Lavori realizzati in laboratorio Lécuyer è sostenuto da un finanziamento della Nazionale Scienze e Ingegneria Consiglio, del Canada (NSERC), il Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e il Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre e Gaël Moquin-Beaudry sono supportati da borse di ricerca NSERC universitari, mentre Carole Iampietro è supportato dalla borsa di studio post-dottorato Angelo Pizzagalli.

1. RNA Probe Preparazione Descrizione: La sezione seguente descrive i passaggi necessari per rendere digossigenina (Dig), sonde di RNA adatta ai pesci. Il primo passo consiste clonazione o PCR amplificazione di una sequenza corrispondente alla regione trascritta di un gene di interesse che verrà utilizzato per generare una sequenza sonda specifica. Ciò può essere ottenuto clonando il primo segmento di gene in un plasmide in cui è affiancato il sito di clonaggio multiplo da elementi promotori batteriofago (T7, T3 e SP6), che può quindi servire come stampo per PCR usando primer fiancheggianti che incorporano le sequenze promotrici , generando così un prodotto lineare PCR con sequenze promotrici diverse in ciascuna estremità (Figura 1A). In alternativa, per evitare il passaggio di clonazione, si può anche effettuare l&#39;amplificazione PCR da DNA genomico o cDNA utilizzando oligonucleotidi che includono T7, T3 e SP6 sequenze al loro 5 &#39;estremità (es T7:5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3: 5&#39;-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3&#39;; Sp6: 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 &#39;). I prodotti di PCR lineari vengono poi utilizzati come modelli per senso Dig-marcato o sonde di RNA antisenso per scorrimento trascrizione in vitro con la polimerasi appropriata (Figura 1B). Quando si effettuano sonde per geni specifici, si consiglia di preparare sia il senso e antisenso sonde di RNA polimerasi utilizzando distinti, che saranno utili per la valutazione del segnale specificità FISH (vale a dire a meno che il gene di interesse viene trascritto in orientamento antisenso, il senso di RNA sonda rivelerà la livello del segnale di fondo). In tutti i seguenti passaggi, si dovrebbe fare molta attenzione per evitare il degrado potenziale ribonucleasi contaminanti (RNasi) per prima cosa la pulizia di tutte le aree e le attrezzature da banco con il 70% di etanolo o commerciali, soluzioni per la decontaminazione RNasi e utilizzando RNasi-free forniture (ad esempio acqua, punte, tubi microcentrifuga). Mammateriali <ul><li> 1,5 ml microprovette, (ABgene, Rochester, NY, USA cat. N 0900) </li><li> Gel-estrazione kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada,. Cat. No. 28706). </li><li> RNasi acqua gratuita (Wisent, Cat Inc.. 809-115-CL) </li><li> RNA polimerasi (T7, T3, o SP6). (20 U / mL, Fermentas Biosciences. N. di cat. EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> RNasi-OUT inibitori ribonucleasi (40 U / mL), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. No. 10777-019). </li><li> Digossigenina (DIG) miscele di nucleotidi (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canada. Cat. No.11209256910). </li></ul> Attrezzatura <ul><li> Piano micro-centrifuga </li><li> Gel-elettroforesi apparato </li></ul><ol><li> Amplificare PCR gene-specifica sequenza di DNA genomico, cDNA o DNA plasmidico per generare un prodotto lineare PCR fiancheggiato da batteriofago T7, T3 o sequenze promotore SP6. Seguire le raccomandazioni del costruttore per le condizioni di PCR. </li><li> Verificare la qualità e SIze del prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Accise e purificare prodotto PCR utilizzando uno standard di gel-kit di estrazione secondo la produce raccomandazioni ed eluire il prodotto in 50 pl di tampone. </li><li> Precipitare il prodotto PCR aggiungendo 5 ml di acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e 150 ml di etanolo ghiacciato 100%, e posizionare le provette a -70 ° C per una notte. Centrifugare le provette a 13.000 xg per 10 min a 4 ° C e lavare il pellet con etanolo 70%. Gira di nuovo, eliminare ogni traccia di etanolo e asciugare il pellet. Risospendere in 25-50 ml di acqua priva di RNasi. </li><li> Trascrivere Dig-sonda marcata con 200-500 ng purificato prodotto di PCR in una reazione di 20 microlitri come segue: 2 microlitri di tampone 10X trascrizione T7 (Invitrogen), 1 ml (20 U / pl) inibitore di RNAsi, 2 microlitri Dig-NTP mix , e 2 microlitri T7 RNA polimerasi (20 U / pl). Portare il volume finale di 20 pl di acqua priva di RNasi. Incubare la reazione di trascrizione a 37 ° C per 3-4 ore. </li><li> Regolare transcmix rizione a 50 microlitri con acqua priva di RNasi e precipitare la Dig-marcato RNA sonda come descritto al punto 4. Risospendere il pellet di RNA lavato in 100 ml di acqua priva di RNasi. Conservare i campioni risospeso a -70 ° C. </li><li> Quantificare la sonda utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Per verificare la qualità della sonda, eseguire un campione di 1-2 microlitri su un 1-2% gel di agarosio colorato con bromuro di etidio. </li></ol> 2. Raccolta e fissazione di embrioni di Drosophila Descrizione: In questa sezione viene descritta la procedura per la raccolta e la lavorazione in scena embrioni di Drosophila. A seconda del numero di embrioni necessari, mosche possono essere mantenuti in gabbie di popolazione di varie dimensioni. I seguenti passaggi sono per le collezioni eseguita utilizzando 900 centimetri 3 gabbie cilindriche con 100 millimetri piastre di raccolta succo di mela. La corretta fissazione richiede la rimozione di due strati protettivi che circondano l&#39;embrione: il corion esterno e l&#39;interno vitelline membrana 13. Una volta raccolte, gli embrioni vengono prima immersi in una soluzione di candeggina 50% per rimuovere il corion, poi vengono miscelati in una soluzione bifasica contenente eptano (permeabilizes la membrana vitellina), e PBS contenente 3,7% di formaldeide. La membrana vitellina viene quindi rimosso mediante cracking e trasferimento degli embrioni in una miscela bifasica di eptano e metanolo. Fissazione embrione corretto e rimozione della membrana vitellina è fondamentale per il successo della procedura FISH valle. Materiale <ul><li> Apple-Succo di piastre di agar (40% succo di mela, 4% di saccarosio, 3,5% agar, 0,3% metilparaben) con monetina dimensioni pasta di lievito (lievito di birra mescolato con acqua per consistenza del burro) </li><li> Paraformaldeide in polvere (Scienze della microscopia elettronica, Hatfield, PA, Stati Uniti d&#39;America,. Cat. No. 19208) </li><li> Eptano </li><li> Metanolo </li><li> Bleach soluzione al 3% </li><li> Vetro da 20 ml fiale di scintillazione (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada,. Cat No. 03-337-15). </li></ul> Attrezzatura <ul><li> Popolazione gabbie </li><li> Cestelli di raccolta (fatta utilizzando una maglia Nitex e la porzione superiore di un taglio tubo 50 ml polipropilene in cui un foro è stato tagliato nel coperchio). </li><li> Pennello Piccolo </li><li> Tabella vortice top </li></ul><ol><li> Pre-chiari ben nutriti gabbie di popolazione con un fresco succo di mela / lievito piastra per 1 ora a 25 ° C. </li><li> Aggiungi un nuovo succo di mela / lievito piastra alla gabbia per raccogliere embrioni nelle fasi iniziali. Incubare la gabbia per 4 ore a 25 ° C (si noti che i tempi di raccolta può essere regolato a seconda delle fasi desiderati). </li><li> Preparare la soluzione di formaldeide al 37% combinando 3,7 g di paraformaldeide in polvere, 70 ml di KOH 2N, e 7,3 ml di acqua MilliQ in una fiala di scintillazione in vetro sotto cappa chimica. Far bollire la soluzione fino a quando la polvere paraformaldeide è completamente sciolto, poi raffreddare a temperatura ambiente e filtrare in fiala di scintillazione nuova. </li><li> Preparare una soluzione bifasica fissazione da partecombinando 2,25 ml di PBS 1X con 250 ml di 37% di formaldeide in una fiala di scintillazione, aggiungendo poi 7,5 ml di eptano. </li><li> Raccogliere la piastra di succo di mela dalla gabbia e raccogliere gli embrioni con l&#39;aggiunta di un po &#39;di acqua di rubinetto temperatura ambiente e delicatamente spazzolare gli embrioni fuori il piatto con il pennello. Trasferire gli embrioni risospeso in un cesto e risciacquare con acqua tiepida. </li><li> Embrioni Dechorionate per 90 sec per fare il bagno i cestini di raccolta nella soluzione di candeggina, quindi risciacquare abbondantemente con acqua del rubinetto tiepida (fino a quando l&#39;odore di candeggina è andato). </li><li> Smontare il cestello di raccolta, raccogliere embrioni delicatamente con un pennello e trasferirli nella soluzione di fissaggio bifasica. Gli embrioni si accumulano in corrispondenza dell&#39;interfaccia tra il PBS e strati eptano. </li><li> Seal scintillazione fiale e fissarlo ad un miscelatore vortex. Agitare per 20 minuti a più basso. </li><li> Rimuovere ed eliminare la maggior parte delle fasi inferiore e superiore eptano PBS utilizzando una pipetta Pasteur. Aspirareil restante PBS / eptano / embrioni miscela nella pipetta. In modo goccia a goccia, eliminare la fase inferiore PBS dalla pipetta, facendo attenzione a non eliminare gli embrioni. Depositare gli embrioni in una provetta da 1,5 ml contenente una soluzione bifasica di 500 microlitri eptano (fase superiore) e 500 microlitri metanolo (fase inferiore). </li><li> Agitare vigorosamente a mano tubi per 30-45 secondi per rompere le membrane vitellino. Una volta rotto, gli embrioni affondano nel metanolo. </li><li> Eliminare la fase superiore eptano ed embrioni uncracked all&#39;interfase eptano / metanolo, e aggiungere 500 ml di metanolo. Agitare per 5 sec. </li><li> Lavare 3 volte con metanolo e conservare gli embrioni a -20 ° C (a questo punto gli embrioni possono essere conservati per settimane / mesi). </li></ol> 3. Post-Processing di fissaggio, ibridazione e di post-ibridazione Lavaggi Descrizione: Questa sezione descrive le fasi di lavorazione per la permeabilizzazione embrione prima FISH, pre-ibridazione,ibridazione con le sonde di RNA e post-ibridazione lavaggi. Per le fasi iniziali permeabilizzazione gli embrioni vengono gestite come una piscina in un unico tubo (punti 1-9 di seguito, puntando il 10-15 ml di embrioni regolati / campione), ma sono frazionato in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti PCR prima di procedere con la pre-ibridazione step (passo 10). Questo aiuta a garantire anche il trattamento di tutti gli embrioni nelle fasi iniziali dell&#39;esperimento. Quando si imposta un esperimento FISH, è importante includere controlli negativi per determinare il livello del segnale di fondo in esperimenti singoli. Per questo, si consiglia anche a campione, un &#39;no-sonda&#39; e, come indicato al punto 1, un campione ibridato con il &#39;senso&#39; della sonda di RNA, che in genere un segnale paragonabile a condizionare il &#39;no-sonda&#39;. Materiali: <ul><li> Metanolo </li><li> Tampone fosfato con 0,1% Tween-20 (PBT) </li><li> Proteinasi-K 1 mg / ml di soluzione concentrata (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada. Catalog No. P2308) </li><li> Glycine (20 mg / ml di soluzione concentrata) </li><li> Soluzione ibridazione: 50% formammide, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml di DNA di sperma di salmone tosata, 100 pg / ml di eparina. </li><li> 0,2 ml halfskirted 96 pozzetti piastre PCR, ABgene, Rochester, NY, Stati Uniti d&#39;America Cat. No 0900) </li></ul> Attrezzatura <ul><li> Bagno fornetto, blocco riscaldante digitale o acqua regolabile a 56 ° C, 80 ° C o 100 ° C, o una macchina PCR. </li><li> Pipette multicanale (consigliato per semplificare fasi di lavaggio) </li><li> Oscillante mixer </li></ul><ol><li> Risciacquare gli embrioni in metanolo, poi in una miscela 1:1 di metanolo: PBT, e quindi due volte in PBT. </li><li> Fissare gli embrioni per 20 min in 1 ml di PBT contenente 3,7% di formaldeide (preparata come descritto nel passaggio 11) con dondolo costante su un nutator. </li><li> Lavare gli embrioni per 3 volte per 2 minuti in PBT mentre a dondolo. </li><li> Preparare una soluzione di 3 mg / ml di proteinasi K (PK) diluito in PBT e aggiungere500 microlitri di soluzione di campioni. Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Mescolare embrioni ogni 2 minuti di getto con una pipetta o delicatamente invertendo i tubi. </li><li> Trasferire campioni embrioni in ghiaccio per 1 ora. </li><li> Spostare i campioni a temperatura ambiente e rimuovere la soluzione PK. Lavare 2 volte per 2 min con 1 ml di PBT + 2 mg / ml di glicina. </li><li> Fissare i campioni 20 min in 1 ml di formaldeide PBT + 3,7% a dondolo. Risciacquare embrioni 5 volte in PBT. </li><li> Risciacquare embrioni con 1 ml di una miscela 1:1 di PBT e soluzione Hyb. Sostituire con 0,5-1 ml di soluzione di ibridazione 100% (in questa fase gli embrioni possono essere conservati per diversi giorni / settimane a -20 ° C). </li><li> Embrioni aliquote nei singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (obiettivo per ~ 10-15 microlitri di embrioni regolati / pozzetto, aver cura di utilizzare punte ampia apertura per evitare di danneggiare gli embrioni). </li><li> Bollire 100 pl / campione di soluzione di ibridazione per 5 minuti e poi raffreddare in ghiaccio per 5 min. Questa soluzione viene utilizzata per il campione pre-ibridazione (Pre-Hyb). </li><li> Aggiungere 100 microlitri / campione di pre-ibridazione soluzione e incubare per almeno 2 ore a 56 ° C. </li><li> Per ciascun campione, diluire ~ 100 ng di sonda in 100 microlitri di soluzione di ibridazione. Riscaldare a 80 ° C per 3 minuti, poi raffreddare in ghiaccio per 5 min (sonde riscaldate possono essere tenuti in ghiaccio per diverse ore). </li><li> Rimuovere il pre-ibridazione soluzione da embrioni e sostituirlo con la soluzione della sonda RNA. </li><li> Ibridare a 56 ° C per 12-16 ore. </li><li> Pre-riscaldare le seguenti soluzioni di lavaggio a 56 ° C: (A) 200 microlitri / campione di soluzione di ibridazione; (B) 100 microlitri / campione di una miscela 3:1 di ibridazione: PBT; (C) 100 pl / campione di 01:01 mix di ibridazione: PBT, (D) 100 pl / campione di una miscela 1:3 di Ibrid: PBT, (E) 400 microlitri / campione di PBT. </li><li> Lavare i campioni con 100 ml di soluzione di lavaggio A, quindi eseguire la fase di lavaggio con 100 pl / campione di AD soluzioni a 56 ° C per 15 minuti ciascuno. Poi, lavare i campioni 4 volte per 5 min con 100 pl / campione di soluzione a 56 ° C. </li><li> Campioni raffreddare a temperatura ambiente. </li></ol> Sommario: Questa sezione descrive gli anticorpi e reagenti di rilevazione utilizzati per rilevare e visualizzare la distribuzione del segnale della sonda di ibridazione RNA seguente. Questi passaggi sono illustrati schematicamente in figura 2. Qui si presenti solo i reagenti di rivelazione standard che utilizziamo per l&#39;amplificazione del segnale robusta, ma esiste una varietà reagenti disponibili in commercio che possono essere utilizzati come alternative, particolarmente quando effettua doppio FISH esperimenti di co-RNA rilevare simultaneamente per proteina-RNA a doppio colorazione. Esempi di risultati ottenuti con questo protocollo sono visualizzati nel mosaico mRNA espressione / localizzazione schema in Figura 3. Materiale <ul><li> HRP-coniugato monoclonale di topo anti-DIG (Jackson Laboratories ImmunoResearch Cat Inc.. No. 200-032-156) </li><li> Biotina-coniugato monoclonale di topo anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Cat Inc.. No. 200-062-156) </li><li> Streptavidina-HRP coniugato (Molecular Probes, Eugene, USA, cat. No.S991) </li><li> Cy3-tiramide coniugati (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, Stati Uniti d&#39;America, N. di cat. SAT704A) </li><li> DABCO soluzione di montaggio: In una provetta da 50 ml, diluire 1,25 grammi di DABCO (1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano; Sigma D-2522) in 15 ml di PBS 1X, quindi aggiungere 35 ml di glicerolo e mescolare fino a completa omogenea. Premiscelando con PBS, la polvere viene sciolta DABCO molto rapidamente. Conservare la soluzione di montaggio a -20 ° C. </li><li> Vetrini coprioggetto </li></ul> Attrezzatura <ul><li> Oscillante mixer </li><li> Pipetta multicanale </li><li> Microscopio a fluorescenza </li></ul><ol><li> Preparare soluzione PBTB, contenente PBT + 1% non-grassi del latte secco (di solito 50-100 ml è sufficiente per tutti l&#39;incubazione di rilevamento reattivo e fasi di lavaggio). </li><li> Bloccare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente in 100 PBTB pl / campione, mentre a dondolo su nutator. </li> &lt;li&gt; Rimuovere la soluzione di blocco da embrioni e campioni incubare per 1,5-2 ore a temperatura ambiente con 100 pl / campione della biotina monoclonale anti-DIG soluzione di anticorpi (diluito 1/400 da magazzino in PBTB) con dondolo. </li><li> Lavare i campioni 6 volte per 5 minuti ciascuna con 100 PBTB pl / campione con dondolo. </li><li> Incubare 1,5 ore a temperatura ambiente con 75 ml / campione di streptavidina-HRP soluzione (diluito 1/100 a magazzino in PBTB, 10 pg / ml concentrazione finale) con dondolo. </li><li> Lavare i campioni 6 volte per 5 minuti ogni 100 PBTB pl / campione con dondolo (per il DNA di contrasto, diluire DAPI a 1X concentrazione di lavoro in PBTB e utilizzare questa soluzione nel passaggio primo lavaggio). </li><li> Sciacquare embrioni con PBT, quindi lavare 2 volte per 5 minuti con PBS. </li><li> Incubare campioni per 2 ore a temperatura ambiente sulla nutator con 50 pl / campione di Cy3-tiramide soluzione (diluito 1/50 in tampone di amplificazione tiramide). Da questo punto in poi, assicurarsi di mantenere i campioni in un recipiente luce schermato. &lt;/ Li&gt; <li> Lavare i campioni 6 volte per 5 minuti ciascuno con 100 ul di PBS / campione nutator. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 100-125 pl / campione di soluzione di montaggio contenente il 70% di glicerolo e del 2,5% (DABCO). Conservare i campioni a 4 ° C. Questi campioni possono essere conservati per diversi anni. </li><li> Utilizzando un ampio foro punta, risospendere gli embrioni pipettando gentilmente i campioni e trasferire 25 pl di embrioni su un vetrino, quindi inserire un coprioggetto sopra gli embrioni e tenuta sul vetrino con smalto per unghie. </li><li> Analizzare campioni embrioni usando un microscopio a fluorescenza. </li></ol>

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Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per la procedura di sintesi della sonda, di solito generano run-off sonde di RNA antisenso mediante trascrizione in vitro da full-length cDNA Drosophila amplificati da plasmidi presenti nel gene Drosophila Collection (DGC), una risorsa dettagliato al seguente indirizzo: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato in grandi studi di ISH di scala volte a espressi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> T7, T3 e SP6 RNA polimerasi </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> I kit contengono tampone di reazione. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M sodio acetato </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Freddo etanolo 100%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanolo freddo al 70%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di candeggina al cloro diluito 1:1 con acqua. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eptano </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinasi K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada </td><td> Catalog No. P2308 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione al 40% di formaldeide, preparata </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween soluzione (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine soluzione </td><td></td><td> 2 mg / ml di glicina in PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-coniugato monoclonale di topo anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 di una diluizione 1 mg / ml di soluzione concentrata in PBTB </td></tr><tr><td> HRP-coniugato pecore monoclonale anti-DIG </td><td> Roche Applied Sciencece, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 di diluizione della soluzione di riserva in PBTB </td></tr><tr><td> Biotina-coniugato monoclonale di topo anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 di una diluizione 1 mg / ml di soluzione concentrata in PBTB </td></tr><tr><td> Streptavidina-HRP coniugato </td><td> Molecular Probes, Eugene, USA </td><td> S991 </td><td> (Diluizione 1/100 di una mcg / ml 1 stock </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Valutare il pattern di espressione di un gene, come pure le proprietà localizzazione subcellulare di suo RNA trascritti, sono caratteristiche essenziali per la comprensione della funzione biologica durante lo sviluppo. RNA ibridazione in situ (ISH-RNA) è un potente metodo utilizzato per visualizzare le proprietà di distribuzione di RNA, sia ai organismal, livelli cellulari o subcellulari 1. RNA-ISH si basa sulla ibridazione di una sonda di acido nucleico marcato (ad esempio RNA antisenso, oligonucleotidi) complementare alla sequenza di un mRNA o non codificante RNA bersaglio di interesse 2. Poiché la procedura richiede informazioni di sequenza primaria sola sequenza per generare sonde specifiche, può essere universalmente applicata a una vasta gamma di organismi e campioni di tessuto 3. Infatti, un certo numero di studi ISH larga scala sono state attuate per documentare l&#39;espressione genica e RNA dinamiche localizzazione in vari organismi modello, che ha portato allacreazione di risorse comunitarie importanti 4-11. Mentre una serie di etichettatura sonda e strategie di rilevazione sono state sviluppate nel corso degli anni, l&#39;uso combinato di reagenti di rivelazione in fluorescenza marcati enzimatici e di amplificazione di segnale offrono miglioramenti significativi della sensibilità e risoluzione del procedimento 12. Qui, descriviamo un metodo fluorescente ottimizzata in ibridazione in situ (FISH) utilizzando l&#39;amplificazione del segnale tiramide (TSA) per visualizzare l&#39;espressione di RNA e dinamica in scena localizzazione in embrioni di Drosophila. La procedura viene eseguita in formato a 96 pozzetti piastra PCR, che facilita notevolmente la lavorazione simultanea di un gran numero di campioni.

Se eseguito con successo, questa procedura offre un livello sorprendentemente maggiore di dettaglio spazio-temporale analisi dell&#39;espressione genica e della dinamica di localizzazione di mRNA durante i primi embriogenesi Drosophila. Infatti, come illustrato nella figura 3A per la classica coppia di regola-runt gene (pista), si può usare questo protocollo per osservare eventi di espressione genica attraverso l&#39;individuazione dei focolai trascritto nascente in gruppi di...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Qui si descrive un insieme di montaggio fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) protocollo per la determinazione delle proprietà di espressione e la localizzazione di RNA espressi durante l&#39;embriogenesi nel moscerino della frutta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

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Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

18.2K Views.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Qui si descrive un insieme di montaggio fluorescente In situ Ibridazione (FISH) protocollo per la determinazione delle proprietà di espressione e la localizzazione di RNA espressi durante l'embriogenesi nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster.

Video: Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologia

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l&#39;RNA fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...