l&#39;architettura (rughe) della colonia è chiaramente distinguibile. </li><li> In alcuni casi, il colore della colonia maculato devono essere prese in considerazione, come alterazioni di colore colonia può verificarsi durante la formazione di biofilm. Regolare l&#39;intensità e l&#39;angolo della sorgente luminosa per rivelarequesti cambiamenti sottili nella colorazione. Una volta che le impostazioni appropriate vengono raggiunti, a mantenere per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Nota quanto tempo trascorre dal momento dell&#39;inoculazione al momento in cui la formazione di colonie rugosa avvia per ogni ceppo o condizione. Definire l&#39;inizio della formazione della colonia rugosa come il punto temporale in cui la formazione di patterning e strutture 3D (cioè, striature formando sul bordo esterno o &#39;increspature&#39; che si verificano nel centro) è prima apparente. Le cellule mutanti possono mostrare ridotto o aumentato il tempo di inizio di formazione di colonie rugosa (ad esempio, Fig. 2). </li><li> Documentare l&#39;avvio e lo sviluppo della formazione di colonie spiegazzata catturando appropriate immagini digitali. È importante utilizzare lo stesso ingrandimento quando la raccolta di immagini durante l&#39;esperimento. Passare la vista dal oculare del microscopio allo schermo del computer utilizzando la leva posta sul retro della macchina. Quando si passa tra ocularee la visualizzazione sullo schermo del computer, regolare la visualizzazione e mettere a fuoco di conseguenza. </li><li> Prima di imaging culture macchiati, il coperchio della piastra di Petri è tipicamente rimosso per fornire l&#39;immagine più chiara. Tuttavia, questo passaggio è facoltativo, in quanto le culture maculati possono essere esposte attraverso il coperchio con la configurazione descritta nei passi 2.5 e 2.6. </li><li> Ad ogni punto di tempo dopo l&#39;inizio della formazione di colonie rugosa, prendere nota del modello di sviluppo della colonia rugosa. L&#39;architettura può svilupparsi dall&#39;interno verso l&#39;esterno, o fuori pollici Questa valutazione fornisce un meccanismo per distinguere i biofilm formati da differenti ceppi o in condizioni diverse. </li><li> Misurare il diametro della colonia sviluppo in ogni punto. Questo può essere fatto manualmente, o digitale utilizzando un programma software associato. Se fatto in digitale, utilizzare il software Progres CapturePro programma e prima calibrare la barra di scala per l&#39;ingrandimento specifico utilizzato nell&#39;esperimento. Includere la barra della scala in ogni immagine catturata. </li><li> Per calcolare il diametro colonia utilizzando il programma software ImageJ, aprire ogni file di immagine. Standardizzare la barra della scala come segue: Selezionare l&#39;opzione &quot;linea retta&quot; dalla barra degli strumenti. Sovrapporre il barra della scala incorporato con una linea retta della stessa lunghezza e larghezza. Selezionare &quot;Scala Set&quot; dalla scheda &quot;Analizza&quot;. Nella &quot;nota distanza&quot; box, inserire la lunghezza corrispondente (come determinato dalla barra scala originale, cioè, 2 mm) e selezionare &quot;OK&quot;. </li><li> Utilizzare la &quot;linea retta&quot; opzione per inserire una linea orizzontale attraverso il posto. Sotto la scheda Analizza, selezionare &quot;Measure&quot;. Nella nuova finestra risultati, la lunghezza calcolata sarà fornita. Ottenere una seconda misura inserendo una linea perpendicolare attraverso il punto. Ricalcolare il diametro. Registrare la media delle due misure. Grafico del diametro medio per ogni posto ad ogni momento utilizzando un programma software come Excel. </li><li> La fine dell&#39;esperimento si verifica sia in un punto temporale specificato o quando vi è alcuna altrasviluppo del biofilm. Una volta che il fine è raggiunto, consolidare le immagini in una figura (s) per visualizzare il modello di sviluppo nel tempo utilizzando un programma di software come Powerpoint. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi In questi esperimenti abbiamo usato V. fischeri come organismo modello per studiare la formazione di biofilm valutando lo sviluppo di colonie rugose su una superficie solida agar. Biofilm producono ceppi di V. formano colonie fischeri con una vasta architettura 3D all&#39;interno di 40 h (Fig. 1) 8,9,14. Quando esaminata per un corso di tempo, risulta evidente che la formazione di colonie rugosa dal ceppo di controllo inizia già circa 12 h post-inoculazione (a seconda delle condizioni specifiche) (Fig. 2) 9. Al contrario, la formazione di biofilm da un mutante rappresentante è ritardato di circa 4 h, non avviare fino a circa 16 h post-inoculazione 9. Ripetts di questi esperimenti suggerito che la temporizzazione era relativamente costante, rendendo questa valutazione semi-quantitativa 9. Un secondo semi-quantitativa misura della formazione del biofilm fa uso della variazione di diametro della colonia sviluppo nel tempo. Come mostrato in Fig. 3A, un rappresentante biofilm-competente ceppo forma colonie che aumento di complessità e diametro rispetto a un ceppo rappresentativo che non forma biofilm. Misurazioni accurate nel tempo dei diametri delle colonie formate da questi due ceppi ha rivelato che la dimensione dei biofilm-competenti colonie aumentata ad un tasso maggiore dei biofilm-negativi colonie, e nel punto di tempo finale di due differiva di circa il 2 - piega (Fig. 3B). Pertanto, anche se le immagini di un tempo rappresentativo tardiva o morfologia &quot;end-point&quot; colonia frequentemente sono riportati nella letteratura, supplementari semi-quantitativi dati possono essere raccolti che permetterà una migliore comprensione del difetto biofilm.<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Figura 1. End-point saggio. Questa figura è un esempio di un end-point dosaggio con rappresentativi non-biofilm formanti (sinistra) e biofilm-formatura (destra) ceppi di V. fischeri. Queste immagini sono state raccolte in 40 h post-spotting. Queste immagini sono state generate con wild-type V. fischeri contenente un controllo vettoriale (non-biofilm di formazione) o una parte PSR sovraespressione plasmide (biofilm di formazione) e sono dei set di dati raccolti per Morris et al., 2011. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Figura 2. Time-corso test. Il pannello superiore contiene immagini rappresentative della formazione di biofilm da un biofilm-competente ceppo di controllo di V. fischeri su un percorso di tempo selezionato. Avvio della formazione di biofilm è evidente a 12 h. Il pannello inferiore contiene rappresentante imaghi di un ceppo mutante di V. fischeri che presenta un ritardo (4 h) l&#39;inizio della formazione della colonia rugosa nel tempo, con formazione di biofilm avvio a 16 h post-inoculazione. Si noti che in 40 ore i ceppi simile nell&#39;intensità ed il modello della formazione di biofilm, mentre le differenze sottili tra questi ceppi sono osservati solo in corrispondenza dei punti temporali precedenti. Queste immagini sono state generate con sovraespressione PSR wild-type e mutante sypE V. cellule fischeri e facevano parte del set di dati raccolti per Morris et al., 2011. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Figura 3. Diametro Colony come analisi semiquantitativa di formazione di biofilm. (A) Naturalmente il tempo della formazione di biofilm da un rappresentante biofilm di formazione (pannello superiore) e non-biofilm di formazione (pannello inferiore) ceppi di V. fischeri. Si noti che il biofilm-formatura ceppo mostra un aumento maggioredi diametro nel corso del tempo rispetto al ceppo non-biofilm formatura. Queste immagini sono state generate con wild-type V. fischeri contenente una parte PSR sovraespressione plasmide (biofilm di formazione) o un controllo vettoriale (non-biofilm di formazione) e sono dei set di dati raccolti per Morris et al., 2011. (B) Una rappresentazione grafica l&#39;aumento del diametro delle colonie nel corso del tempo dai due ceppi nel pannello A. Questi dati sono stati generati utilizzando il software ImageJ ed Excel, come indicato nel protocollo.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In questo lavoro, si descrive un metodo semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm utilizzando V. fischeri come organismo modello. In particolare, ci avvaliamo di un microscopio da dissezione con attacco telecamera per monitorare la formazione di biofilm e sviluppo, formazione di colonie rugosa nel corso del tempo su una superficie solida agar. In questo protocollo, si delineano due tipi specifici di metodi usiamo comunemente per valutare la formazione di rughe colonia. Il primo è il test end-point, che ci permette di osservare il finale, architettura complessiva 3D, modellazione, e il diametro di una cultura macchiato in un punto di scelta &quot;finale&quot; del tempo. Questo approccio è particolarmente utile per valutare i ceppi mutanti o condizioni che portano a difetti drammatici nella formazione di biofilm. Tuttavia, questo approccio non distingue tra più sottili differenze che si verificano ad intervalli di tempo prima della scelta end-point. Per monitorare più da vicino la formazione di rughe colonia, si usa un saggio di sviluppo nel tempo, che ci permette di identificare l&#39;inizio di wrinkled formazione di colonie e guardare il suo sviluppo nel tempo. Come risultato di questo approccio, più sottili differenze nei tempi di formazione della colonia rugosa, architettura 3D, e patterning può essere identificato. Abbiamo usato questo test andamento nel tempo di generare due semi-quantitative saggi di formazione di biofilm. In primo luogo, il tempo in cui un ceppo inizia a svilupparsi architettura 3D può essere paragonato a quello di ceppi di controllo. Abbiamo trovato che il ritardo nella formazione di biofilm di un mutante particolare nelle stesse condizioni è abbastanza consistente 9. Ad esempio, nei dati mostrati nella fig. 2, il mutante costantemente esposto su un ritardo 4 h in avviare la formazione di biofilm. Un secondo semi-quantitativa misura della formazione del biofilm è il cambiamento delle dimensioni del diametro della colonia rugosa (spot). Abbiamo trovato che il diametro delle colonie rugose progressivamente differisce da quella di non-biofilm colonie, raggiungendo circa 2 volte differenza nel punto di fine (Fig. 3 </strong&gt;) (Morris e Visick, dati non pubblicati). Fino ad oggi, non abbiamo osservato un fenotipo senza l&#39;altra (cioè la formazione di biofilm senza un aumento del diametro delle colonie) (dati non pubblicati), anche se rimane possibile alcuni mutanti si comporterà in modo diverso. Infatti, è stato riportato per V. cholerae che qualche risultato rugosa colonie in un sostanziale aumento del diametro delle colonie, mentre altri no 15. Tuttavia, valutando la variazione di diametro nel corso del tempo potrebbe aiutare nella caratterizzazione di mutanti biofilm potenziali e / o fornire un&#39;ulteriore misura quantitativa di mutanti con ritardi nello sviluppo. Dei due misure della formazione di biofilm (tempo e diametro), determinando l&#39;inizio della formazione della colonia rugosa è più sensibile, ma anche più personale, di determinare il diametro dello spot. Anche così, entrambe le misure forniscono una valutazione semiquantitativa di un fenotipo che è estremamente utile per i ricercatori biofilm ma non facilmente suscettibili di quantification. Quando si esegue maculati test in coltura, è importante considerare le condizioni ambientali in cui vengono coltivati ​​i ceppi maculati. Formazione di colonie Rugosa è spesso influenzata da varie condizioni ambientali, compresa la disponibilità di nutrienti, temperatura e umidità. Per ridurre la variabilità tra esperimenti, è utile standardizzare queste condizioni il più possibile (cioè standardizzazione delle piastre di agar a un determinato volume e coltivando i ceppi maculati a temperatura controllata). Per un ulteriore controllo per la variabilità tra esperimenti avvistamento, è importante includere i appropriati ceppi di controllo all&#39;interno di ciascuna serie di esperimenti. Infine, l&#39;interpretazione dei dati ottenuti in questi test, è necessario eseguire una qualsiasi esperimento più volte (3 +), specialmente nel valutare sottili differenze di formazione di colonie rugosa (ad esempio, un ritardo nella formazione di biofilm o differenze patterning). Alcune limitazioni di questo protocollo sono: 1) deterING se le cellule hanno un difetto nella crescita può essere difficile: la crescita delle cellule in coltura liquida possono non corrispondere accuratamente i tassi di crescita su terreni solidi, e una determinazione accurata di crescita del biofilm che formano le cellule, che possono stare insieme, potrebbe non essere possibile; 2) ceppi con difetti di crescita sarà problematico da analizzare; 3) può non essere possibile distinguere differenze di diametro tra ceppi con fenotipi biofilm sottili, 4) per ceppi che non crescono in un anello concentrico può non essere possibile misurare accuratamente cambiamenti di diametro, 5) mentre patterning possono essere osservati durante la formazione di biofilm, non vi è alcun modo per quantificare il modellamento del biofilm risultante, e 6) non c&#39;è modo per misurare la Z-dimensione del biofilm con questa configurazione sperimentale . Nonostante questi limiti, questo protocollo prevede tuttavia un mezzo per ottenere dati numerici per aiutare a valutare la formazione di rughe colonia. In questo protocollo, ci avvaliamo di un imaging specifichesistema (ad esempio, un microscopio Zeiss dissezione e Progres CapturePro software di imaging), di osservare e valutare la formazione di rughe colonia. Il sistema di imaging descritto qui è potente: la capacità di rilevare l&#39;inizio della formazione della colonia rugosa, e quindi valutare lo sviluppo con un approccio corso di tempo, è notevolmente aumentata con l&#39;uso di un microscopio da dissezione. Tuttavia, se questa tecnologia non è disponibile, il protocollo può essere adattato per l&#39;uso con altre apparecchiature, tra cui una semplice macchina fotografica digitale con un obiettivo zoom. Mentre questo protocollo si concentra sulla valutazione di sviluppo colonia rugosa, potrebbe anche essere modificato per valutare la formazione di pellicola, una forma di biofilm che si sviluppa quando le cellule crescono staticamente in coltura liquida. Questo protocollo può rivelarsi utile anche per valutare altri indicatori della formazione di biofilm, tra cui l&#39;incorporazione di coloranti specifici nelle colonie macchiati durante lo sviluppo di biofilm. Questi includono, ma non sono limitati a, coloranti come Congo Red e calcofluo che possono legarsi alla cellulosa, un componente comune di biofilm batterici 16. Inoltre, questo protocollo, anche se sviluppato per l&#39;uso con V. fischeri, non è limitata a questo organismo, ma può essere generalizzato per studiare la formazione di biofilm in numerose differenti organismi, come Bacillus subtilis 4, 5 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus 6, 7 e Pseudomonas aeruginosa, che mostra tutti formazione di colonie rugosa. Infine, può anche essere adattato per studiare morfologie di colonia altri che hanno un modello di sviluppo, come, potenzialmente, il patterning che si verifica durante la crescita del Myxococcus xanthus 17 e sviluppo struttura aerea in Pseudomonas aeruginosa 18. Questo protocollo è quindi di uso generale per i ricercatori di microbiologia e di biofilm.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome delle apparecchiature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C dissezione Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Ottenuta tramite microscopio Lukas) </td></tr><tr><td> Progres C10 PLUS </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Attacco per fotocamera (ottenuta tramite microscopio Lukas) </td></tr><tr><td> CL 1500 CE sorgente a luce fredda </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Ottenuta tramite microscopio Lukas) </td></tr><tr><td> Progres CapturePro </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> Il software libero con la telecamera registrata </td><td> Programma per computer per l&#39;acquisizione di immagini </td></tr><tr><td> Immagine J </td><td> NIH </td><td> Software gratuito da:ij / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Programma informatico per la misurazione del diametro </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilm, o superficie collegati comunità di cellule incapsulate in una matrice extracellulare, rappresentano uno stile di vita comune per molti batteri. All&#39;interno di un biofilm, le cellule batteriche spesso mostrano alterata fisiologia, anche una maggiore resistenza agli antibiotici e altri stress ambientali 1. Inoltre, i biofilm possono svolgere ruoli importanti in interazioni ospite-microbo. I biofilm si sviluppano quando i batteri passaggio da individuo, le cellule planctoniche a formare complessi e multi-cellulari comunità 2. In laboratorio, biofilm sono studiate valutando lo sviluppo di biofilm fenotipi specifici. Un fenotipo biofilm comune comporta la formazione di colonie batteriche o rugose rugose su agar solido media 3. Formazione di colonie Rugosa fornisce uno strumento particolarmente semplice e utile per identificare e caratterizzare i ceppi batterici che presentano fenotipi alterati biofilm, e per studiare le condizioni ambientali che la formazione di biofilm impatto. Wrila formazione di colonie nkled serve come un indicatore della formazione di biofilm in una varietà di batteri, inclusi sia batteri Gram-positivi, come Bacillus subtilis 4, e batteri Gram-negativi, come Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, e Vibrio fischeri 8. Il batterio marino V. fischeri è diventato un modello per la formazione del biofilm a causa del ruolo cruciale dei biofilm durante la colonizzazione host: biofilm prodotto da V. fischeri promuovere la sua colonizzazione delle Hawaii Bobtail calamari Euprymna 8-10 scolopes. È importante sottolineare che, fenotipi biofilm osservati in vitro correlano con la capacità di V. fischeri cellule di colonizzare efficacemente animali ospiti: ceppi di handicap per la formazione del biofilm in vitro in possesso di un difetto colonizzazione 9,11, mentre i ceppi esibendo un aumentofenotipi biofilm sono stati migliorati per la colonizzazione 8,12. V. fischeri fornisce quindi un sistema semplice modello per valutare i meccanismi con cui i batteri regolano la formazione di biofilm e come biofilm ospite colonizzazione impatto. In questo rapporto, descriviamo un metodo semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm utilizzando V. fischeri come sistema modello. Questo metodo comporta l&#39;attenta individuazione di colture batteriche a concentrazioni e volumi definiti su un supporto di agar solido, una cultura maculato è sinonimo di una singola colonia batterica. Questa tecnica di &#39;cultura spotted&#39; può essere utilizzato per confrontare i fenotipi biofilm lordi a singoli, specifici punti temporali (end-point saggi), o per identificare e caratterizzare i fenotipi biofilm sottili attraverso il tempo portate saggi di sviluppo biofilm e misurazioni del diametro colonia , che è influenzata dalla formazione di biofilm. Così, questa tecnica fornisce una analisi semiquantitativa di formazione di biofilm, permitting valutazione dei tempi e patterning di sviluppo della colonia rugosa e le dimensioni relative della struttura in via di sviluppo, caratteristiche che si estendono al di là della semplice morfologia complessiva.

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A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Noi forniamo un semplice, semi-quantitativa metodo per studiare la formazione di biofilm<em&gt; In vitro</em&gt;. Questo metodo sfrutta il STEMI Zeiss 2000-C dissezione Microscopio (con l&#39;attacco della fotocamera) per monitorare sia i tempi e il modello di formazione di biofilm, come dimostrato dallo sviluppo di colonie rugose.

Un approccio semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm mediante lo sviluppo spiegazzato Colony

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K Views.  Loyola University Medical Center. Noi forniamo un semplice, semi-quantitativa metodo per studiare la formazione di biofilm In vitro. Questo metodo sfrutta il STEMI Zeiss 2000-C dissezione Microscopio (con l'attacco della fotocamera) per monitorare sia i tempi e il modello di formazione di biofilm, come dimostrato dallo sviluppo di colonie rugose.

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A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Un Matrigel-Based Formazione Assay tubo per valutare l&#39;attività vascolare delle cellule tumorali

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Ricerca

Biologia

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Valutare Contributi specie-specifiche per lo sviluppo craniofacciale Uso Chimere Quaglia-anatra

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Il saggio Formazione morbida Agar Colony

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots located in Xinjiang Province, northwest China. To prevent high correlations among observations from the same sampling unit, we developed the model using a linear mixed-effects approach with random plot effect to account for stochastic variability. Various tree- and stand-level variables, such as indices for tree size, competition, and site condition, were included as fixed effects to explain the residual variability. In addition, heteroscedasticity and autocorrelation were described by introducing variance functions and autocorrelation structures. The optimal linear mixed-effects model was determined by several fit statistics: Akaike&#8217;s information criterion, Bayesian information criterion, logarithm likelihood, and a likelihood ratio test. The results indicated that significant variables of individual-tree basal area increment were the inverse transformation of diameter at breast height, the basal area of trees larger than the subject tree, the number of trees per hectare, and elevation. Furthermore, errors in variance structure were most successfully modeled by the exponential function, and the autocorrelation was significantly corrected by first-order autoregressive structure (AR(1)). The performance of the linear mixed-effects model was significantly improved relative to the model using ordinary least squares regression.

Mixed-effects models are flexible and useful tools for analyzing data with a hierarchical stochastic structure in forestry and could also be used to significantly improve the performance of forest growth models. Here, a protocol is presented that synthesizes information relating to linear mixed-effects models.

Sviluppo di un modello di incremento dell'area basale a albero individuale mediante un approccio lineare ad effetti misti

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the surface and disaggregating the clumps, and analyzing the sample. Of the four steps, harvesting and disaggregation are the least studied but nonetheless critical when considering the potential for test bias. This article demonstrates commonly used harvesting and disaggregation techniques for biofilm grown on three different surfaces. The three biofilm harvesting and disaggregation techniques, gleaned from an extensive literature review, include vortexing and sonication, scraping and homogenization, and scraping, vortexing and sonication. Two surface types are considered: hard non-porous (polycarbonate and borosilicate glass) and porous (silicone). Additionally, we provide recommendations for the minimum information that should be included when reporting the harvesting technique followed and an accompanying method to check for bias.

This paper details methods that demonstrate three common biofilm harvesting and disaggregation techniques on two surface types, ruggedness testing of a harvesting method and minimum information to consider when choosing and optimizing harvesting and disaggregation techniques to increase reproducibility.

Raccolta e disaggregazione: un passo trascurato nella ricerca sui metodi di biofilm

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

Valutazione della formazione di biofilm da Acinetobacter e caratterizzazione dei biofilm

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

Autore in primo piano: un protocollo completo per la quantificazione, la valutazione e la visualizzazione del biofilm di Acinetobacter 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Strategie di quantificazione, valutazione della vitalità e visualizzazione per biofilm di Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...