La disfunzione mitocondriale è alla base di molte malattie neurodegenerative. Il nostro protocollo fornisce uno strumento importante per esaminare la dinamica mitocondriale negli assoni, facilitando lo studio delle malattie neurologiche che coinvolgono la degenerazione assonale. Combinando l'etichettatura mitocondriale, l'imaging di cellule vive e la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte, il nostro protocollo può essere utilizzato per caratterizzare il traffico mitocondriale lungo gli assoni umani e per analizzarne le morfologie.
Il trasporto mitocondriale e la morfologia compromessi possono essere osservati nelle colture di cellule staminali e nei modelli animali di malattie neurodegenerative fornendo potenziali obiettivi terapeutici per il trattamento di queste malattie. Dopo il giorno trentacinque di coltura, dissociare le neurosfere differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in piccoli ammassi con 1 mg/ml di soluzione di distacco cellulare per due minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione raccogliere i grappoli cellulari per centrifugazione e rimosogliere il pellet in un millilitro di NDM.
Placcare circa cinque grappoli di cellule in cento microlitri di media per poliornitina e lattosio deidrogenasi elevando il fattore di crescita ridotto privo di virus matrice di membrana basale rivestita 35 millimetri di vetro piatti di fondo. Quindi aggiungere un millilitro di NDM integrato con B27, monofosfato di adenosina ciclica, fattore di crescita insulino-simile, fattore neurotrofico derivato dal cervello umano e fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali ad ogni coltura. Per visualizzare i mitocondri lungo gli assoni dei neuroni delencefalo, per prima cosa macchiare i neuroni con 50 coloranti fluorescenti rossi nanomolari in NDM per tre minuti a 37 gradi Celsius seguiti da due lavaggi in NDM caldo.
Quindi, posizionare la coltura sul palco di un microscopio a fluorescenza e selezionare l'obiettivo 40X. Sotto il campo di fase identificare gli assoni in base alle loro caratteristiche morfologiche. Per distinguere la direzione del movimento mitocondriale lungo gli assoni identificare chiaramente i corpi cellulari dei neuroni.
Dopo aver distinto il corpo cellulare e l'assone, regolare il tempo di esposizione e la messa a fuoco dei mitocondri negli assoni e catturare il trasporto mitocondriale all'interno degli assoni ogni cinque secondi per un totale di cinque minuti. Per analizzare il trasporto mitocondriale in ImageJ aprire Fiji e selezionare il plug-in Bio-Formats. Utilizzare l'importatore bio-formati per importare le immagini time-lapse della serie tiff e selezionare ImageJ standard e Aprire tutte le serie.
Controllare la scala automatica dei canali divisi e fare clic su OK tenendo presente il numero di fotogramma e le dimensioni delle immagini in pixel. Dopo aver regolato la luminosità e il contrasto per tutti i 60 fotogrammi, utilizzate la linea segmentata per disegnare una linea dal corpo cellulare all'assone terminale. Per generare il Kymograph, selezionare il plugin Kymograph multiplo e selezionare la larghezza della linea.
Per misurare la distanza, i valori di tempo e la velocità per i mitocondri in movimento aperti tsp050607. txt nel plug-in macro. E disegna una linea segmentata sulla traccia del movimento mitocondriale sul kymografo dalla regione superiore a una inferiore.
Dopo aver tracciato la linea aperta leggere le velocità da tsp nel plugin macro per leggere le velocità segmentate corrispondenti alla linea. Aprire quindi l'immagine originale e usare lo strumento linea per disegnare una linea lungo la barra di scala. Selezionare analizza per misurare la lunghezza della linea e convertire il dx ora e le unità di distanza dai pixel ai micrometri.
Quindi cambia il tempo da pixel a secondi. Per analizzare la lunghezza mitocondriale e l'area all'interno degli assoni in ImageJ, installare il plug-in JAR punto di sottolineatura raddrizzare e aprire l'immagine axon di interesse. Convertire l'immagine a 32 bit in otto bit e utilizzare lo strumento linea segmentata per tracciare l'assone.
Selezionare il plug-in JAR di sottolineatura Raddrizza e impostare la larghezza della linea larga del filamento su 50 pixel. Traccia di nuovo l'assone per generare un assone raddrizzata e regola la soglia dell'immagine. Selezionare l'ellisse e i descrittori di forma per l'adattamento perimetrale delle misure impostate per impostare la misurazione e utilizzare la funzione linea per misurare la barra di scala nell'immagine originale, come illustrato.
In Analizza e per impostare la scala immettere la distanza in pixel di distanza nota e l'unità di lunghezza per impostare la scala. Quindi seleziona globale per impostare l'impostazione della scala su tutte le immagini. Infine, selezionate analizzare e analizzare le particelle per determinare l'area e selezionare i risultati della visualizzazione per visualizzare la misurazione risultante.
Dopo la differenziazione in neuroni glutattergici telencefalici le cellule possono essere caratterizzate dalla loro espressione t-B-R uno e beta tre marcatori di tubulina. La colorazione con colorante fluorescente rosso e l'imaging time-lapse consente la valutazione del trasporto assonale dei mitocondri. Un singolo mitocondrio può rimanere statico o muoversi in direzione anterograda o retrograda all'interno di un assone.
La velocità del movimento mitocondriale lungo l'assone può essere quantificata come illustrato. Ad esempio, utilizzando software di analisi disponibili in commercio, la percentuale di mitocondri motile è significativamente ridotta nei neuroni S-P-G-3-A rispetto ai neuroni di tipo selvaggio. Per analizzare la lunghezza dell'area mitocondriale e le proporzioni gli assoni possono raddrizzare nel software di analisi delle immagini e selezionare regolando la soglia.
La larghezza della lunghezza perimetrale dell'area mitocondriale e le proporzioni possono quindi essere ottenute dall'assone raddrizzare. Ad esempio sia la lunghezza mitocondriale che le proporzioni sono significativamente ridotte negli assoni neuronali S-P-G 15 rispetto agli assoni di tipo selvaggio di controllo. È importante riscaldare il mezzo e l'incubatore del microscopio per lavare delicatamente le cellule e consentire alle cellule di stabilizzarsi per venti minuti prima dell'imaging.
Dopo l'imaging a cellule vive le colture possono essere fissate e sottoposte ad immunosottenzione per esaminare l'espressione di altre proteine di interesse. È difficile esaminare la dinamica mitocondriale nei nervi umani vivi. Questa tecnica fornisce lo strumento unico per lo studio della dinamica mitocondriale e della degenerazione nervosa nelle malattie neurologiche.
