Tutto il lavoro è stato eseguito presso il Centro per la Duke In Microscopia Vivo, uno NIH / NIBIB nazionale Biomedical Technology Resource Center (P41 EB015897) e NSC Piccolo Imaging Programma Animal Resource (U24 CA092656). Ulteriore supporto è stato fornito dalla NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).

1. Assemblare e calibrazione del sistema ad ultrasuoni <ol><li> Il sistema a ultrasuoni inizia con un singolo elemento trasduttore di ultrasuoni con un ampio diametro sufficiente a coprire il cervello di topo e una frequenza centrale della gamma di 2 MHz. Il trasduttore è azionato da un 50-dB potenza dell&#39;amplificatore, che è collegato ad un generatore di segnale che produce la sequenza di impulsi ad ultrasuoni. </li><li> Per calibrare la pressione acustica del sistema a ultrasuoni, utilizzare un idrofono in relazione la tensione applicata alla pressione acustica risultante. Posizionare il trasduttore in un serbatoio di acqua sopra il idrofono. Applicare un impulso semplice (per esempio, un 10-ciclo sinusoide a frequenza del trasduttore con frequenza di ripetizione degli impulsi di 10 Hz) al trasduttore. Utilizzare un asse 3-stadio di traslazione per trovare la risposta di picco, che dovrebbe essere al centro del fascio di ultrasuoni al fuoco naturale del trasduttore (circa 60 mm per il trasduttore 13 millimetri di diametro 2,15 MHz). </li><li> Esecuzione delle misure diverse nel corso di un squillòe di tensioni di ingresso (ad esempio, pp 50-400 mV) per verificare la linearità del sistema. Utilizzare una semplice regressione lineare per valutare il rapporto tra tensione di ingresso e la pressione acustica. Nel nostro sistema, tensioni di ingresso di 258 e 167 mV pp corrispondeva a pressioni acustiche picco-negativi di 0,52 e 0,36 MPa. </li><li> Programma il generatore di segnali per produrre una sequenza di impulsi ad ultrasuoni costituito da raffiche di impulsi sinusoidali alla frequenza del trasduttore con 50000 cicli al burst e un periodo di burst di 64 ms. Sulla base delle misure di calibrazione, impostare l&#39;ampiezza dell&#39;impulso di generare picco-negativi pressioni acustiche di 0,36 MPa al centro del fuoco naturale del trasduttore. </li></ol> 2. Preparare i reagenti <ol><li> Sciogliere tetraidrato Manganese cloruro (MnCl 2 · 4H 2 O) in acqua sterile alla concentrazione di 100 mM (300 mOsm) e filtro sterilizzare. </li><li> Produrre il lipide perflutreno microsfere da &quot;activating &quot;il flaconcino fornito dal produttore agitatore per 45 s. Per un giorno di esperimenti, una singola fiala può essere attivata una volta all&#39;inizio della giornata e utilizzato senza riattivazione per il resto della giornata. </li><li> Immediatamente prima della somministrazione di microsfere, agitare il flacone a mano per 1 min per risospendere le microsfere. Quando si estrae microbolle dal flaconcino, non iniettare l&#39;aria della stanza nel flaconcino, in quanto questo degrada le microbolle rimanenti. Lasciare il flaconcino out fino l&#39;ultimo uso della giornata, e poi conservare in frigorifero. Mantenuto in questo modo, un singolo flaconcino può durare diversi giorni. Re-attivare il flacone memorizzato nella agitatore, prima del primo uso nei giorni successivi. </li></ol> 3. Preparazione degli animali <ol><li> Anestetizzare gli animali con isoflurano, espresso dal cono di naso. L&#39;apparecchio cono dovrebbero essere progettati per fissare la testa dell&#39;animale preciso ed affidabile nella stessa posizione ogni volta. Il nostro dispositivo 15 mantiene la testa in the &quot;cranio-flat&quot; posizione (cioè, la superficie del cranio dorsale è orizzontale) utilizzato nel cervello Paxinos atlante 16. Titolare l&#39;anestetico per mantenere una frequenza respiratoria tra 85 e 125 respiri al minuto. Mantenere la temperatura corporea con una lampada di calore o di aria soffiata. Proteggere gli occhi con lubrificante. </li><li> Togliere i capelli dal cuoio capelluto del mouse utilizzando un trimmer elettrico. </li><li> Posizionare un catetere venoso coda e uno intraperitoneale (IP) del catetere. Per gli studi di sopravvivenza, assicurarsi di utilizzare una corretta tecnica sterile; posizionamento del catetere IP dimostrato nel video di questo articolo è appropriata solo per non-sopravvivenza esperimenti. </li><li> Apportare le preparazioni aggiuntivi necessari per l&#39;esperimento di stimolazione neuronale. Per la mappatura di stimolazione vibrisse della corteccia campo canna, utilizzare un microscopio da dissezione e forbici per tagliare la microchirurgia vibrisse più vicino possibile alla superficie della pelle senza irritare la pelle circostante o follicolo. </li><li> Posizionare gel ultrasuoni sullacuoio capelluto, e poi una minore colonna d&#39;acqua contenuto in un foglio di plastica sottile (ad esempio, un cestino rivestimento 7,6 micron bin) sulla testa. Raggiungere attraverso con colonna d&#39;acqua con un bastoncino di cotone con punta per far uscire eventuali bolle d&#39;aria che vengono intrappolate nel gel per ultrasuoni. Posizionare il trasduttore ad ultrasuoni alla distanza focale naturale (58 mm) direttamente sopra il cervello di topo nella colonna d&#39;acqua, e pulire il trasduttore con la punta di un dito per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria intrappolate. </li></ol> 4. Emato-encefalica apertura Barriera con microbolle e Ultra Sound (BOMUS) <ol><li> Dai un&#39;iniezione intraperitoneale di soluzione di manganese alla dose di 0,5 mmol / kg IP. Chiudere il catetere intraperitoneale in modo che il manganese non fuoriesce, e attendere 10 minuti per consentire di distribuire (Figura 1). </li><li> Per aprire la BBB, amministrare 30 microlitri di microsfere lipidiche perflutreno (DEFINITY attivato) attraverso il catetere vena della coda, e contemporaneamente, avviare la sequenza di impulsi ad ultrasuoni. Continue insonification per 3 minuti. </li></ol> 5. Stimolazione neuronale <ol><li> Attendere circa 40 minuti per i livelli cerebrali di Mn 2 + si stabilizzi prima di iniziare la stimolazione neuronale. In questo modo, il miglioramento drammatico di base a causa di Mn 2 + diffusione attraverso la BBB può essere distinto dal miglioramento differenziale sottile dovuta alla stimolazione. Poi, comincia la stimolazione con il paradigma della scelta (Figura 1). </li><li> Per la stimolazione vibrisse, spegnere la isoflurano e rimuovere il cono. Spostare pennello un artista morbido manualmente in un movimento circolare (1-5 Hz) attraverso la matrice vibrisse ad una distanza di circa 2-5 mm dalla pelle. Continua la stimolazione per 90 min. Il manganese ha un effetto sedativo che consente la stimolazione sfrenata dell&#39;animale. Se l&#39;animale diventa irrequieto, amministrare il 5% isoflurano via cono per circa 15 secondi. </li></ol> 6. Magnetic Resonance Imaging <ol><li> Dopo la stimolazione, riprendere l&#39;anestesia tramite cono. Continuare a mantenere la temperatura corporea e il livello di titolazione isoflurano ad una frequenza respiratoria di 85-125 respiri al minuto. </li><li> Posizionare il mouse in una bobina di imaging RM e trasferire al sistema di MRI. Acquisizione ad alta risoluzione 3D T 1-pesate RM. Ad esempio, utilizzare un gradiente 3D viziato ricordato echo (SPGR) sequenza con i seguenti parametri: tempo di ripetizione di 25 ms, tempo di eco di 2 ms, flip angle di 30 gradi; larghezza di banda di 15,63 kHz; campo visivo di 20 × 20 × 12 mm; matrice di 128 × 128 × 60. </li></ol> 7. Image Analysis <ol><li> Analisi di immagine è specifico al paradigma stimolazione usato. Per l&#39;esperimento stimolazione vibrisse (figura 2), importare le immagini da animali diversi in un ambiente di analisi appropriato. Se alcuni animali sono stati stimolati a destra, mentre altri sono stati stimolati a sinistra, flalcuni ip in modo che tutte le immagini siano effettivamente &quot;a sinistra stimolato.&quot; Poi, per confrontare il lato stimolato di ogni cervello per il suo lato controlaterale non stimolato, creare un duplicato e specchiato sinistra non stimolato set immagine viene creata. Registra tutte le immagini di uno spazio comune e poi lisciare con un 3 × 3 × 3 pixel kernel gaussiano. </li><li> Esportare i dati in un ambiente di analisi matematica, come MATLAB. Facoltativamente, mascherare anatomia irrilevante nei set di dati. Intensità-normalizzare le immagini dal metodo iterativo di Venot et al. 17,18. </li><li> Utilizzare una, appaiati single-coda test t per confrontare ogni voxel dei lati di ogni cervello stimolati al voxel corrispondente controlaterale sui lati di ogni cervello stimolate. </li><li> Visualizzare la risultante p-value mappa per identificare regioni di attività differenziale (figura 3). </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Il metodo presentato qui ha due fondo<html> amental fasi: (1) apertura BBB con microbolle ed ecografia (BOMUS) e (2) Attivazione indotta da Manganese-enhanced risonanza magnetica (MRI AIM). Poiché la fase di quest&#39;ultimo dipende dal precedente, è importante controllare BOMUS attuazione successo. L&#39;interruzione della barriera sangue-cervello dopo somministrazione di una T 1-accorciamento agente di contrasto (come manganese o gadolinio agente basato) comporta un aumento del segnale nel parenchima cerebrale il T 1-pesate rispetto al cervello in cui BOMUS non è stata eseguita (Figura 4). La distribuzione di questo miglioramento manganese non è perfettamente uniforme, anche se è abbastanza consistente tra animali. La distribuzione riflette disomogeneità non solo in apertura BBB, ma è anche l&#39;intrinseca distribuzione non uniforme della Mn all&#39;interno del cervello 19. Le dinamiche spaziali e temporali dell&#39;apertura BBB sono stati ulteriormente descritti in precedenza 12. ent &quot;&gt; Una volta BOMUS è stato attuato con successo, il passo successivo è quello di eseguire AIM MRI Molti paradigmi sperimentali sono possibili;.. però, perché ci sono molti potenziali confonde, i controlli e le analisi devono essere attentamente progettati effetti confondenti comprendono disomogeneo apertura BBB, accumulo disomogeneo di Mn nel cervello, dinamiche temporali di diffusione Mn, e non specifica l&#39;attività neuronale. In questa dimostrazione, la risposta neuronale alla stimolazione unilaterale della vibrisse è stato mappato. Per spiegare le disomogeneità e Mn flusso, il lato stimolato di ogni cervello è stato utilizzato come controllo interno. Per spiegare aspecifica attività neuronale che può variare tra animali, l&#39;analisi statistica test utilizzato per identificare le regioni che erano sempre differenti tra gli animali (Figura 2). I risultati erano una mappa tridimensionale e una differenza tridimensionale p-value map (figura 3), il lato destro delle quali indicata regionidi segnale superiore controlaterale al vibrisse stimolato. Il lato sinistro della mappa indicato che le regioni hanno segnale significativamente superiore omolaterale al vibrisse stimolato. Il p-value mappa identificato un&#39;ampia regione di segnale elevata controlaterale alla vibrisse stimolata corrispondente al campo canna della corteccia sensoriale primaria, la cui risposta alla stimolazione vibrisse è stato ampiamente documentato da elettrofisiologia 20,21 e 2-deossiglucosio studi. Una discussione più completa di questi risultati è stato pubblicato in precedenza 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig1.jpg" /> Figura 1. Temporale protocollo per neuroimaging funzionale con BOMUS e AIM MRI (Adattato da Howles et al. 13). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig2.jpg" /> Figura 2. Schema di analisi per identificare le regioni of diversa intensità tra i lati stimolati e senza stimoli di ogni cervello. Per confrontare il lato stimolato di ogni cervello per il suo lato controlaterale non stimolato, un duplicato e specchiato sinistra non stimolato set immagine viene creata. Queste immagini sono registrati, filtrati, e normalizzato. Infine, prova a confronto le immagini a sinistra stimolati e sinistra non stimolate. Il test t è &quot;accoppiato&quot;, in modo che il lato stimolato di ciascun cervello è solo rispetto al lato non stimolato del cervello stesso. Il test t è &quot;single-coda&quot; in modo che un lato del p-value mappa indica un segnale significativamente maggiore sul lato stimolato del cervello, mentre l&#39;altro lato del p-value mappa indica un segnale significativamente maggiore sul lato della stimolata cervello (Adattato da Howles et al. 13). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig3.jpg" /> Figura 3. I risultati di un&#39;analisi aggregata di 7 animali in due diverse posizioni assiali. T<html> egli prima colonna indica la media di tutte le immagini registrate allineate, in modo che efficacemente tutti i topi avevano loro vibrisse sinistra stimolato. Queste immagini sono ricoperti con una mappa di colori che indica l&#39;incremento medio percentuale di segnale in ciascun voxel rispetto all&#39;emisfero controlaterale, come indicato dalla barra colore. Regioni colorate sul lato destro dell&#39;immagine indicano dove l&#39;emisfero controlaterale alla stimolazione era maggiore del segnale. Regioni colorate sul lato sinistro dell&#39;immagine indicano dove ipsilaterale emisfero alla stimolazione era maggiore del segnale. La seconda colonna mostra le stesse immagini sovrapposte con il p-value mappa indica la significatività statistica del aumento del segnale. La terza colonna mostra lo stesso p-value map sovrapposto le cifre corrispondenti dal Paxinos atlante stereotassico 16 con i campi di canna della corteccia sensoriale ombreggiata (Adattato da Howles et al. 13). / 4055/4055fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Distribuzione spaziale di Mn 2 + nel cervello. Le immagini sono state acquisite dopo 170 min IP MnCl 0,5 mmol / kg 2 da BOMUS-trattato (n = 5) e di controllo (n = 4) topi. Dopo la normalizzazione, la media e le mappe di deviazione standard sono state calcolate (pannello a sinistra). Enhancement era maggiore nei topi trattati con BOMUS. Anche se questo miglioramento non è uniforme in tutto il cervello, era abbastanza consistente, tranne vicino ai bordi del cervello e ventricoli. Uso delle aree di interesse (ROI) disegnato attorno a strutture diverse, la media SNR (+ 1 SD) è stato calcolato in ciascun gruppo (pannello di destra). BOMUS animali trattati hanno mostrato una maggiore SNR, ma anche una maggiore varianza tra strutture e tra gli animali (Adattato da Howles et al. 13). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig5.jpg" /> Figura 5. Per esaminare gli effetti dei tessuti di BOMUS, cervelli di topi trattati con BOMUS sono stati fissati, sectioned a 500 - intervalli di micron, e colorate con ematossilina ed eosina. Il numero medio di stravasi globuli rossi visto in ogni sezione del cervello è mostrato per pressioni acustiche di 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), e 5,0 MPa (n = 1). Le barre di errore indicano l&#39;errore standard. Il secondo pannello mostra un esempio di grave stravaso globuli rossi dal cervello esposto a 5,0 MPa (Adattato da Howles et al. 12). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig6.jpg" /> Figura 6. Quantitativa test comportamentale è stato utilizzato per valutare l&#39;attività, l&#39;eccitazione, e la risposta prima dell&#39;anestesia, e 3, e 24 ore dopo il recupero dall&#39;anestesia. Il sistema di punteggio, 12 descritto in precedenza, è basata sulla consolidata valutazione quantitativa topo comportamentale sviluppareed da Irwin nel 1968 22. Il comportamento medio (± SEM) punteggio di controllo (n = 3) e BOMUS (0,36 MPa) trattati (n = 8) è mostrato animali. Rispetto al pre-anestesia di base, tutti gli animali mostrano una diminuzione del punteggio comportamento 3 ore dopo l&#39;anestesia, ma in gran parte recuperare il giorno successivo. Ad ogni punto di tempo, nessuna differenza è stata osservata tra i due gruppi, indicando che BOMUS non misurabile influisce sul comportamento animale (Adattato da Howles et al. 12).

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-enhanced+magnetic+resonance+imaging+(MEMRI):+methodological+and+practical+considerations.">Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI): methodological and practical considerations.</a> Nmr. Biomed. 17, 532-543 (2004).</li><li>Meiri, U., Rahamimoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+transmission+-+inhibition+by+manganese+ions.">Neuromuscular transmission - inhibition by manganese ions.</a> Science. 176, 308 (1972).</li><li>Aschner, M., Guilarte, T. R., Schneider, J. S., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese:+Recent+advances+in+understanding+its+transport+and+neurotoxicity.">Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).</li><li>Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-enhanced+MRI+of+the+mouse+auditory+pathway.">Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway.</a> Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).</li><li>Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+auditory+brain+mapping+in+mice+with+Mn-enhanced+MRI.">In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI.</a> Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+mapping+of+sound-evoked+activity+in+the+mouse+auditory+midbrain+using+Mn-enhanced+MRI.">Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI.</a> Neuroimage. 39, 223-230 (2008).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Qui, un metodo non invasivo è stato presentato per l&#39;apertura del BBB in tutto il cervello di topo tutto con ultrasuoni e microbolle (BOMUS). Con l&#39;apertura BBB, Mn 2 + è stato somministrato e l&#39;attivazione indotta manganese-enhanced MRI (AIM MRI) è stata utilizzata per la risposta neuronale a immagine di breve durata nei topi stimolazione leggermente sedati. Un&#39;adeguata apertura BBB stato raggiunto con un picco negativo pressione acustica di 0,36 MPa. Nota, que...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Idrofoni </td><td> Sonora Medical Systems, Longmont, CA </td><td> SN-251 S4 </td><td></td></tr><tr><td> Traduzione stage </td><td> Newport Corporation, Irvine, CA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trasduttore ad ultrasuoni </td><td> Olympus NDT, Inc., Waltham MA </td><td> SU-A306S </td><td> Rivedere foglio di prova del fabbricante che accompagna il trasduttore per trovare l&#39;esatta frequenza centro di quel trasduttore particolare, che può differire dalla frequenza nominale elencati nel catalogo. (Ad esempio, la frequenza nominale del nostro trasduttore è risultata di 2,25 MHz, ma la frequenza centrale effettiva era 2,15 MHz.) </td></tr><tr><td> Vevo Imaging Station </td><td> VisualSonics, Inc. Toronto, Canada </td><td>; </td><td></td></tr><tr><td> 50 dB amplificatore di potenza </td><td> E &amp; I, Rochester, NY </td><td> modello 240L </td><td></td></tr><tr><td> Il generatore di segnale </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> modello 33220A </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 - (H2O) 4 </td><td> Sigma </td><td></td><td> Il peso molecolare varia a seconda del lotto, contattare il produttore per la misurazione esatta </td></tr><tr><td> Perflutreno microsfere lipidiche </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA </td><td> DEFINITY </td><td></td></tr><tr><td> Microsfera agitatore </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA </td><td> Vialmix </td><td></td></tr><tr><td> RM coil </td><td> m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH </td><td></td><td> 35 mm di diametro quadratura di trasmissione / ricezione bobina del volume </td></tr><tr><td> Sistema MRI </td><td> GE Healthcare, Milwaukee, WI </td><td></td><td> GE console EXCITE funzionamento di un 7-T magnete orizzontale foro </td></tr><tr><td> Immagine di analisi ambientale </td><td> Visage Imaging, San Diego, CA, The MathWorks, Natick MA </td><td> Amira MATLAB </td><td></td></tr></tbody></table>

functional neuroimaging using ultrasonic blood-brain barrier disruption and manganese-enhanced mri

Anche se i topi sono il sistema modello dominante per studiare le basi genetiche e molecolari delle neuroscienze, neuroimaging funzionale nei topi rimane tecnicamente difficile. Un approccio, Activation-Induced Manganese-enhanced risonanza magnetica (MRI AIM), è stato usato con successo per mappare l&#39;attività neuronale nei roditori 1-5. In AIM MRI, Mn 2 + agisce un analogo di calcio e si accumula nei neuroni depolarizzate 6,7. Perché Mn 2 + T 1 accorcia la proprietà dei tessuti, le regioni di elevata attività neuronale migliorerà in MRI. Inoltre, Mn 2 + cancella lentamente dalle regioni attivati, pertanto, la stimolazione può essere eseguita al di fuori del magnete e l&#39;imaging, consentendo una maggiore flessibilità sperimentale. Tuttavia, poiché Mn 2 + non attraversano facilmente la barriera emato-encefalica (BBB), la necessità di aprire la BBB ha limitato l&#39;uso di AIM MRI, soprattutto nei topi. Uno strumento per l&#39;apertura del BBB è ULTrasound. Sebbene potenzialmente dannosa, se ultrasuoni viene somministrato in combinazione con microbolle riempite di gas (cioè, agenti di contrasto ad ultrasuoni), la pressione acustica necessarie per l&#39;apertura BBB è notevolmente inferiore. Questa combinazione di ultrasuoni e microbolle può essere utilizzato per aprire la BBB affidabile senza causare danni ai tessuti 8-11. Qui, viene presentato un metodo per eseguire AIM MRI microbolle tramite ultrasuoni e per aprire la BBB. Dopo l&#39;iniezione endovenosa di microbolle perflutreno, un fascio non focalizzato ultrasuoni pulsato è applicato alla testa del mouse rasata per 3 minuti. Per semplicità, ci riferiamo a questa tecnica di apertura BBB con microbolle e ultrasuoni BOMUS 12. Utilizzo BOMUS per aprire la BBB tutta entrambi emisferi, manganese viene somministrato al cervello di topo intero. Dopo la stimolazione sperimentale dei topi leggermente sedati, AIM MRI viene utilizzato per mappare la risposta neuronale. Adimostrare questo approccio, qui BOMUS e AIM risonanza magnetica vengono utilizzate per mappare unilaterale stimolazione meccanica della vibrisse nei topi leggermente sedato 13. Poiché BOMUS può aprire la BBB in tutta entrambi gli emisferi, il lato stimolato del cervello viene usato per controllare per la stimolazione aspecifica di fondo. La mappa risultante di attivazione 3D ben si accorda con rappresentazioni pubblicate delle regioni vibrisse del campo barile corteccia 14. L&#39;apertura ad ultrasuoni del BBB è veloce, non invasivo e reversibile, e quindi questo approccio è adatto per gli studi high-throughput e / o longitudinale nei topi svegli.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Una tecnica è ampiamente descritta per l&#39;apertura della barriera ematoencefalica nel topo mediante ultrasuoni e microbolle. Utilizzando questa tecnica, manganese può essere somministrato al cervello di topo. Poiché manganese è un agente di contrasto MRI che si accumula nei neuroni depolarizzati, questo approccio permette l&#39;imaging di attività neuronale.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

functional-neuroimaging-using-ultrasonic-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K Views.  Stanford University. Una tecnica è ampiamente descritta per l'apertura della barriera ematoencefalica nel topo mediante ultrasuoni e microbolle. Utilizzando questa tecnica, manganese può essere somministrato al cervello di topo. Poiché manganese è un agente di contrasto MRI che si accumula nei neuroni depolarizzati, questo approccio permette l'imaging di attività neuronale.

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Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Misurare il valore soggettivo di opzioni rischiose e ambigui utilizzando Economia Sperimentale e funzionali metodi MRI

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Ricerca

Neuroscienze

Optogenetic Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Optogenetic risonanza magnetica funzionale

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in remote locations. This paper shows the development of field functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) imaging to the study of child language, reading, and cognitive development in a rural village setting of C&#244;te d&#39;Ivoire. Innovation in methods and the development of culturally appropriate neuroimaging protocols allow&#160;a first-time look into the brain&#39;s development and children&#39;s learning outcomes in understudied environments. This paper demonstrates protocols for transporting and setting up a mobile laboratory, discusses considerations for field versus laboratory neuroimaging, and presents a guide for developing neuroimaging consent procedures and building meaningful long-term collaborations with local government and science partners. Portable neuroimaging methods can be used to study complex child development contexts, including the impact of significant poverty and adversity on brain development. The protocol presented here has been developed for use in C&#244;te d&#39;Ivoire, the world&#39;s primary source of cocoa, and where reports of child labor in the cocoa sector are common. Yet, little is known about the impact of child labor on brain development and learning. Field neuroimaging methods have the potential to yield new insights into such urgent issues, and the development of children globally.

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy NIRS Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Portable neuroimaging approaches (functional Near Infrared Spectroscopy) provide advances to the study of the brain in previously inaccessible regions; here, rural C&#244;te d&#39;Ivoire. Innovation in methods and development of culturally-appropriate neuroimaging protocols permits novel study of the brain&#39;s development and children&#39;s learning outcomes in environments with significant poverty and adversity.

Metodi di neuroimaging campo usando vicino spettroscopia infrarossa (NIRS) Neuroimaging funzionale per studiare lo sviluppo globale del bambino: zone rurali dell'Africa sub-sahariano

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Un approccio da banco all'apertura della barriera ematica specifica della posizione utilizzando ultrasuoni focalizzati in un modello di ratto

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati per il targeting delle strutture cerebrali e la valutazione della neuromodulazione chemiogenetica

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Role of Diffusion MRI Tractography in Endoscopic Endonasal Skull Base Surgery

Endoscopic endonasal surgery has gained a prominent role in the management of complex skull base tumors. It allows the resection of a large group of benign and malignant lesions through a natural anatomical extra-cranial pathway, represented by the nasal cavities, avoiding brain retraction and neurovascular manipulation. This is reflected by the patients' prompt clinical recovery and the low risk of permanent neurological sequelae, representing the main caveat of conventional skull base surgery. This surgery must be tailored to each specific case, considering its features and relationship with surrounding neural structures, mostly based on preoperative neuroimaging. Advanced MRI techniques, such as tractography, have been rarely adopted in skull base surgery due to technical issues: lengthy and complicated processes to generate reliable reconstructions for inclusion in the neuronavigation system. 
This paper aims to present the protocol implemented in the institution and highlights the synergistic collaboration and teamwork between neurosurgeons and the neuroimaging team (neurologists, neuroradiologists, neuropsychologists, physicists, and bioengineers) with the final goal of selecting the optimal treatment for each patient, improving the surgical results and pursuing the advancement of personalized medicine in this field.

We present a protocol to integrate diffusion MRI tractography in patient work-up to endoscopic endonasal surgery for a skull base tumor. The methods for adopting these neuroimaging studies in the pre- and intra-operative phases are described.

Ruolo della trattografia MRI a diffusione nella chirurgia endoscopica della base cranica endonasale

Endoscopic endonasal surgery has gained a prominent role in the management of complex skull base tumors. It allows the resection of a large group of ...

Misurazione della resistenza transendoteliale per valutare l'integrità della barriera cellulare

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autore in primo piano: Applicazioni del rilevamento TEER per valutare l'integrità della barriera cellulare 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...