L&#39;etichettatura, ibridazione, e protocolli di lavaggio nel presente documento contiene alcune modifiche a quelli sviluppati in precedenza dal Dr. J. Quackenbush mentre presso l&#39;Institute for Genomic Research (TIGR), il dottor Shawn Levy al Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e il Dr. Rob Alba mentre al Boyce Thompson Institute, (ITV) Cornell University.

(Nota sezioni 1 - 4 Non dimostrato in video) Preparazione Cy-etichetta target cDNA Quello che segue è il protocollo che usiamo per la sintesi di cDNA da RNA pino loblolly totale e indiretta etichettatura cDNA microarray prima di ibridazioni. Anche se pochi, non banali sono state apportate modifiche, il protocollo sottostante è simile a quello nel manuale di istruzioni fornito con il kit SuperScript Invitrogen indiretta Etichettatura cDNA. Parte 1: Prima Strand reazione di sintesi del DNA <ol><li> Mescolare e girare brevemente ogni componente del kit prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare le reazioni come segue: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl RNA totale, 20 mcg / reazione (pretrattati con Ambion Turbo DNasi) </li><li> 2μl Ancorato Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> 1ml Primer esamero casuale </li><li style="list-style:none;"> Volume totale = 18μl </li></ul></li><li> Incubare le provette a 70 ° C per 5 minuti, e poi posto in ghiaccio per 1-2 minuti. </li><li> Aggiungere quanto segue ogni tubo di reazione sul ghiaccio: <ul><li> 6μl 5X First-Strand tampone </li><li> 1.5μl 0.1M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP mix </li><li> 1ml RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl SuperScript III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente. Incubare la provetta in una notte a 45 ° C. </li><li> Aggiungere 15μl di NaOH 1M per ogni tubo di reazione e mescolare accuratamente. </li><li> Incubare la provetta a 70 ° C per 10 minuti. </li><li> Aggiungere 15μl di HCl 1M, mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 20μl acetato di sodio 3M (pH 5.2); mescolare delicatamente. </li></ol> Parte 2: Purificante First-Strand cDNA. <ol><li> Aggiungere 500μl di tampone di caricamento per il cDNA (dal punto 1.9) e mescolare bene. </li><li> Inserire una colonna di purificazione SNAP (fornito con il kit etichettatura indiretta) su un tubo di raccolta e caricare i vostri cDNA sulla colonna. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Posizionare la colonna SNAP sul tubo stessa collezione e aggiungere 500μl di tampone di lavaggio. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Ripetere i punti 2.4 e 2.5 per tre volte, per un totale di tre lavaggi 500μl. </li><li> Spin ancora una volta a 14.000 g a temperatura ambiente per minuto sec 1; scartare il flow-through. </li><li> Posizionare la colonna SNAP su un nuovo tubo 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 50μl di caldo DEPC-acqua (50 ° C) alla colonna e colonna SNAP incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. Eluire il cDNA tramite uno spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto. </li><li> Ripetere il punto 2.9, con 100μl di caldo DEPC acqua e il tubo stesso 1,5 ml per l&#39;eluente. </li><li> Aggiungere 20μl di acetato di sodio 3M (pH 5.2) per l&#39;eluente passi da 2.9 e 2.10. </li><li> Aggiungi 3μl di glicogeno (20mg/ml) per il tubo e mescolare. </li><li> Aggiungere 500μl di ghiaccio freddo EtOH 100%, mescolare bene e incubare la provetta per 1 ora a -80 ° C. </li><li> Rotazione del tubo a 14.000 g a 4 ° C per 20 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante. </li><li> Aggiungere 500μl di ghiacciata EtOH 70% e ruotare il tubo a 14.000 g a 4 ° C per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante. </li><li> Far asciugare il campione per 5 minuti; garantire che tutte le EtOH viene rimosso. </li><li> Scaldare il buffer 2X accoppiamento a 37 ° C per 5 minuti e risospendere il campione in cDNA 5μl di caldo Buffer accoppiamento 2X. </li><li> Riscaldare il cDNA / buffer di accoppiamento a 50 ° C per 10 minuti e vortice bene. Assicurarsi che il cDNA pellet è completamente risospeso nel tampone di accoppiamento 2X. </li></ol> Parte 3: Etichettatura con colorante fluorescente Nel preparare la reazione, fare attenzione a minimizzare l&#39;esposizione della soluzione colorante alla luce. Inoltre, DMSO è igroscopico e assorbe l&#39;umidità dall&#39;aria, che reagisce con l&#39;estere NHS del colorante e ridurre significativamente l&#39;efficienza di reazione di accoppiamento. Tenere il DMSO fornito nel kit in un tappo a vite ambra fiala a -20 ° C, e lasciare che il flacone a temperatura ambiente prima di aprire per evitare la condensa. Usare solo il DMSO fornito con questo kit. <ol><li> Aprire un pacchetto di Cy-3 o Cy-5 Dye e aggiungere 75μl di DMSO direttamente nel flacone colorante. </li><li> Aggiungere 5μl della soluzione di DMSO / colorante per il tubo dal punto 2.18. </li><li> Mescolare bene e incubare il tubo a temperatura ambiente al buio per 1 ora. </li><li> Aggiungere 20μl di acetato di sodio 3M (pH 5.2) per la soluzione colorante accoppiata cDNA. </li><li> Aggiungere 500μl di tampone di caricamento per la soluzione di cDNA. Mescolare bene nel vortex. </li><li> Inserire una colonna SNAP su un tubo di raccolta chiara e caricare la soluzione di cDNA / tampone. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Posizionare la colonna SNAP sulla stessa collezionetubo, aggiungere 500μl di soluzione di lavaggio colonna. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Ripetere i passaggi 3. 8-3,9 tre volte, per un totale di tre lavaggi 500μl. </li><li> Spin ancora una volta a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Posizionare la colonna SNAP su un nuovo tubo di raccolta ambra. </li><li> Aggiungere 65μl di caldo DEPC-acqua (50 ° C) per la colonna SNAP e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto e raccogliere il deflusso. Il flusso attraverso dovrebbe contenere 60μl del vostro purificato dye-accoppiato cDNA. </li></ol> Parte 4: Valutazione della procedura di etichettatura. <ol><li> Condurre un test spettrofotometro per valutare ogni Cy-cDNA etichettatura. Calcolare il numero totale di pmol di cDNA sintetizzato: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calcolare il totale di pmol incorporato Cy-Dye per ogni reazione di marcatura: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Successivamente, calcolare la pmol di nucleotidi / pmol rapporto colorante per ogni reazione. Reazioni ottimale generare 6000pmol&gt; di cDNA (per 60ul),&gt; 200pmol di Cy-Dye (per 60ul), e un rapporto di nucleotidi / colorante che è &lt;30. </li></ol> Parte 5: Presentazione Pre-Wash <ol><li> Array PtGen2 è stampato su Corning diapositive UltraGaps (amino-silano rivestito) e cDNA sono UV-reticolato. Macchie di stampa sono chiaramente visibili a causa del contenuto di sale del buffer. </li><li> Utilizzare una penna a punta di diamante per segnare la diapositiva per le aree superiore e inferiore dell&#39;area di stampa (opzionale). </li><li> Mettere circa 250mL pre-riscaldato a 43 ° C soluzione allo 0,2% SDS nel lavare i piatti vetrino da microscopio (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Collocare i vetrini per essere pre-ibridato nel rack diapositive e immergersi nella soluzione di SDS 15-20 volte molto energicamente per rimuovere i sali nelle diapositive. </li><li> Prendere con cautela rimuovere le diapositive dal rack e metterli in una vaschetta Coplin contenente Pre-ibridazione Buffer (5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA) che è stato pre-riscaldato a 43 ° C. Incubare a 43 ° C per almeno un&#39;ora. </li></ol> Parte 6: Pre-ibridazione <ol><li> Impostare fino a cinque piatti scivolare lavaggio, ognuno dei quali contiene millipure dH 2 O, e una vaschetta Coplin piena molecolare grado isopropanolo. Porre i vetrini in un rack di diapositive e di processo in modo sequenziale attraverso cinque piatti da inzuppare 20 volte ciascuno. </li><li> Rimuovere diapositive due alla volta dal lavaggio con acqua quinto e tuffo 5-6 volte al posto isopropanolo e immediatamente nelle diapositive in microcentrifuga diapositive (da banco Chipmate, 2 posizioni) e spin 1 minuto ad asciugare. </li><li> Vetrini puliti con aria compressa filtrata attraverso una cartuccia filtrante 0,22 mM e metterli con il codice a barre rivolto verso l&#39;alto in un Genomic Hybridization Camera Solutions. </li><li> LifterSlips Clean ™ con aria filtrata e posizionarli nelle diapositive con le strisce bianche verso il basso. Utilizzare una punta di giallo pipetta per allineare scivolare delicatamente il sollevatore sul vetrino (lavaggio LifterSlips ™ prima in etanolo al 70% è facoltativo. Abbiamo trovato non sia necessario.) </li></ol> Parte 7: ibridazione Deve essere effettuata alla luce scura o bassa. <ol><li> Per ogni diapositiva di essere ibridato, calcolare la quantità di Cy-5-3 e Cy cDNA marcato per dare 50-75pmol di ciascun target. Combinare tali importi in un unico tubo e asciutto in un essiccatore a vuoto con l&#39;impostazione di calore a 37-45 ° C. Evitare di asciugare completamente! </li><li> Risospendere le sonde secco in tampone di ibridazione da 60 ml (fatto fresco quel giorno) e mescolare brevemente nel vortex. </li><li> Incubare il cDNA risospeso per 5 minuti in un bagno di 95 ° C e poi microcentrifuga veloce per 30 secondi. </li><li> Carico l&#39;intero volume della sonda risospeso lentamente pipettamento a slide-LifterSlip ™ incrocio nella parte inferiore (fine codice a barre) della diapositiva. La slitta si caricherà attraverso l&#39;azione capillare. (Alcuni preferiscono pipetta alla diapositiva e poi delicatamente la sovrapposizione LifterSlip ™ questo è un metodo di colpo perché se si ottiene bolle non è possibile spostare l&#39;™ LifterSlip dopo il posizionamento che può portare a posto artefatti sbavature) </li><li> 20 ul luogo di DTT 100mM in ogni umidità ben posizionato alle estremità della camera. </li><li> Posizionare la parte superiore sulla camera e stringere le viti della camma. Coprire la camera con un foglio di alluminio e immergere in un bagno d&#39;acqua ° 48 C per 12-18 ore con agitazione a 50-60 giri al minuto. </li></ol> Parte 8: Post-ibridazione lava Tutti i lavaggi devono essere effettuati nel buio o in luce scarsa. Diapositive non dovrebbe mai essere permesso per asciugare fino alla fase finale. <ol><li> Impostare una vaschetta Coplin piena di soluzione di lavaggio # 1 @ 53 ° C, e quattro piatti di far scorrere il lavaggio pieno di 250 ml di ciascuna delle seguenti: 1) Wcenere Soluzione # 1 @ 53 ° C, 2) la soluzione di lavaggio # 2 @ temperatura ambiente, 3 e 4) due piatti contenenti soluzione di lavaggio # 3 @ temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con attenzione le diapositive dalla camere di ibridazione e metterli due per volta nel vaso Coplin. Lasciare agire per 30 secondi, quindi sollevare il sfilare lentamente e la polizza di sollevatore rimarrà nel barattolo. Collocare i vetrini nel rack diapositive e subito immergere in soluzione di lavaggio # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, preriscaldamento a 43 ° C). Ripetere fino a quando tutti LifterSlips vengono rimossi e tutte le diapositive da lavare sono nella soluzione di lavaggio # 1 piatto. Tuffo a rack su e giù per 10 volte con vigore. </li><li> Piatto posto a 53 ° C in aria shaker con agitazione a 50-100 rpm per 10 minuti. </li><li> Trasferimento rack per la soluzione di lavaggio # 2 (0,1 X. SSC, 0,2% SDS), tuffo 10 volte, e incubare a temperatura ambiente, agitando lento per 10 minuti. </li><li> Tuffo a rack 15 volte nella soluzione di lavaggio primo # 3 (0,1 X. SSC) per rimuovere eventuali residui SDS riporto dalla soluzione di lavaggio # 2. Cremagliera posto nella soluzione di lavaggio # 3 secondo piatto, immergersi per 10 volte, e poi lenta agitazione per 10 minuti. </li><li> Collocare i vetrini in 50mL tubi Falcon innevate e spin @ 1.500 giri in centrifuga dotato di un rotore oscillante. Rimuovere diapositive alla luce contenitore impermeabile, usiamo un altro tubo Falcon coperto con un foglio di alluminio e eliminare l&#39;aria dal tubo con gas di azoto, il tappo (che riduce l&#39;ossidazione dei coloranti Cy, specialmente Cy-5 in estate, quando i livelli di ozono sono più alti ). Le diapositive possono essere conservati per un paio d&#39;ore prima della scansione nei tubi di azoto eliminato, tuttavia, i risultati migliori si ottengono quando il segnale di scansione viene effettuata immediatamente dopo il lavaggio. </li></ol> Parte 9: Raccolta dati e analisi statistica <ol><li> Dati delle immagini di scansione è raccolto su un ScanArray PerkinElmer. Usiamo una impostazione di scansione 10 micron ed equilibrio Cy3 e Cy5 segnali utilizzando il metodo di regolazione linea secondo le istruzioni del produttore. </li><li> TIF sono griglia e dati del segnale grezzi raccolti e filtrati con ImaGene versione 7.5 (BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA) </li><li> Normalizzazione dei dati e la valutazione per determinare statisticamente validi specie espressi in modo differenziale si fa con BRB Array strumenti Ver. 3.7. </li><li> Analisi di modelli per facilitare la determinazione di geni espressi coordinatamente è fatto con il software analisi di espressione genica Pattern (GEPAS) Ver. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esempio di PtGen2 serie elaborati utilizzando questa l. protoco <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esempio di PtGen2 serie trattati mediante ibridazione standard e protocolli di lavaggio.

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2 è sviluppata di recente, cDNA microarray personalizzati che è stato progettato per essere utilizzato principalmente dalla comunità di ricerca loblolly pino. I risultati preliminari generato finora hanno mostrato l&#39;array di essere un valido strumento nella valutazione degli eventi trascrizionale che si verificano in risposta a stress idrico, così come nel monitoraggio dei cambiamenti che si verificano durante lo sviluppo embrionale in pino marittimo, Pinus pinaster 5,6 Abbiamo inoltre r...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2 è una caratteristica del DNA microarray 26.496 contenente amplificato EST pino loblolly. La serie è prodotta nel nostro laboratorio per l&#39;utilizzo da parte di ricercatori studiando l&#39;espressione genica in specie di pino ed altre conifere. PtGen2 è stato sviluppato come risultato degli sforzi gene nostra scoperta in pino loblolly, ed è composto da sequenze identificate principalmente dai tessuti radice, ma anche da ago e staminali. 1,2 PtGen2 è stato testato da ibridare differenti Cy-dye etichettati cDNA bersaglio di conifere , utilizzando sia amplificato e non amplificati modalità di etichettatura indiretti, e anche testato con una serie di condizioni di ibridazione e di lavaggio. Questo video si concentra sulla gestione e l&#39;elaborazione di diapositive prima e dopo la pre-ibridazione, così come dopo ibridazione, con alcune modifiche alle procedure sviluppate in precedenza. 3,4 inclusi anche, in forma di testo unico, sono i protocolli utilizzati per la generazione, l&#39;etichettatura e la pulizia di s cDNA bersaglio, così come informazioni sul software utilizzato per l&#39;elaborazione dei dati a valle. PtGen2 è stampato con un buffer di stampa proprietario che contiene alte concentrazioni di sale che possono essere difficili da rimuovere completamente. I vetrini vengono lavati prima di una soluzione calda SDS prima di pre-ibridazione. Dopo la pre-ibridazione, le diapositive vengono lavati con vigore in diversi cambiamenti di acqua per completare la rimozione dei sali rimanenti. LifterSlips ™ sono quindi puliti e posizionati sul diapositive e cDNA marcato è attentamente caricati sul microarray per mezzo di un&#39;azione capillare che prevede anche la distribuzione del campione lungo la diapositiva e riduce la possibilità di incorporazione bolla. Ibridazione degli obiettivi alla matrice avviene a 48 ° C in condizioni di elevata umidità. Dopo l&#39;ibridazione, una serie di lavaggi standard sono fatto a 53 ° C e temperatura ambiente per tempi prolungati. Elaborazione PtGen2 diapositive utilizzando questa tecnica riduce sale e SDS-derivati ​​artefatti spesso visto quando l&#39;array è un&#39;elaborazione meno rigorosamente. Ibridazione obiettivi derivanti da diverse fonti diverse conifere RNA, questo protocollo di elaborazione prodotto un minor numero di artefatti, sfondo ridotto, e ha fornito una migliore coerenza tra i diversi gruppi sperimentali di array.

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Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly,<em&gt; P. taeda</em&gt;, E altre specie di conifere. Qui mostriamo pre-e post-ibridazione manipolazione e il lavaggio delle tecniche che possono essere utilizzati con questo array per produrre una maggiore coerenza, manufatti ridotti e inferiori sfondi.

L&#39;elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  University of Georgia (UGA). Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly, P. taeda, E altre specie di conifere. Qui mostriamo pre-e post-ibridazione manipolazione e il lavaggio delle tecniche che possono essere utilizzati con questo array per produrre una maggiore coerenza, manufatti ridotti e inferiori sfondi.

Video: Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae ascospore di produzione e di raccolta di esperimenti di microarray.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Ricerca

Biologia

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonda Microfluidic: funzionamento e utilizzo per l&#39;elaborazione delle superfici localizzate

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l&#39;analisi di espressione genica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high concentrations of phenolic compounds and polysaccharides that interfere with RNA purification. Isolation of high-quality RNA from these species requires rigorous tissue collection procedures in the field and the employment of an RNA isolation protocol comprised of multiple organic extraction steps in order to isolate RNA of sufficient quality for microarray and other genomic analyses. The isolation of high-quality RNA from field-collected loblolly pine samples can be challenging, but several modifications to standard tissue and RNA isolation procedures greatly improve results. The extent of general RNA degradation increases if samples are not properly collected and transported from the field, especially during large-scale harvests. Total RNA yields can be increased significantly by pulverizing samples in a liquid nitrogen freezer mill prior to RNA isolation, especially when samples come from woody tissues. This is primarily due to the presence of oxidizing agents, such as phenolic compounds, and polysaccharides that are both present at high levels in extracts from the woody tissues of most conifer species. If not removed, these contaminants can carry over leading to problems, such as RNA degradation, that result in low yields and a poor quality RNA sample. Carryover of phenolic compounds, as well as polysaccharides, can also reduce or even completely eliminate the activity of reverse transcriptase or other polymerases commonly used for cDNA synthesis. In particular, RNA destined to be used as template for double-stranded cDNA synthesis in the generation of cDNA libraries, single-stranded cDNA synthesis for PCR or qPCR's, or for the synthesis of microarray target materials must be of the highest quality if researchers expect to obtain optimal results. RNA isolation techniques commonly employed for many other plant species are often insufficient in their ability to remove these contaminants from conifer samples and thus do not yield total RNA samples suitable for downstream manipulations. In this video we demonstrate methods for field collection of conifer tissues, beginning with the felling of a forty year-old tree, to the harvesting of phloem, secondary xylem, and reaction wood xylem. We also demonstrate an RNA isolation protocol that has consistently yielded high-quality RNA for subsequent enzymatic manipulations.

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Many plant tissues, including phloem and xylem from loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high levels of phenolics and polysaccharides that interfere with RNA purification. This presentation discusses techniques for the harvest of field-grown tissues and isolation of RNA of sufficient quality for microarrays and other genomic analyses.

Un metodo migliorato di isolamento dell&#39;RNA da Pino Loblolly ( P. taeda L.) e altre specie di conifere

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

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In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Esecuzione personalizzati Esperimenti di Microarray MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.