Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Fritz Thyssen (10.11.2.153 a RK), il tedesco Research Council (DFG, KR2119/3-2 e KR2119/8-1 a RK), il Ministero federale dell&#39;Istruzione e della ricerca (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 a RK) e da una borsa di studio di dottorato dal caritatevole Fondazione Hertie [di LFB]. Ringraziamo Carolin Obermaier e Julia Westermeier per il loro supporto durante le riprese video.

1. Biopsia della pelle e la coltura di fibroblasti umani <ol><li> La biopsia della pelle deve essere presa da un medico esperto. La procedura si svolge in condizioni di sterilità e non richiede anestesia locale. Siti tipici utilizzati per biopsia sono il lato interno del braccio, alla spalla o inferiore della schiena. </li><li> Si può prendere campione diametro 4x4mm o 6x6mm da biopsia per ottenere tessuto sufficiente per la coltura fibroblasti umani. </li><li> Tagliare la biopsia cutanea in piccoli pezzi uguali in condizioni sterili per separarli in 2-4 T25 fiaschi. Ogni pallone dovrebbe contenere 2-3 pezzi di epidermide. I terreni di coltura contenente 15% FCS, piruvato di sodio 1,1% e 1% di penicillina / streptomicina in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2. Il tempo di propagazione previsto fino fibroblasti primo crescere del campione epidermica è di 1-2 settimane. Se i problemi di crescita sono incontrati, si può fare uso di fa di crescita dei fibroblastictor (5-10 ng / ml FGF2) per stimolare la crescita delle cellule. </li><li> Una volta che una cellula confluenza del 50-70% viene raggiunto, i fibroblasti umani primari possono essere congelati. Il tempo di 50-70% di confluenza viene raggiunta, differisce tra linee cellulari. Congelare i fibroblasti nel 90% FCS solfossido maggiorato del 10% dimetil (DMSO). </li></ol> 2. Preparazione di fibroblasti umani per la microscopia diretta Cell Imaging In generale, gli esperimenti con fibroblasti umani deve essere effettuata con passaggi al di sotto di 10, come senescenza-associate alterazioni possibile modificare le proprietà delle cellule dopo più di un passaggio. In caso di dubbio, beta-galattosidasi saggi possono essere utilizzati per valutare l&#39;induzione di processi di invecchiamento nelle rispettive celle. In generale, non utilizzare fibroblasti invecchiati (vedi sopra). Inoltre, per confrontare diverse linee cellulari, funzionano con il numero stesso passaggio di ciascuna linea cellulare. Confronto di diversi pazienti geneticamente omogenee rispetto ai controlli sani è raccomandata. Tuttavia, come talvoltapazienti portatori di mutazioni specifiche possono essere rare, questo può significare che biopsie cutanee da solo un paziente con un numero certo passaggio e linee di controllo differenti devono essere inclusi - qui è essenziale garantire lo stesso numero passaggio di tutte le linee incluse. Se una cella confluenza del 50-70% è raggiunto, ma nessun esperimento programmato, fibroblasti devono essere congelati. <ol><li> Il primo giorno dell&#39;esperimento, lavare i fibroblasti allegate una volta con PBS. Quindi rilasciare dal pallone utilizzando una soluzione distacco delle cellule di enzimi proteolitici DNasi (cioè ACCUMAX). </li><li> Contare le cellule e le sementi 50.000-70.000 cellule in ciascun pozzetto di una 4 camere coprioggetti (1,8 cm 2 area culturale per pozzetto). Pertanto, per gli 8-camere coverglas, metà del numero di cellule o poco meno è appropriato (0,8 cm 2 coltura per pozzetto). È importante seme piuttosto un piccolo numero di cellule per effettuare reale cella singola analisi. Nessun rivestimento specifico per le camere is necessario. </li><li> Dopo 24-48 ore, il live esperimento di imaging cellulare può essere effettuata. Assicurarsi che il live microscopio imaging cellulare è dotato di un incubatore che controlla temperatura e livelli di CO2. Durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine, un&#39;atmosfera di 37 ° C e 5% di CO 2 dovrebbe essere mantenuta. </li><li> Ogni misura vivo imaging cellulare dovrebbe essere effettuata in almeno tre esperimenti indipendenti. In totale, un minimo di 50 cellule per ogni linea cellulare deve essere ripreso. Gli esperimenti di imaging dal vivo delle cellule così come le analisi off-line devono essere eseguite in condizioni di cieco per garantire i dati imparziali raccolta. </li></ol> 3. Misurazione della funzione mitocondriale in Living fibroblasti umani Per la misurazione convenzionale di funzione mitocondriale via potenziale di membrana mitocondriale (MMP)-dipendente coloranti fluorescenti selezione cellulare attivata (FACS) è il metodo principale. Nel caso di fibroblasti umani, cellulare autofluorescence è frequente e può causare risultati falsi positivi per interferenza con il segnale colorazione vera e propria. Autofluorescenza diventa in genere più pronunciato con numeri più alti passaggio di fibroblasti. Pertanto, si preferisce valutare la funzione mitocondriale di fibroblasti umani mediante microscopia vivo imaging cellulare. <ol><li> 24-48 ore dopo la semina, incubare i fibroblasti in 50 nM del MMP-dipendente tetramethylrodamine colorante etil estere (TMRE) in terreno RPMI. Questo mezzo RPMI manchi rosso fenolo come questo può influire negativamente sulla qualità dell&#39;immagine. 1,6 pM di colorazione Hoechst dovrebbe essere aggiunto per visualizzare nuclei. </li><li> Incubare le cellule in soluzione colorante preparata riparo dalla luce per 15 minuti a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Sostituire la soluzione di colorazione con il mezzo RPMI (senza rosso fenolo). Procedere senza una fase di lavaggio e subito celle di immagine. Utilizzare ingrandimento 63x e confocale a scansione laser tecnica di microscopia (microscopia a fluorescenza utilizzando in alternativaTecnica Apotome) per definire i singoli strati di cellule. Applicare 37 ° C e 5% di CO 2 a cellule durante il processo di imaging. </li><li> Quando l&#39;imaging i fibroblasti, prestare la massima attenzione al tempo di esposizione di luce fluorescente applicato come colorazione TMRE può candeggina in fretta. Definire il momento opportuno di esposizione tra 200 e 300 ms e di non superare questo intervallo. L&#39;acquisizione delle immagini con le impostazioni standard è molto importante, come si sarebbe in grado di fare confronti in base all&#39;intensità se le impostazioni sono diverse tra le linee cellulari. </li><li> Come un raggio definito attorno alle cellule sotto forma di immagini è sbiancato dopo l&#39;esposizione alla luce, tenere il campo successivo visivo adeguatamente lontano dalla sezione photobleached. </li><li> Off-line analisi vengono effettuate utilizzando il software ImageJ (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA). </li><li> Selezionare la cella di interesse, utilizzando uno strumento di selezione. </li><li> Convertire immagini a 8-bit (Foto &lt;Tipo &lt;8-bit). </li><li> Ridurre il rumore b aspecificay con la funzione &quot;Antipolvere&quot; (Process &lt;rumore &lt;Smacchia). </li><li> Scegliere le &quot;tabelle di ricerca - Fire&quot; condizione (Foto &lt;tabelle di ricerca Fuoco &lt;). </li><li> Passare nella funzione soglia per la &quot;Over / Under&quot; e regolare la funzione soglia (Foto &lt;Regolazione Soglia &lt;). </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;analizzare particelle&quot;, che vi darà il valore medio grigio per ogni particella mitocondriale rilevabile (Analizza &lt;analizzare particelle). Salvare la lista dei risultati dato come un foglio di calcolo di Excel. </li><li> Risultato Apri il file nel programma Excel e calcolare la media del valore medio grigio delle strutture mitocondriali (indicato come &#39;media&#39; in data excel lista dei risultati). </li><li> Per creare un grafico di superficie, selezionare il plugin &quot;Interactive trama di superficie 3D&quot; nella sezione &quot;3D&quot; plugin. Qui, è possibile regolare ulteriormente la trama con diverse opzioni di visualizzazione. &quot;Modifica dei colori originali&quot; a &quot;Spectrum LUT&quot; dà la barra della scala di intensità per la trama del caso. </li><li> In alternativaall&#39;utilizzo TMRE per analizzare la funzione mitocondriale di fibroblasti umani tramite imaging cellulare vivo, una combinazione di MMP-indipendente colorante verde Mitotracker FM e la MMP-dipendente Mitotracker colorante CM-H 2 Xros può essere utilizzato. Ancora, per fibroblasti umani vivono immagini di microscopia cella è preferito, ma in generale questa alternativa è stato utilizzato anche mediante analisi FACS in altri tipi di cellule 12. Quando si utilizza questo approccio alternativo per misurare la funzione mitocondriale in fibroblasti umani, passo 3-7 di sezione del protocollo 5 &quot;Misura del mitochondrio-lisosomiale colocalizzazione nel vivere fibroblasti umani&quot; deve essere applicato. Essa, la sovrapposizione dei segnali, sia dal positivo mitocondri per Mitotracker verde FM e Mitotracker CM-H 2 Xros viene calcolata e indica la quantità di mitocondri come rapporto funzionale a tutti i presenti mitocondri. </li></ol> 4. Misurazione della morfologia mitocondriale in Living fibroblasti umani <ol><li> 24-48hr dopo la semina, le cellule incubare a 200 nM Mitotracker verde FM in mezzo RPMI (senza rosso fenolo) riparo dalla luce per 15 minuti a 37 ° C e 5% di CO 2. 1,6 pM di colorazione Hoechst dovrebbe essere utilizzato per evidenziare nuclei. Mitotracker verde FM è una MMP-indipendente colorante, macchie che tutte le strutture mitocondriali presenti. </li><li> Lavare delicatamente le cellule una volta con PBS. </li><li> Aggiungere mezzo RPMI fresco (senza rosso fenolo) alle cellule e immediatamente celle di immagini. Utilizzare ingrandimento 63x e confocale a scansione laser tecnica di microscopia (microscopia a fluorescenza in alternativa con la tecnica Apotome) per definire i singoli strati di cellule. </li><li> Off-line le analisi vengono estratti mediante l&#39;uso di software ImageJ. </li><li> Selezionare la cella di interesse, utilizzando uno strumento di selezione. </li><li> Convertire immagini a 8-bit (Foto &lt;Tipo &lt;8-bit). </li><li> Riduzione del rumore non specifico utilizzando la funzione &quot;Antipolvere&quot; (Process &lt;rumore &lt;Smacchia). </li><li> Utilizzare il filtro di convoluzione per evidenziare mitocondristrutture mitocondriale (Processo &lt;Filtri &lt;Convolve). </li><li> Regolare la soglia in modo che il rapporto segnale-rumore è opportuno (Foto &lt;Regolazione Soglia &lt;). </li><li> Utilizzando l&#39;opzione &quot;analizzare particelle&quot;, l&#39;identificazione automatica delle strutture mitocondriali è avviata sulla base di una dimensione del pixel scelto (Analizza &lt;analizzare particelle). Diversi parametri mitocondriali sono successivamente calcolati come area, perimetro, gli assi maggiori e minori o di circolarità. Queste misure possono essere impostati singolarmente (Analizza &lt;Misure Set). Salvare la lista dei risultati dato come un foglio di calcolo di Excel. </li><li> Aprire il file risultato nel programma Excel. Con l&#39;uso di tali parametri, analisi della morfologia mitocondriale può essere effettuata. Ciò comprende la definizione del fattore di forma che indica il grado di ramificazione di una rete mitocondriale [formula: (perimetrale 2) / (4 * PI () * area)], nonché il rapporto di formato che definisce la lunghezza dei mitocondri (formula: maggiore assi / assi minori). </li></ol> 5. Misurazione della Mitochondrio-lisosomiale Colocalizzazione in Living fibroblasti umani <ol><li> 24-48 ore dopo la semina, le cellule incubare a 200 nM Mitotracker verde FM e 100 nM Lyostracker Red DND-99 in medium RPMI (senza rosso fenolo) riparo dalla luce per 15 minuti a 37 ° C e 5% di CO 2. 1,6 pM di colorazione Hoechst viene utilizzato per evidenziare i nuclei. </li><li> Sostituire il terreno con mezzo fresco RMPI (senza rosso fenolo) contenente 100 nM Lyostracker Red ND-99. Questo colorante deve essere presente durante l&#39;intera sessione di imaging. Non lavare le cellule dopo il periodo di incubazione. Immediatamente immagine le cellule. Utilizzare ingrandimento 63x e tecnica confocale (tecnica alternativa Apotome) per definire i singoli strati di cellule. </li><li> Off-line le analisi vengono estratti mediante l&#39;uso di software ImageJ. </li><li> Aprire le due rispettive immagini che si desidera analizzare in termini di status colocalizzazione. </li><li> Convertire immagini a 8-bit (Foto &lt;Tipo &lt;8-bit). </li&gt; <li> Riduzione del rumore non specifico utilizzando la funzione &quot;Antipolvere&quot; in entrambe le immagini (Process &lt;rumore &lt;Smacchia). </li><li> Scegliere il plugin &quot;Jacopo&quot;, come strumento di analisi di colocalizzazione, che fornisce i valori per i rispettivi canali e calcola il coefficiente di Pearson, si sovrappongono e coefficiente coefficiente di Manders &#39;(Plugin &lt;Jacop). </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Funzione mitocondriale nel vivere fibroblasti umani può essere valutata tramite tecnica di imaging cellulare dal vivo. Per saggi funzionali, il segnale di fluorescenza TMRE correla con il potenziale di membrana mitocondriale (MMP). In condizioni normali di MMP, la fluorescenza TMRE è notevolmente superiore (Figura 1A, riga superiore) che in condizioni patologiche caratterizzate da una ridotta MMP (Figura 1A, riga inferiore). Questa fluorescenza viene misurata calcolando la media del valore medio grigio di ogni struttura mitocondriale ( <strong&gt; Figura 1B). L&#39;intensità di fluorescenza può essere misurata tramite software ImageJ. Qui, l&#39;uso della &quot;trama superficie interattiva&quot; consente per l&#39;illustrazione dei differenti intensità di picco (Figura 1A, lato destro). Accanto alla valutazione della funzione mitocondriale in fibroblasti umani, vivo microscopia imaging cellulare può essere utilizzato per definire diversi parametri di morfologia mitocondriale. Usando il Mitotracker verdi FM strutture mitocondriali tinture sono visualizzati indipendente dalla loro rispettiva MMP (Figura 2). Questo è importante per garantire l&#39;inclusione di tutte le strutture mitocondriali presenti nelle analisi. Utilizzando il software ImageJ, la morfologia viene analizzato sulla base dei dati binari, come solo i parametri qui morfologia mitocondriale può essere valutata (Figura 2, &quot;binario&quot;). Esempi di analisi della morfologia mitocondriale in termini di fattore di forma e proporzioni sono stati recentemente pubblicati 6, 13. Un&#39;altra importante caratteristica che può essere misurata in living fibroblasti umani è la degradazione delle strutture mitocondriali. Il primo passo di questo cammino può essere valutata mitochondrio-lisosomiale colocalizzazione in microscopia vivo imaging cellulare. Alcune condizioni patologiche provocano un aumento di mitocondri colocalizzazione con i lisosomi (Figura 3A). Ancora una volta, Mitotracker verde FM viene utilizzato per colorare strutture mitocondriali indipendenti della loro rispettiva MMP. Inoltre, la colorazione con Lysotracker Red DND-99 consente di visualizzare strutture lisosomiali. È fondamentale che il colorante Lysotracker Red è presente durante il processo di imaging, come fasi di lavaggio ridurre il segnale che è troppo basso per la visualizzazione. Colocalizzazione è rappresentato da chiari segnali di fluorescenza giallo a causa della sovrapposizione del verde (verde Mitotracker FM) e rosso (Red Lysotracker ND-99) colorazione (frecce bianche, Figura 3A) e sono determinati dal calcolo del coe Pearsonfficiente (Figura 3B). In generale, per analisi off-line con ImageJ software, è utile visualizzare una cella per immagine, in modo che la definizione di una regione di interesse (ROI) può essere evitato. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1.jpg" /> Figura 1. Misurazione del segnale TMRE fluorescenza indica il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) nel soggiorno fibroblasti umani mediante tecnica vivo imaging cellulare. (A) è un TMRE fluorescente MMP-dipendente colorante, la cui intensità di fluorescenza è correlata con la MMP. Hoechst colorante è stato utilizzato per colorare nuclei (blu). In condizioni normali di MMP (riga superiore), la fluorescenza TMRE è significativamente superiore in condizioni patologiche caratterizzate da una ridotta MMP (fila inferiore). Intensità di fluorescenza è inoltre mostratocome grafico dell&#39;intensità superficiale. Bar Scala indica 10 micron. (B) L&#39;analisi statistica dei fibroblasti esemplificativa mostrata in (A). In condizioni patologiche, una fluorescenza TMRE diminuzione dei mitocondri è misurato rispetto alla normale condizione di MMP. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig2.jpg" /> Figura 2. Misura della morfologia mitocondriale in fibroblasti umani che vivono con la tecnica dal vivo imaging cellulare. Mitotracker Verde FM (verde) viene utilizzato per visualizzare le strutture mitocondriali, per questo è indipendente dalla MMP. Hoechst colorante è stato utilizzato per colorare nuclei (blu). Uso ImageJ Software, la morfologia può essere analizzata su cifre binarie. Bar Scala indica 10 micron. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig2large.jpg" target="_blank">clic</a><html> qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3.jpg" /> Figura 3. Misura della colocalizzazione dei mitocondri con i lisosomi nel vivere fibroblasti umani da parte di tecnica di imaging cellulare dal vivo. (A) Mitotracker Verde FM (verde) viene utilizzato per colorare le strutture mitocondriali, Lyostracker Red ND-99 (rosso) visualizza strutture lisosomiali. Hoechst colorante è stato utilizzato per colorare nuclei (blu). Colocalizzazione successo in condizioni patologiche è indicato da un segnale giallo a causa della sovrapposizione di rosso e verde Lysotracker colorazione Mitotracker (frecce bianche). Bar Scala indica 10 micron. (B) L&#39;analisi statistica dei fibroblasti esemplificativa mostrata in (A). Un livello più elevato di mitochondrio-lisosomiali risultati colocalizzazione in un elevato valore del coefficiente di Pearson./ 4228/4228fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Fibroblasti cutanei dei pazienti come modelli ex vivo rappresentano un importante strumento per caratterizzare difetti genetici associata a malattia. Inoltre, la pelle derivati ​​fibroblasti sono facilmente accessibili e possono essere estesa, coltura. Pertanto, cellule primarie ottenute da pazienti portatori PD-associata mutazioni genetiche sono preferibili l&#39;uso di linee cellulari tumorali in quanto contengono non solo la endogena causante malattia gene, ma l&#39;intero background genetico dell&#39;in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo n. </td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 52400-025 </td></tr><tr><td> RPMI 1640, non rosso fenolo </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-063 </td></tr><tr><td> Dulbecco tampone fosfato salino (DPBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td></tr><tr><td> ACCUMAX (soluzione distacco) </td><td> PAA </td><td> L11-008 </td></tr><tr><td> Lab-TekTMII chambered vetrini </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 115382 </td></tr><tr><td> Tetramethylrodamine etil estere (TMRE) </td><td> Invitrogen </td><td> T-669 </td></tr><tr><td> Mitotracker Verde FM </td><td> Invitrogen </td><td> M-7514 </td></tr><tr><td> Mitotracker CM-H2XRos </td><td> Invitrogen </td><td> M-7513 </td></tr><tr><td> Lyostracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L-7528 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H-3570 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche.

the use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of parkinson's disease

Morbo di Parkinson (PD) è il secondo disturbo movimento più comune e colpisce l&#39;1% delle persone di età superiore ai 60 1. Poiché l&#39;invecchiamento è il fattore di rischio più importante, i casi di PD aumenterà nei prossimi decenni 2. Accanto al ripiegamento delle proteine ​​patologiche e deteriorate vie di degradazione delle proteine, alterazioni della funzione mitocondriale e la morfologia sono stati additati come segno distintivo ulteriore della neurodegenerazione nella malattia di Parkinson 3-11. Dopo anni di ricerca in cellule tumorali murine ed umane come modelli in vitro per analizzare vie molecolari di parkinsonismo, l&#39;uso di fibroblasti umani da pazienti e controlli appropriati come modelli ex vivo è diventato un valido strumento di ricerca, se caveat potenziali sono considerati. Oltre immortalizzate, modelli cellulari piuttosto artificiali, fibroblasti primari di pazienti portatori di malattie associate a mutazioni apparentemente riflettere importanti caratteristiche patologiche of la malattia umana. Qui delineare la procedura di presa di biopsie cutanee, la coltura fibroblasti umani e l&#39;utilizzo di protocolli di modalità di tecniche microscopiche essenziali per definire fenotipi mitocondriali. Questi sono stati utilizzati per studiare diverse caratteristiche associate a PD che sono rilevanti per la funzione mitocondriale e la dinamica. Ex vivo, mitocondri può essere analizzato in termini di funzione, morfologia, colocalizzazione con i lisosomi (organelli mitocondri degradanti disfunzionale) e la degradazione attraverso la via lisosomiale . Questi fenotipi sono molto importanti per l&#39;identificazione di segni precoci di PD e possono precedere i sintomi motori clinici umani malattia gene-vettori. Quindi, i saggi qui presentati possono essere utilizzati come strumenti preziosi per identificare le caratteristiche patologiche di neurodegenerazione e contribuiscono a definire nuove strategie terapeutiche in PD.

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

I fibroblasti di pazienti portatori di mutazioni nel Parkinson geni che causano malattie rappresentano un facile accesso<em&gt; Ex vivo</emModello&gt; per studiare le malattie associate a fenotipi. Imaging cellulare vivo dà la possibilità di studiare parametri morfologici e funzionali nelle cellule viventi. Qui si descrive la preparazione di fibroblasti umani e successivamente controllare fenotipi mitocondriali.

L&#39;uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

16.7K Views.  DZNE. I fibroblasti di pazienti portatori di mutazioni nel Parkinson geni che causano malattie rappresentano un facile accesso Ex vivo per studiare le malattie associate a fenotipi. Imaging cellulare vivo dà la possibilità di studiare parametri morfologici e funzionali nelle cellule viventi. Qui si descrive la preparazione di fibroblasti umani e successivamente controllare fenotipi mitocondriali.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

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Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise3,5.
In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)8, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer11. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate &gt;80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse15. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents16, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion17, 18.
Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes &gt;95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson&#039;s Disease

A protocol for performing unilateral 6-OHDA lesions of the medial forebrain bundle in mice is described. This method has a low mortality rate (13.3 %) with 89% of the surviving animals showing &#62;95% loss of striatal dopamine and 90.63&#177;-4.02 % ipsiversive rotational bias towards the side of the lesion.

Sviluppo di un unilateralmente lesionata 6-OHDA modello murino della malattia di Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

MALDI Imaging Mass Spectrometry dei neuropeptidi nella malattia di Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Pelle Punch Biopsia Espianto Cultura per la derivazione di fibroblasti umani primari

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Aortica trapianto ortotopico in Mouse per lo studio della malattia vascolare

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Modelli di interazione gene-ambiente per smascherare i meccanismi di suscettibilità nel morbo di Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Controlling Parkinson&#039;s Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

Controllo della Malattia di Parkinson con Adaptive stimolazione cerebrale profonda

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Developing Neuroimaging Phenotypes of the Default Mode Network in PTSD: Integrating the Resting State, Working Memory, and Structural Connectivity

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of psychiatric illness severity and provide added validity to the clinical diagnostic process. Recent neuroimaging research suggests that DMN processes may be disrupted in a number of stress-related psychiatric illnesses, such as posttraumatic stress disorder (PTSD).
Although specific DMN functions remain under investigation, it is generally thought to be involved in introspection and self-processing. In healthy individuals it exhibits greatest activity during periods of rest, with less activity, observed as deactivation, during cognitive tasks, e.g., working memory. This network consists of the medial prefrontal cortex, posterior cingulate cortex/precuneus, lateral parietal cortices and medial temporal regions.
Multiple functional and structural imaging approaches have been developed to study the DMN. These have unprecedented potential to further the understanding of the function and dysfunction of this network. Functional approaches, such as the evaluation of resting state connectivity and task-induced deactivation, have excellent potential to identify targeted neurocognitive and neuroaffective (functional) diagnostic markers and may indicate illness severity and prognosis with increased accuracy or specificity. Structural approaches, such as evaluation of morphometry and connectivity, may provide unique markers of etiology and long-term outcomes. Combined, functional and structural methods provide strong multimodal, complementary and synergistic approaches to develop valid DMN-based imaging phenotypes in stress-related psychiatric conditions. This protocol aims to integrate these methods to investigate DMN structure and function in PTSD, relating findings to illness severity and relevant clinical factors.

This protocol describes the complementary neuroimaging techniques of resting state structural connectivity, task-induced deactivation, and structural connectivity analyses to examine the default network in post-traumatic stress disorder. The use of synergistic methods could potentially lead to improved diagnostics and assessments of severity, outcome, and other relevant clinical factors.

Lo sviluppo di Neuroimaging fenotipi della modalità di rete predefinita in PTSD: Integrazione stato di riposo, Working Memory, e connettività strutturale

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

L&#39;uso di ultra-alto campo MRI in piccolo roditore modelli di malattia del rene policistico per<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipizzazione and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...