Questo lavoro è stato supportato dal progetto VENOMICS, concessione progetto europeo N ° 278346 attraverso il Settimo programma quadro (7 ° PQ HEALTH 2011-2015). Il progetto VENOMICS è una collaborazione tra diversi istituti di ricerca e aziende in Europa: AFMB, Aix-Marseille Université (Francia), CEA Saclay (Francia), NZYTech (Portogallo), SistemasGenomicos (Spagna), Università di Liegi (Belgio), VenomeTech (Francia), Vitamib (Francia), Zealand Pharma (Danimarca) Questo lavoro è stato supportato dal Infrastructure francese per la Biologia Integrata strutturale (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il Sig. Jeremy Turchetto per aiutare con i preparativi per le riprese del video.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Non esiste un protocollo universale unico per l&#39;espressione di, piegato, proteine ​​funzionali solubili. Per essere costi e in tempi rapidi, la maggior parte dei laboratori o strutture di base delle proteine ​​che lavorano con obiettivi multipli utilizzano quindi alta espressione della proteina Throughput Screening per trovare la migliore combinazione &#39;generico&#39; di variabili per ottenere una proteina solubile attivo per la maggior parte degli obiettivi. Abbiamo identificato DsbC come partner di fusione generalmente applicabile per l&#39;espressione solubile di peptidi e proteine ​​11 ricco di disolfuro. Uso fusioni DsbC e metodi high throughput, entro una settimana l&#39;espressione solubile di bersagli multipli può essere osservato 11 e poi ulteriori variabili, come quelli discussi nell&#39;introduzione, può essere proiettato nei turni successivi su quei bersagli che richiedono ulteriore ottimizzazione. I protocolli qui descritte sono finalizzate alla espressione di proteine ​​e peptidi ricchi di disolfuro. Tuttavia, per gli utenti che desiderano express proteine ​​non reticolari in un alto modo di throughput, i protocolli corrispondenti sono stati pubblicati in precedenza e può essere trovato altrove 22,24. La configurazione high throughput è ideale per una serie di applicazioni, tra cui lo screening di un gran numero di differenti proteine ​​di espressione solubile o lo screening di un gran numero di costrutti di espressione (compresi i tag vari fusione) per diversi geni bersaglio contemporaneamente ( o l&#39;espressione più costruisce per un singolo bersaglio) al fine di migliorare il tasso di successo. La piattaforma può essere utilizzato anche per l&#39;analisi comparativa e validazione di nuovi protocolli su un gran numero di bersagli. Altre applicazioni includono la proiezione di varianti per un singolo bersaglio difficile, ad esempio, tutti ortologhi o membri di una stessa famiglia, o per verificare il successo della produzione di un pannello di mutanti di un singolo bersaglio in un esperimento. Questo protocollo è stato utilizzato anche in combinazione con vettori co-espressione (spiritoh uno tagged proteine ​​solo) per consentire il pull down e caratterizzazione preliminare di complessi proteina-proteina seguita da un&#39;analisi più approfondita biofisica per confermare la corretta formazione complessa e stechiometria 33. La quantità di proteina purificata è talvolta indicato per micro-test (test funzionali, proteina-DNA 34 o proteina-proteina Prove di interazione). Ci sono diversi vantaggi per l&#39;high throughput screening strategia espressione: (i) la possibilità di testare un gran numero di bersagli o un gran numero di variabili in un singolo esperimento, (ii) limitata variazione da lotto a lotto, (iii) l&#39; semplicità e la facilità di lavorare ad una scala ridotta utilizzando profondi pozzi, (iv) la scalabilità e la riproducibilità su scala più ampia, (v) la possibilità per l&#39;automazione, e (vi) la semplicità di monitoraggio e di manutenzione (senza etichettatura dei singoli tubi, meno errori introdotti quando si utilizza il formato lastra che con la manipolazione di singoli tubi in miscela o scambio di cloni). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Sebbene non discusso nella sezione del protocollo, ci sono diverse considerazioni importanti per la preparazione dell &#39;esperimento che verrà discusso brevemente di seguito. Per una discussione più approfondita si veda il nostro precedente pubblicazione 24. Per la massima efficienza, è utile avere un sistema adeguato per la clonazione alto rendimento, per semplificare la sub-clonazione di un gran numero di obiettivi. Per la fase iniziale del progetto VENOMICS, utilizziamo il versatile sistema di ricombinazione Gateway 25 che permette subcloning in qualsiasi vettore destinazione ad un ritmo di centinaia di cloni settimana. Protocolli per Gateway clonazione ricombinazione possono essere trovati sul sito web di Invitrogen. Altre alternative per la clonazione throughput elevato includono legatura-indipendente clonazione (LIC) 35,36 e senza restrizioni (RF) clonazione 37. Ci sono diversi modi per ottenere i geni bersaglio per l&#39;espressione, anche mediante PCR da DNA stampo, da ingresso collezioni clone o comegeni sintetici, che è la strategia scelta per il progetto VENOMICS. Geni sintetici possono essere ordinati con siti di ricombinazione su ciascuna estremità della sintesi gene e gene permette una facile ottimizzazione codone della sequenza del gene bersaglio (per escludere rare codoni di E. coli). Questo è consigliato ma non indispensabile. Per obiettivi senza ottimizzazione codone che contengono un elevato numero di codoni rari, Rosetta 2 (DE3) pLysS (che svolge tRNA rare codoni che non sono espressi in E. coli) può essere più adatto di BL21 (DE3) pLysS. Mentre ci sono ceppi disponibili che limitano la riduzione dei legami disolfuro nell&#39;ambiente normalmente riducente del citoplasma, nelle nostre mani non hanno avuto successo come regolare E. coli ceppi 11. Bilancia analitica purificazione per affinità è eseguita dalle colture espressione prova al fine di recuperare le proteine ​​di fusione solubili e quantificare i rendimenti. I dati quantitativi possono essere ottenuti on the rese solubili di proteine ​​di fusione espresse in un intervallo di 0,1-100 mg / L di cultura. Se un bersaglio non è solubile, di espressione e induzione temperature, ceppi o media alternativi possono essere testati prima di diversi partner di fusione vengono perseguiti. Per l&#39;espressione solubile di proteine ​​ricche di disolfuro, abbiamo precedentemente in classifica l&#39;effetto di partner di fusione come DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-tag per l&#39;espressione citoplasmatica 11. Espressione periplasmatico è un&#39;altra possibilità che può aiutare la piegatura successo degli obiettivi ricchi di disolfuro. Periplasma è un ambiente meno riducendo del citoplasma e contiene chaperon redox utili che facilitano il legame solforico. DsbC, DsbA, e MBP proteine ​​sono normalmente localizzati nel periplasma dalle loro sequenze segnale periplasmatiche. Ciò fornisce la possibilità di sfruttare questi tag per dirigere gli obiettivi ricchi di disolfuro di spazio periplasmatico per assistere piegatura. Per gli obiettivi intrattabili, il passo successivo sarebbe quello di purify il insolubile obiettivo HIS-tagged dai corpi di inclusione, solubilizzare e ripiegare (questo è fuori della portata di questo protocollo e non sarà discusso qui 3 9). Questo può essere abbastanza semplice per gli obiettivi con solo uno o due legami disolfuro, ma diventa sempre più difficile quanto il numero di legami disolfuro aumenta. In alternativa, e in particolare per le proteine ​​e peptidi con quattro o più legami disolfuro, può essere utile per provare sistemi di produzione più complessi come lievito, di insetto o di espressione di mammifero. Con i progressi nella miniaturizzazione e l&#39;automazione, tecnologie HTP elettrofisiologia lab-on-a-chip 28 sarà senza dubbio la via del futuro per analisi funzionali. Prevediamo che per la maggior parte degli scopi (forse con l&#39;eccezione di studi strutturali) questo negare la necessità di colture su larga scala. Colture su piccola scala non sarà solo utile per lo screening delle condizioni di espressione, ma anche essere in grado di fornire sufciente quantità di campione per questi test funzionali miniaturizzati. La capacità di produrre più bersagli in parallelo in quantità sufficiente per la caratterizzazione funzionale ridurrà i costi di coltura ed utilizzando questi tipi di piattaforme, espressione e caratterizzazione di proteine ​​ricombinanti diventeranno più costo e tempo efficace. I protocolli qui sono state applicate alla espressione di peptidi e proteine ​​ricche di disolfuro nella fase iniziale del progetto FP7 europeo VENOMICS. Veleni sono una fonte eccellente di peptidi bioattivi che spesso hanno interessante potenziale farmacologico. Tuttavia, la loro produzione è impegnativo a causa dei loro complessi modelli di disolfuro di legame e di piccole dimensioni. Utilizzando piattaforme high-throughput come quello qui descritto, il progetto VENOMICS mira a generare una libreria di 10.000 nuovi peptidi veleno per riprodurre la diversità osservata in natura. Questa libreria verrà sfruttata per la caratterizzazione di disolfuro-rpeptidi ich con potenziale farmacologico o applicazioni terapeutiche con l&#39;obiettivo di sviluppare nuovi farmaci. La piattaforma è attualmente utilizzato per l&#39;analisi comparativa e convalidare nuovi protocolli per l&#39;uso nel progetto VENOMICS.

Motivati ​​dal progresso della genomica e accelerare il tasso di scoperta di nuove proteine, gasdotti ad alta velocità effettiva sono stati sviluppati per parallelizzare approcci tradizionali per lo screening e l&#39;identificazione di strategie ottimali di produzione di proteine. Potenziali variabili da ottimizzare includono, ma non sono limitati a, l&#39;espressione varia ceppi 1,2, temperatura di 3,4, 2,3 dei media, bersaglio varianti 5, partner di fusione 6-13, co-espressione con accompagnatori 14,15, citoplasmatica o espressione 16-18, e tampone purificazione componenti periplasmatiche 3. Implementando approcci di throughput elevati, molte variabili o più bersagli possono essere testati in parallelo con un elevato livello di efficienza, limitando variazione da lotto a lotto. Nella nostra esperienza, la strategia dà anche una buona riproducibilità su scala industriale utilizzando la stessa cultura (temperatura, media, aerazione, ecc) e le condizioni di depurazione (stessa resin, tamponi, ecc.) Diverse piattaforme high throughput sono stati utilizzati in passato decennio per identificare le condizioni per l&#39;espressione della proteina solubile, cioè attraverso diversi parametri come partner di fusione, ceppi espressione o temperatura 19-23. Recentemente abbiamo usato il nostro metodo di screening ad alta produttività per l&#39;espressione di ricco-disolfuro proteine ​​solubili 11. Le proteine ​​selezionati non erano solo da fonti velenosi, ma comprendevano anche ricco di disolfuro inibitori enzimatici da una vasta gamma di specie tra piante, maiali, mucche e gli esseri umani. L&#39;esperimento ha confrontato gli effetti di 12 diversi partner di fusione e di tre diversi ceppi di espressione sulla solubilità e la piegatura di 28 proteine ​​disolfuro-reticolato. Abbiamo dimostrato che utilizzando DsbC come partner di fusione per la produzione del ceppo BL21 (DE3) pLysS notevolmente outproduced (sia resa e numero di proteine ​​solubili ottenuti) qualsiasi altra combinazione di deformazione e fusione testata 11. Ilrisultati di questo esperimento si è basata adattare nostra conduttura originale generale throughput elevato (che è stato utilizzato per lo screening espressione di una vasta gamma di proteine) 22,24 in uno più adatto per l&#39;espressione di bersagli ricchi di disolfuro. Proteine ​​ricche di disolfuro di veleni animali sono di particolare interesse. Veleni sono una miscela complessa di peptidi bioattivi e proteine, con valore potenziale farmacologicamente e terapeuticamente. Tuttavia, l&#39;espressione di proteine ​​disolfuro obbligazionari contenenti non è banale. Queste proteine ​​contengono generalmente tra 1-7 legami disolfuro, e devono essere ossidati con i corretti modelli disolfuro-bonding per essere attivi. Attualmente, la piattaforma viene utilizzato per lo screening di espressione di un gran numero di proteine ​​veleno animale ricchi di disolfuro nell&#39;ambito del Progetto FP7 VENOMICS europeo (www.venomics.eu) e comparativa nuovi protocolli per l&#39;espressione ad alto rendimento di migliaia di bersagli . Qui, un metodo automatizzatoè previsto per alta velocità su piccola scala di screening espressione e purificazione (vedi Figura 1) applicato alle proteine ​​animali veleno disolfuro-ricco. La strategia per disolfuro ricchi peptidi e proteine ​​utilizza una HIS-tag per la purificazione e il partner di fusione redox-attiva, DsbC, creando scindibili fusioni HIS-DsbC alle proteine ​​bersaglio (vedi Figura 2). Mentre l&#39;attenzione dei protocolli è qui automazione mediante elettroforesi robot e HTP gestione di liquidi, questi metodi sono adatti anche per un approccio manuale elevato throughput, il che significa che anche i laboratori con una configurazione di base possono usufruire dei protocolli, senza alcuna condizione preliminare per costose attrezzature . Protocolli manuali per la trasformazione di purificazione e analisi (non specifico alle proteine ​​ricche di disolfuro) sono stati pubblicati altrove 24 e non saranno ripetuti qui. La velocità della procedura manuale (dall&#39;espressione clone, prodotto dalla ricombinazioneclonazione nazionale 25, all&#39;analisi dei livelli di proteina solubile) è 96 (utilizzando l&#39;individuazione SDS-PAGE) o 384 (4 x 96; usando dot blot e SDS-PAGE 26) colture a settimana (vedere Figura 1). Questo può essere aumentato se eseguita in modo semi-automatico (usando un robot manipolatore liquido e dot blot 26 o elettroforesi HTP, ad esempio con un sistema Pinza GXII LabChip 22 per l&#39;analisi dei risultati) per un massimo di 1.152 (12 x 96) colture in parallelo superiori a una settimana, come descritto nel presente documento. Coltivazione viene eseguita in pozzo profondo 24 formato (DW24) in modo che regolari incubatori stringono possono essere utilizzati in contrasto con colture cresciute in pozzo profondo formato 96 (DW96), che necessitano l&#39;uso di brevi orbitali incubatori ad alta velocità di agitazione per aerazione sufficiente (scuotimento 800 rpm). L&#39;utilizzo di mezzi di auto-induzione 27 semplifica anche espressione, eliminando la fase di induzione manuale. Anche quando i laboratori utilizzano già espressione e puri pre-definiticondizioni cazione, questi possono essere trasferiti direttamente in questo sistema HTP semplicemente per migliorare l&#39;efficienza. Uno schema dettagliato del throughput elevato pipeline di screening per le proteine ​​ricche di disolfuro è fornita in Figura 3. I parametri del gasdotto sono stati selezionati sulla base di ampi esperimenti di screening 11, 22, che ci ha permesso di scegliere le condizioni più utili per la produzione di proteine. Caratterizzazione può essere eseguita su proteine ​​purificate con targhetta direttamente dalle espressioni di piccole dimensioni in studi pilota, dove decine di microgrammi di campione è sufficiente, o per saggi funzionali sensibili e saggi di legame (ad esempio, sistemi a basso volume di patch clamp HTP 28). Lo stesso può anche essere eseguita sugli obiettivi senza tag dopo la scissione, a condizione che l&#39;etichetta e la proteasi sono stati rimossi (per esempio, mediante HPLC in fase inversa). Il controllo di qualità può essere eseguita anche mediante spettrometria di massa (per confermare la dimensione prevista e ossidazione stmangiato) o metodi cromatografici (per confermare purezza o eterogeneità) 29. Talvolta tag scissione è inutile o addirittura indesiderabile (in particolare per le proteine ​​scarsamente solubili 30,31), quindi in questo scissione protocollo è facoltativo. Indipendentemente, in tutti i costrutti vi è un sito di scissione della proteasi TEV (ENLYFQ / [G] 32) immediatamente precedente il gene bersaglio per produrre proteina nativa dopo taglio (vedi figura 2 e Discussione). Se si desidera scissione del tag di fusione, scissione può essere testato (sulla frazione di eluizione o &#39;a colonna&#39;) alla piccola scala per analizzare l&#39;efficienza, ottimizzare le condizioni se necessario e di ottenere stime attendibili dei rendimenti per esperimenti di scale-up successivi. Ci sono due opzioni per il volume di perline utilizzati durante la purificazione per affinità, a seconda degli obiettivi e aspettative dell&#39;esperimento. Per essere in grado di catturare più proteine ​​possibile (per purificare per saggi pilota o MS, o per extrapolmangiato per rendimenti di scale-up) un volume finale di 200 ml di resina deve essere utilizzato, permettendo la rilevazione di proteine ​​solubili nell&#39;intervallo 1-100 mg / L cultura prima saturazione del sistema (vedere protocollo (A) al punto 8.1) . Tuttavia, se l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento è il rilevamento di basse quantità di proteine ​​solubili quindi un volume finale di 50 ml di resina è adatto, permettendo la rilevazione di proteine ​​solubili nell&#39;intervallo 0,1-25 mg / L di coltura (vedi protocollo (B ) nella sezione 8.2). La produzione può essere scalata, se necessario, per ottenere quantitativi milligrammi di bersagli purificati per ulteriori studi strutturali e funzionali utilizzando le condizioni identificate per l&#39;espressione solubile. I dettagli dei protocolli scale-up usati a AFMB sono stati discussi altrove 22,24. Ulteriori dettagli relativi al setup sperimentale, fasi critiche all&#39;interno del protocollo, le modifiche e la risoluzione dei problemi e limiti della tecnica sono forniti nel discoussion. Si prega di leggere la discussione prima di iniziare gli esperimenti. Durante i protocolli ci aspettiamo un tasso di successo del 90% ad ogni passo (per esempio, almeno il 90% delle colture deve crescere in ogni fase). Se il tasso di successo di ogni fase dell&#39;esperimento scende al di sotto del 90% i campioni vengono scartati e l&#39;esperimento viene ripetuto per l&#39;intera collezione di costrutti. Tuttavia, questo tasso di successo non è applicabile al numero di costrutti che esprimono proteine ​​solubili o la percentuale di costrutti che solcano con un&#39;efficienza del 100%, in quanto questo sarà fortemente dipendente dalle proteine ​​testate. I dettagli specifici per il set-up del piano di lavoro del robot sono forniti per ciascun protocollo (vedi anche figura 4), ​​ma possono essere adattati come richiesto per tabella di lavoro alternativo set-up. L&#39;hardware robot (Tecan) è costituito da un braccio di 96-multicanale (MCA96), manipolatore robotico (Roma) e 8 canali di gestione dei liquidi di testa (LiHa). Tutti i passi che utilizzano il MCA96 possono essere eseguite anche utilizzando il LiHa se un MCA96 non è disponibile, tuttavia ci vorrà più tempo perché il LiHa avrà bisogno di essere lavati tra i passaggi. Mentre il robot non è tecnicamente un ambiente sterile, l&#39;inclusione di antibiotici generalmente assicura che non ci sono problemi di contaminazione o sterilità.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

Escherichia coli (E. coli) è il sistema di espressione più utilizzato per la produzione di proteine ​​ricombinanti per studi strutturali e funzionali. Tuttavia, purificare proteine ​​è talvolta difficile poiché molte proteine ​​sono espresse in una forma insolubile. Quando si lavora con obiettivi difficili o multipli pertanto si consiglia di utilizzare un elevato throughput (HTP) controlli l&#39;espressione proteica su piccola scala (1-4 ml culture) per identificare rapidamente le condizioni per l&#39;espressione solubile. Per far fronte ai vari programmi strutturali genomica del laboratorio, una quantitativa (in un intervallo di 0,1-100 mg / L cultura della proteina ricombinante) e proteina HTP protocollo di screening espressione è stato implementato e validato su migliaia di proteine. I protocolli sono stati automatizzate con l&#39;uso di un robot manipolatore liquido, ma possono anche essere eseguite manualmente senza attrezzature specializzate. Proteine ​​del veleno ricco di disolfuro stanno guadagnandocrescente riconoscimento per il loro potenziale come lead terapeutiche di farmaco. Possono essere molto potente e selettivo, ma le loro reti legame disolfuro complesse renderli difficili da produrre. Come membro del progetto europeo FP7 Venomics ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), la nostra sfida è quella di sviluppare strategie di produzione di successo con l&#39;obiettivo di produrre migliaia di proteine ​​del veleno nuovi per la caratterizzazione funzionale. Aiutato dalle proprietà redox di legame disolfuro isomerasi DsbC, abbiamo adattato la nostra pipeline di produzione HTP per l&#39;espressione del ossidati, peptidi veleno funzionali del E. citoplasma coli. I protocolli sono applicabili alla produzione di diverse proteine ​​ricche di disolfuro anche. Qui mostriamo nostra conduttura applicata alla produzione di proteine ​​del veleno animale. I protocolli descritti nel presente documento è probabile che le proteine ​​ricche di disolfuro solubili saranno ottenuti in appena una settimana. Anche da una piccola scala, esiste la possibilità di utilizzare the proteine ​​purificate per convalidare lo stato di ossidazione mediante spettrometria di massa, per la caratterizzazione in studi pilota, o sensibili micro-saggi.

Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 6 per lo screening dell&#39;espressione di 96 ricchi di proteine ​​disolfuro dalla pipeline VENOMICS. Le proteine ​​sono disposte aumentando il numero di legami disolfuro poi crescente numero di residui. I peptidi sono stati espressi nel citoplasma con una HIS-tag e DsbC partner di fusione. Quando si utilizzano le condizioni di coltura raccomandate, un OD 600 del 12 si ottiene normalmente. I peptidi sono stati purificati utilizzando il protocollo 8.2-B con un volume finale di 50 ml di nichel resina di affinità, quindi un massimo di proteina ~ 25 mg / L di fusione potrebbe essere rilevato in questo esperimento. Figura 6A mostra il risultato elettroforesi dal sistema Pinza LabChip (mostrando la fusione prima scissione) e il sistema di punteggio basato su estrapolazione di cedere in mg / L cultura della proteina di fusione (in livelli da 0,1 a 2 mg / L cultura, 2 a 10 mg / L cultura, da 10 a 25 mg / L cultura e nessun<html> t rilevato.) Si noti che il tag DsbC spaccati normalmente funziona a circa 32 kDa, piuttosto che 27 kDa come previsto. Allo stesso modo, le fusioni DsbC anche eseguire circa 5 kDa superiori alle attese. Per molti obiettivi non solo vediamo la fusione intatta (banda superiore), ma anche il compagno di fusione solo (banda inferiore). Per alcuni di questi obiettivi ottimizzando le condizioni di coltura può migliorare il rapporto della fusione intatta (banda superiore) rispetto alla sola DsbC consentendo un aumento della resa finale. Il punteggio è basato solo sul piano della fusione intatta. Solo 16 su 96 proteine ​​non potevano essere rilevati a livello di fusione. Questo corrisponde ad un livello di successo complessivo del 83%. Delle 80 proteine ​​che potrebbero essere rilevati, 45 di queste sono state rilevate a livelli maggiori di 2 mg / L cultura (56%). A seconda del bersaglio e fusione, rese di proteine ​​sono di solito nell&#39;intervallo 2-100 mg / L cultura (sebbene in questo esempio utilizzando il protocollo 8.2 B un massimo di proteina ~ 25 mg / L di fusione può essere rilevata). t &quot;&gt; L&#39;analisi del successo per numero di ponti disolfuro presenti (Figura 6B) mostra ragionevole successo per tutti i numeri di legami disolfuro testate (tra 1 e 7), con il livello di successo più basso è il 66% per le destinazioni contenenti 6 disolfuro obbligazioni. L&#39;analisi della distribuzione di successo espressione in base al punto isoelettrico e numero di residui (Figura 6C) mostra alcun pregiudizio particolare per la tecnica, con obiettivi sia non rilevate sparsi trama espressi con successo. Figura 6D mostra un esempio dei risultati ottenuti dalla spettrometria di massa spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) per un singolo bersaglio, prima e dopo la riduzione del campione con DTT. Normalmente, tale analisi esaustiva spettrometria di massa non dovrebbe essere eseguita (un campione ridotto non avrebbe bisogno di essere analizzato), ma ai fini della demonstratio approfonditan abbiamo dimostrato entrambi i risultati. L&#39;obiettivo indicato è un ricco di disolfuro di proteine ​​del veleno 5,7 kDa con 4 ponti disolfuro. Lo spettro a sinistra mostra i risultati per la proteina prima della riduzione con DTT, come dopo clivaggio e dissalazione senza ulteriori interventi. Lo spettro sul lato destro mostra la proteina dopo la riduzione con DTT seguita da demineralizzazione per eliminare ogni eccesso DTT. Gli ioni corrispondenti alle masse sperimentali sono contrassegnati con frecce sullo spettro e la designazione per ogni ione è mostrato in verde. Le masse progenitrici sperimentali calcolati per questi ioni (per la proteina prima della riduzione (-DTT) e dopo la riduzione (+ DTT)) sono riportati nella tabella. Le masse (5709,6 Da per campione prima riduzione e 5717,6 Da per campione ridotto) presentano una differenza di massa 8 bis. Una differenza di massa 2 Da corrisponde alla presenza di 1 legame disolfuro ossidato, quindi una differenza di massa 8 Da indica la presenza di 4 ponti disolfuro (come previsto) inil campione non ridotto. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo di screening espressione elevato throughput. Usando questo protocollo, 96-384 condizioni possono essere provati da una sola persona in una settimana con metodi manuali, o fino a 1152 condizioni con il descritto attrezzature semi-automatico. Plasmidi di espressione sono costruiti utilizzando una tecnologia di clonazione ricombinazione modo che numerosi obiettivi possono essere sub-clonate in una sola volta. Condizioni di espressione volta solubili sono stati identificati e scissione effettuate, se lo si desidera, la proteina in grado di procedere al controllo di qualità per controllare l&#39;ossidazione e la purezza, microassays e / o di produzione su larga scala. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 2. Schema per clonazione ricombinazione universale e costruire disegno. Dai cloni voce di destinazione, più vettori di espressione possono essere sub-clonate in un singolo esperimento in modo velocità elevata (fino a 6 x 96 cloni di ingresso in una settimana). La proteina espressa codifica una HIS tag per il nichel purificazione per affinità. Il DsbC (privo sua sequenza segnale periplasmic per espressione citoplasmatica) partner di fusione è usato per aumentare la solubilità e / o aiuti piegatura e corretta ossidazione della proteina bersaglio. Si noti che la sequenza codificante obiettivo dovrebbe contenere un sito di TEV proteasi N-terminale (ENLYFQ) se tag scissione si desidera. L&#39;inserto in alto a sinistra mostra la produzione dei cloni ingresso utilizzando un vettore donatore e le sequenze bersaglio, che può essere ottenuta tramite PCR o sintesi del gene. Cloni di ingresso possono essere ottenuti anche da collezioni commerciali clone di ingresso. Molteplici sistemi di clonazione ricombinazione sono disponibili, tuttavia utilizziamo il syste Gatewaym, come mostrato nello schema. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Alta velocità pipeline di screening per più destinazioni ricche di disolfuro. Obiettivi sono inizialmente espressi come fusioni HIS-DsbC nel citoplasma di BL21 (DE3) pLysS E. coli a 37/17 ° C con medie di auto-induzione (zyp-5052). La purificazione viene eseguita su resina nichel seguito da rilevamento dei costrutti solubili mediante elettroforesi HTP (o con dot blot / SDS-PAGE). Se il primo turno di selezione espressione è riuscita, condizioni di coltura alternativi sono provati. Se costrutti producono proteine ​​solubili in rendimenti abbastanza elevati, microassays e controllo di qualità può essere eseguito e, se necessario, la produzione su larga scala può essere perseguito. Per le destinazioni dove i rendimenti solubili non sono abbastanza alti, lo screening espressione può continuare con stra alternativains e le temperature poi altri partner di fusione e di espressione periplasmica. Passaggi facoltativi sono indicati da caselle tratteggiate. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Configurazione Robot Piano di lavoro per la piattaforma HTP. Il layout del nostro liquido movimentazione robot tavola portapezzo è mostrato, sebbene worktables alternative possono anche essere utilizzati purché ci sono siti equivalenti disponibili. L&#39;installazione consiste in una stazione di lavaggio (WS) per il (8 canali testa di gestione dei liquidi (LiHa)), due vettori micropiastra con 4 posizioni di ciascuno (MP4, posizioni 1-4 e 5-8), una stazione di vuoto con 2 posizioni (Te-Aspiratori, posizioni 9 e 10), un vettore micropiastra con 3 posizioni (MP3, le posizioni 11-13), due agitatori piastra con 2 posizioni di ciascuno (Te-Shakers, le posizioni 14-15 e 16-17) e un vettore per le punte monouso con 3 posizioni (Diti, posizioni 18-20). Inoltre l&#39;re sono due vettori hotel pozzetti profondi e uno per micropiastre (non mostrato). L&#39;hardware installato sul robot liquido di trattamento è un braccio di 96-multicanale (MCA96) per l&#39;utilizzo con punte monouso, un 8 canali di gestione dei liquidi testa (LiHa) con punte fisse e un manipolatore robotico (Roma), che si muove piastre / attrezzature giro su il piano di lavoro. La numerazione delle posizioni è indicato tutto il protocollo. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Schema per il trasferimento da una singola piastra a 96 pozzetti in quattro piastre da 24 pozzetti. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Risultati rappresentativi sono indicati per la schermata di espressione di 96 ricchi di disolfuro veleno proproteine. Le proteine ​​sono state espresse come fusioni HIS-DsbC nel citoplasma e purificato utilizzando 50 ml di resina Nickel (protocollo 8.2-B). A) Espressione di screening risultati, mostrando gel virtuale e segnando per la resa di espressione. Il contrasto nel gel virtuale è stato regolato corsia a corsia per compensare bande molto deboli o intensi. Si noti che per alcuni target due bande possono essere visti, la banda superiore corrispondente alla proteina di fusione intatta e la banda inferiore corrispondente al tag fusion solo. B) La proporzione di proteine ​​espresse a ciascun livello di espressione rispetto al numero di legami disolfuro in la proteina. Il numero effettivo di proteine ​​in ciascun gruppo è sovrapposto sul grafico. C) La distribuzione dei livelli di espressione in base al punto isoelettrico (pI) e il numero di residui. D) Un esempio dei risultati di spettrometria di massa per un ricco di disolfuro veleno 5,7 kDa proteina con 4 ponti disolfuro. Lo spettro susinistra mostra la proteina prima della riduzione con DTT e lo spettro sul lato destro indica la proteina ridotta con DTT e poi dissalato. Gli ioni corrispondenti alle masse sperimentali sono contrassegnati con frecce e loro assegnazioni sono visualizzati in verde. Le masse sperimentali per la proteina prima riduzione e dopo la riduzione sono riportati nella tabella e mostrano una differenza di massa di 8 Da, corrispondente alla presenza di proteine ​​ossidate prima aggiunta di agente riducente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Ricetta </td><td> Commento </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g di triptone 5 g di estratto di lievito Acqua 925 ml </td><td> Mescolare e poi autoclave per sterilizzare. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO 4 </td><td> 100 ml 49.3 g MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 ml di acqua </td><td> Mescolare fino a scioglimento poi in autoclave per la sterilizzazione. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g di glicerolo 730 ml di acqua 25 g di glucosio 100 g α-lattosio </td><td> Aggiungere in sequenza, mescolate a fuoco fino a quando tutti disciolto poi in autoclave per la sterilizzazione. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L Acqua 900 ml 66 g (NH 4) 2 SO 4 136 g KH 2 PO 4 142 g di Na 2 HPO 4 </td><td> Aggiungere in sequenza e mescolare fino a quando tutto dissolto allora autoclave per la sterilizzazione. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Ricetta per i componenti di media zyp-5052.

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Un protocollo per l&#39;espressione elevato throughput screening e quantitativa analitica purificazione di proteine ​​di fusione di piccoli culture Escherichia coli è descritto ed applicato alla espressione di proteine ​​bersaglio veleno animale ricchi di disolfuro.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

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Research

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Biology

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

23.9K Views.  Aix-Marseille Université.  Un protocollo per l'espressione elevato throughput screening e quantitativa analitica purificazione di proteine ​​di fusione di piccoli culture Escherichia coli è descritto ed applicato alla espressione di proteine ​​bersaglio veleno animale ricchi di disolfuro. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Ricerca

Biologia

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Purificazione non-cromatografico di polipeptidi di elastina ricombinante simili e le loro fusioni con Peptidi e Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

High-throughput Titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged proteina ricombinante Shadoo Espresso come corpi di inclusione in<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine prodotte in