Gli autori ringraziano il NIH (AI074224 e GM085323) e NSF (0.712.019 e 0.924.699) per il finanziamento a sostegno di progetti dedicati alla biosintesi eterologa.

Il seguente testo è specifico per l&#39;antibiotico eritromicina A, ma i passaggi sono progettati per essere generalmente applicabile ad altri prodotti naturali come candidati per la biosintesi eterologa. 1. Eritromicina Un cluster di trasferimento genetico <ol><li> Progettazione primer PCR per amplificare tutti i geni associati alla eritromicina A cluster all&#39;interno S. erythraea cromosoma. Questo passo è specifico per i candidati di prodotti naturali le cui sequenze genetiche sono state determinate. In alternativa, i geni richiesti possono essere sintetizzati (attraverso diverse opzioni di fornitore commerciale) con il vantaggio che i geni di nuova sintesi sarà progettata per essere codon usage ottimale all&#39;interno della nuova E. coli host. Se la sintesi del DNA è perseguito, una sfida attuale sta generando megasynthase geni che possono superare i 10 kb di lunghezza. Tecnicamente, la sintesi può essere realizzato, ma è difficile e costosa. Si prevede che improvem continuagenitori nella tecnologia genetica sintesi affronterà inconvenienti attuali e convalidare ulteriormente questo approccio per la fornitura di materiale genetico eterologo. </li><li> Effettuare PCR utilizzando preparata S. erythraea DNA genomico come stampo. Il DNA cromosomico può essere preparato da colture di S. erythraea o da scorte congelate del batterio (Figura 3) 25. Le reazioni di PCR può beneficiare l&#39;aggiunta di DMSO (4 microlitri 50 reazioni pl) per tenere conto elevato contenuto G+ C nel bersaglio S. erythraea geni. Ogni gene amplificato dovrebbero essere sequenziati per confermare che il gene completo è stato ritirato e che non mutazioni sono state introdotte durante il processo PCR. </li><li> Attraverso digest restrizione e ligazione, inserire ciascuno dei geni isolati in vettori di espressione progettati per E. coli (Figura 3). Viene avviato la progettazione di siti di restrizione all&#39;interno dei primer PCR per consentire la digestione e ligazione in ex adattovettori pression (un esempio è stato incluso in Figura 3). Abbiamo usato sia pET21 e pET28 vettori. Il vettore pET28 consente l&#39;inserimento di una sequenza leader 5 &#39;che aiutato espressione genica nel eritromicina A caso. Confermare espressione individuale genica mediante RT-PCR, analisi SDS-PAGE (usando le frazioni proteiche solubili), o convenienti test fenotipici (Figura 4). </li><li> Costruire operoni basate su geni espressi con successo da plasmidi di espressione individuali (Figura 3). Abbiamo usato tradizionalmente combinazioni compatibili coesivi enzimi di restrizione (come Xba I e Spe I) 24 per convertire sequenzialmente geni di operoni, tuttavia, i siti di restrizione scelti per la costruzione operone non devono risiedere all&#39;interno (o deve essere rimosso dal) isolato sequenze di geni (un problema che può essere evitato se la sintesi gene è utilizzato). Questo passaggio consolida il 20 eritromicina A geni prima E. coli trasfrmazioni. Attualmente, abbiamo usato questo metodo per includere fino a 20 kb di DNA estraneo in un vettore pET standard (due geni di circa 10 kb ciascuno). Inoltre, abbiamo usato questo metodo per generare operoni contengono nove geni. Non è noto esattamente quanto DNA o quanti geni possono essere integrati in pET-tipo plasmidi, tuttavia, le metriche citate fornire un riferimento per sistemi complessi come la via biosintetica eritromicina. Infine, standard nelle fasi legatura in vitro e successive fasi di trasformazione di successo diventerà sempre più difficile, come operone e crescere della dimensione plasmide. Temperatura di legatura (12-22 ° C) e il tempo (3-24 ore) sono varie e elettro-trasformazione è utilizzato per aiutare il processo di produzione finali costrutti plasmidici. </li><li> Trasformare i plasmidi biosintetici di nuova concezione in E. coli ceppo BAP1 con elettro-trasformazione (Figura 5). La procedura può essere tentata con plasmidi introdotti sia in sequenza o in combination. Quando trasformando size-grado o plasmidi numerosi, abbiamo utilizzato tradizionalmente elettro-trasformazione (al contrario di trasformazione chimica). Una volta trasformate, le cellule sulla piastra di terreno LB solido contenente tetraciclina (5 mg / l), carbenicillina (100 mg / l), kanamicina (50 mg / l), streptomicina (50 mg / l), e apramicina (50 mg / l ) per selezionare per manutenzione plasmide. E &#39;molto insolito di utilizzare sei diversi selezione antibiotici post-trasformazione di un E. coli cella, ma questo riflette semplicemente il numero totale di plasmidi necessari per consentire finale eritromicina A biosintesi. Se possibile, l&#39;approccio limitare le capacità di produzione del composto una volta che la coltura è iniziato (vedi sotto). </li></ol> 2. E. coli Biosynthetic Ricostituzione <ol><li> BAP1 Strain è stato progettato per fornire i supporti necessari per la biosintesi e per la modifica post-traduzionale del megasynthase desossieritronolide B. Geni individuali del Erythromycin Un percorso sono stati testati per l&#39;espressione genica e consolidata a partire operoni in plasmidi di espressione. Questa sezione è dedicata alle condizioni di coltura per verificare l&#39;attività concertata della eritromicina Un percorso completo. </li><li> Prendere 3 colonie separate del BAP1 appena trasformato e inoculare colture LB 1,5 ml contenenti antibiotici necessari selezione plasmidici (alle stesse concentrazioni sopra indicate per selezionare trasformanti su terreno solido), isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG; 100 pM ) e arabinosio (2 mg / ml) per indurre l&#39;espressione genica, e 20 mM di sodio propionato di sostenere intracellulare formazione precursore biosintetico. Una volta che la produzione è stata confermata, grandi colture possono essere condotte in un tentativo di scalare e massimizzare titoli prodotti. </li><li> Cultura le cellule a 22 ° C e 250 rpm per 24-48 ore. In questo caso, la selezione antibiotica assicura che i plasmidi richiesti sono mantenuti nelle prime fasi della coltura cellulare. Tuttavia, plasmides può essere facilmente perso come livelli di selezione antibiotica cambiare nel corso del periodo di coltura. Questo può portare a instabilità plasmide (cioè, la perdita di una o più plasmidi durante cultura), che sarebbe quindi limitare la capacità di produzione. Il problema si aggrava quando plasmidi compatibili vengono utilizzati per introdurre un cluster completa gene eterologo. Tale è il caso per l&#39;eritromicina A composto (Figura 5) e dovrebbe essere posto rimedio alla sovrapproduzione veramente il composto da E. coli. Tuttavia, al fine di dimostrare produzione iniziale, tali difetti di progettazione sono tollerati per motivi di rapidità stabilire la fattibilità dell&#39;approccio eterologo. </li><li> Chiarire le culture mediante centrifugazione a 10.000 rpm in una microcentrifuga Eppendorf. Rimuovere il surnatante e conservare a 4 ° C per l&#39;analisi. </li><li> Nel caso di eritromicina A, mancanza di produzione composto è stato affrontato con l&#39;inclusione del GroES / EL chaperonin (utilizzando pGro7specificamente per affrontare la mancanza di attività degli enzimi post-espressione) e l&#39;inserimento di copie del gene (per quei geni sospettate di debole espressione / attività). Strategie simili possono essere necessari con altre iniziative di prodotti naturali di produzione eterologa. </li></ol> 3. Analisi dei prodotti <ol><li> Per confermare e quantificare eritromicina A formazione, iniettare il supernatante di coltura su un sistema LC-MS (Figura 6). Eritromicina A disponibile in commercio è stata utilizzata per confermare la produzione e come standard durante quantificazione. Per i casi che non standard disponibili in commercio, LC-MS analisi richiederebbe ulteriore caratterizzazione chimica mediante NMR e spettrometria di massa ad alta risoluzione. </li><li> Confronta produzione tra i 3 colonie / culture dalla trasformazione BAP1. Scegli il massimo produttore e preparare uno stock di glicerolo dalla sorgente colonia. Questa fase può essere eseguita in parallelo con le culture di produzione dei Protocollo2 utilizzando una piccola porzione delle culture per preparare scorte glicerolo. Conservare lo stock di glicerolo in un congelatore a -80 ° C. </li><li> Utilizzando la conferma, più elevato capitale cellula produttrice, iniziare una cultura di produzione separata ed estrarre il surnatante finale con volume 2x acetato di etile. Usare un sistema di aspirazione evaporativo per asciugare l&#39;estratto e risospendere in 100 microlitri metanolo. Trasferire l&#39;estratto in un disco filtro sterile (diametro ~ 1/4 pollici) e permettono il disco ad asciugare. Separatamente, cultura B. subtillis in liquido LB durante la notte. Aggiungere 20 ml di B. subtilis cultura a 20 ml di agar LB liquido a 45 ° C. Piatto l&#39;agar e lasciare solidificare. Posizionare il filtro a disco sulla piastra e incubare a 37 ° C (Figura 7). In alternativa, l&#39;estratto può essere aggiunto a colture liquide all&#39;interno di una piastra a 96 pozzetti per quantificare l&#39;attività utilizzando un lettore di piastre (Figura 7). </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Fasi critiche biosintesi eterologa si riscontrano a ciascuno dei tre punti procedurali nel processo: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione biosintetica e 3) l&#39;analisi del prodotto. Un problema in qualsiasi fase farà deragliare l&#39;obiettivo finale di creare biosintesi eterologa. Forse l&#39;aspetto più impegnativo del processo è stabilire biosintesi ricostituita, dal momento che questo è assolutamente necessaria per consentire l&#39;analisi di successo. Tuttavia, la ricostituzione dipende un&#39;attenta...

Eritromicina A è un antibiotico polichetide prodotto dal Gram-positivi suolo batterio Saccharopolyspora erythraea, e la produzione di corrente è stato poco incrementato a ~ 10 g / L in decenni di mutagenesi tradizionale e protocolli di screening e più recentemente attraverso schemi di ottimizzazione di processo 1-6. Strategie di mutagenesi e screening sono comuni in antibiotico sviluppo prodotto naturale a causa di difficoltà di coltura e / o manipolare geneticamente host di produzione nativi e causa dell&#39;attività prontamente disponibili antibiotico o fenotipi crescita migliori per facilitare la selezione. Nel caso di eritromicina A, S. erythraea è limitata da un profilo di crescita lenta e la mancanza di tecniche di manipolazione genetica diretta (relativa organismi come E. coli), quindi, ostacolando rapidi miglioramenti nella produzione e biosintesi di nuovi derivati. Dopo aver riconosciuto i problemi di produzione e sbloccato diversificatisulla possibilità con composti come eritromicina A, la comunità di ricerca ha iniziato a perseguire l&#39;idea della biosintesi eterologa (Figura 1) 7. Questi sforzi hanno coinciso con informazioni di sequenza disponibili per l&#39;eritromicina Un gene del cluster 8-11. Va sottolineato che il numero di sequenza cluster prodotto naturale complesso gene ha notevolmente ampliato 12-16, fornendo lo stimolo a proseguire gli sforzi biosintesi eterologa di accesso codificato potenziale medicinale. Per fare ciò, la ricostituzione eterologo richiede che il nuovo host soddisfare le esigenze della via di biosintesi specifico. E. coli fornisce la convenienza tecnico, una vasta gamma-spanning di tecniche di biologia molecolare, e le strategie di ingegneria metabolica e di processo per lo sviluppo del prodotto. Tuttavia, rispetto ai padroni di casa di produzione nativi, E. coli non presenta lo stesso livello di produzione complesso prodotto naturale. Era quindi noto se E. coli potrebbe servire come una valida opzione per il complesso eterologa biosintesi prodotto naturale. Tuttavia, si è ipotizzato che E. coli sarebbe un organismo ospite ideale se biosintesi eterologa potrebbe essere realizzato. Con questo obiettivo in mente, gli sforzi iniziali ha cominciato a produrre l&#39;aglicone polichetide 6 desossieritronolide B (6dEB) attraverso E. coli. Tuttavia, nativo E. metabolismo coli non potrebbe fornire livelli apprezzabili della propionil-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA precursori necessari per supportare biosintesi 6dEB né poteva il nuovo host post-traduzionale modificare il desossieritronolide B sintasi (DEBS) enzimi. Per porre rimedio a questi problemi, una via metabolica composto da enzimi nativi ed eterologhi è stato costruito in E. coli tali che esogenamente propionato è stato alimentato convertiti intracellularmente a propionil-CoA e quindi (2S)-metilmalonil-CoA, durante la progettazione di completare questo percorso, un gene sfp è stato posto in thcromosoma e di E. coli BL21 (DE3) per produrre un nuovo ceppo chiamato BAP1. L&#39;enzima SFP è in grado phosphopantetheinyl transferasi di attaccare il 4&#39;-phosphopantetheine cofattore per gli enzimi DEBS 17,18. I tre geni DEBS (ogni ~ 10 kb) sono state poi poste su due vettori di espressione inducibili separatamente selezionabili contenenti promotori T7. Dopo una chiave di regolazione post-induzione temperatura (a 22 ° C), i geni sono stati DEBS coordinately espressa all&#39;interno BAP1 in uno stato attivo in grado di generare 6dEB 19. Il perseguimento di eritromicina A pieno biosintesi poi ha iniziato ad usare un cluster analogo gene da Micromonospora megalomicea o un percorso ibrido composto da geni di S. erythraea, S. fradiae, e S. venezuelae che ha prodotto l&#39;intermedi eritromicina C e 6-deoxyerythromycin D, rispettivamente 20-22. Recentemente, il nostro gruppo ha esteso questi sforzi con la produzione di erythromycin A (la forma più clinicamente rilevante di eritromicina) attraverso E. coli. In contrasto con il lavoro precedente, la nostra strategia coordinately espresso il 20 originario di S. erythraea geni necessari per la biosintesi polichetide, biosintesi deoxysugar e l&#39;attaccamento, sartoria supplementare, e di auto-resistenza (Figura 2). In totale, 26 (nativo e eterologa) geni sono stati progettati per consentire E. coli per produrre eritromicina A a 4 mg / L 23,24. Questo risultato stabilito produzione completa di un complesso prodotto polichetide naturale con E. coli e serve come base per sfruttare questa nuova opzione di produzione o l&#39;esercizio di nuove.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> PCR macchina </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler personale </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Pescatore </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Elettroporatore </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Pescatore </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Propionato di sodio </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinosio </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Refrigerato Shaker </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifugare </td><td> Eppendorf </td><td> Centrifugare 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Chaperone Set Plasmid (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, PCDF-Duet-1 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Acetato di etile </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Vuoto centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> Concentrator 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Evaporatore rotante </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

La produzione eterologa di complessi prodotti naturali è un approccio progettato per affrontare le attuali limitazioni e le possibilità future. È particolarmente utile per quei composti che possiedono un valore terapeutico ma non può essere sufficientemente prodotto o trarrebbero beneficio da una nuova forma di produzione. Le procedure sperimentali oggetto può essere suddiviso in tre componenti: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione eterologa e 3) l&#39;analisi del prodotto. Ogni componente sperimentale è in fase di continua ottimizzazione per affrontare le sfide e anticipare le opportunità associati a questo approccio emergente. Biosintesi eterologa inizia con l&#39;identificazione di una sequenza genetica responsabile di un prodotto naturale. Trasferire questa sequenza in un ospite eterologo è complicata dalla complessità via biosintetica responsabile della formazione del prodotto. L&#39;antibiotico eritromicina A è un buon esempio. Venti geni (pari a&gt; 50 kb) sono necessari per la biosintesi eventuale. Inoltre, tre di questi geni codificano megasynthases, multi-dominio enzimi ciascuna ~ 300 kDa nella dimensione. Questo materiale genetico devono essere progettati e trasferiti E. coli per la biosintesi ricostituito. L&#39;uso di isolamento PCR, costruzione operone, multi-cystronic plasmidi, ed elettro-trasformazione sarà descritto nel trasferire l&#39;eritromicina Un cluster genetico E. coli. Una volta trasferita, la E. coli cella deve supportare biosintesi finale. Questo processo è anche impegnativo viste le differenze sostanziali tra E. coli e la maggior parte dei padroni di casa originali responsabili della complessa formazione del prodotto naturale. La cella deve fornire substrati necessari a sostenere la biosintesi e coordinately esprimere il cluster trasferito genetica di produrre enzimi attivi. Nel caso di eritromicina A, la E. coli cella doveva essere progettato per fornire i due precursori (propionyl-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA) necessari per la biosintesi. Inoltre, le modifiche di sequenze genetiche, il numero di copie del plasmide, chaperonin co-espressione, post-traslazionale modifica enzimatica, e la temperatura di processo sono stati anche tenuti a consentire eritromicina finale Una formazione. Infine, la produzione di successo deve essere valutata. Per l&#39;eritromicina Un caso, presenteremo due metodi. La prima è la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) per confermare e quantificare la produzione. La bioattività di eritromicina A sarà inoltre confermata mediante uso di un saggio biologico in cui viene testata l&#39;attività antibiotica contro il Bacillus subtilis. I saggi di valutazione stabiliscono eritromicina A biosintesi da E. coli e posto le basi per i futuri sforzi di progettazione per migliorare o diversificare la produzione e per la produzione di nuovi composti naturali complessi che utilizzano questo approccio.

Il risultato desiderato di questo approccio è la produzione di un prodotto completamente naturale bioattivo dalla E. coli eterologhi host. Questo è meglio rappresentato dalle LC-MS risultati utilizzati per confermare e quantificare produzione (Figura 6) e il biotest antibatterico utilizzato per confermare l&#39;attività finale (Figura 7). Nello schema generale della biosintesi eterologa, questo risultato definisce il successo. Una volta realizzato, gli sforzi di ricerca per ...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

La biosintesi eterologa di eritromicina A attraverso<em&gt; E. coli</em&gt; Comprende le seguenti fasi sperimentali: 1) trasferimento genetico, 2) ricostituzione eterologa, e 3) l&#39;analisi del prodotto. Ogni passo verrà spiegato nel contesto della motivazione, potenziale, e sfide nella produzione di prodotti terapeutici naturali usando<em&gt; E. coli</em&gt; Come host surrogato.

La logica, passaggi sperimentali, e le potenzialità di eterologa Biosintesi prodotto naturale Con l&#39;antibiotico Eritromicina Complesso A prodotti attraverso<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K Views.  State University of New York at Buffalo. La biosintesi eterologa di eritromicina A attraverso E. coli Comprende le seguenti fasi sperimentali: 1) trasferimento genetico, 2) ricostituzione eterologa, e 3) l'analisi del prodotto. Ogni passo verrà spiegato nel contesto della motivazione, potenziale, e sfide nella produzione di prodotti terapeutici naturali usando E. coli Come host surrogato.

Video: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Trasformazione del DNA plasmidi in E. coli con il metodo Heat Shock

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Ricerca

Biologia

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

L&#39;elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissezione lordo dello Stomaco del Gambero, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

Produzione di Norovirus umani sporgenti Domini in<em&gt; E. coli</em&gt; Per la cristallografia a raggi X

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Indurre un blocco di replica siti specifici in<i&gt; E. coli</i&gt; Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

Visualizzazione e quantificazione del potenziale di differenziazione delle cellule mesenchimali adipogenico con un Marker specifico lignaggio

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon bactericidal antibiotic treatment, the bulk of the bacterial population is rapidly killed. This first rapid phase of killing is followed by a substantial decrease in the rate of killing as the persister cells remain viable. Classically, persistence is determined at the population level by time/kill assays performed with high doses of antibiotics and for defined exposure times. While this method provides information about the level of persister cells and the killing kinetics, it fails to reflect the intrinsic cell-to-cell heterogeneity underlying the persistence phenomenon. The protocol described here combines classical time/kill assays with single-cell analysis using real-time fluorescence microscopy. By using appropriate fluorescent reporters, the microscopy imaging of live cells can provide information regarding the effects of the antibiotic on cellular processes, such as chromosome replication and segregation, cell elongation, and cell division. Combining population and single-cell analysis allows for the molecular and cellular characterization of the persistence phenotype.

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Antibiotic persistence describes the ability of small subpopulations within a sensitive isogenic population to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. The present protocol combines approaches to characterize the antibiotic persistence phenotype at the molecular and cellular levels after exposing Escherichia coli to lethal doses of ofloxacin.

Analisi di popolazione e monocellulare della persistenza antibiotica in Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...