Ringraziamo la signora Caroline Robertson per il voice-over e la signora Elena Pirovano per la sua assistenza nella produzione video. Questo studio è stato sostenuto dall&#39;Università degli Studi di Milano Bicocca, &quot;Fondo di Ateneo 2011&quot;.

1. Come fare il titolare sonda (sito singolo o multi-sito) <ol><li> I materiali richiesti sono gomma naturale, piccoli tubi di plastica e un mandrino metallico. Il supporto sonda può essere personalizzato per la dimensione dell&#39;animale, il numero e la dimensione delle sonde laser Doppler, e il territorio vascolare cerebrale che deve essere monitorato. </li><li> Tagliare la gomma naturale della dimensione necessaria (circa 10 mm x 10 mm per un topo 300 g). </li><li> Contrassegnare le posizioni della sonda (s) e il bregma sulla gomma naturale, secondo le coordinate desiderate stereotassiche; per occlusione dell&#39;arteria cerebrale, le coordinate tipico per il nucleo ischemico sono attesi bregma -1 mm, 5 mm lateralmente alla linea mediana, per un territorio periferico borderzone ischemica, le coordinate possono essere previsti due millimetri al bregma, 2 mm lateralmente alla linea mediana. </li><li> Contrassegnare chiaramente la posizione del bregma con una X, questo è il punto di riferimento per il fissaggio del supporto sonda al cranio. &lt;/ Li&gt; <li> Inserire il mandrino in un tubo di plastica (la sua dimensione deve corrispondere alle dimensioni della sonda). </li><li> Inserire il mandrino nella gomma naturale nel punto in cui la sonda deve essere posizionata, spingere il mandrino nella gomma finché il tubo di plastica è stata inserita nella gomma troppo. </li><li> Estrarre il mandrino. </li><li> Se le sonde sono necessari più, ripetere i passaggi 1,5-1,7 per le posizioni delle altre sonde. </li><li> Opzionale per sonde multiple: avvolgere un nastro intorno ai tubi di plastica per garantire una migliore stabilizzazione delle sonde. </li><li> Facoltativo: eseguire la sterilizzazione chimica del porta sonde diverse per usi futuri. </li></ol> 2. Preparazione prechirurgica <ol><li> MCAO modello di corsa è di solito eseguita da un intervento chirurgico di sopravvivenza. In questo caso, come mostrato nel nostro video (tempo di sopravvivenza 24 ore post-chirurgico), il chirurgo utilizza una tecnica asettica con strumenti sterilizzati e forniture. </li><li> Anestetizzare il ratto con isoflurano (3% induction fase, 1,5% di manutenzione). </li><li> Posizionare il ratto in posizione prona sul tavolo operatorio. </li><li> Delicatamente radersi la testa del ratto. </li><li> Applicare una soluzione antisettica per una garza e disinfettare la pelle. </li><li> Somministrare lidocaina 2% 5 mg / kg per via sottocutanea nella zona cranica. </li></ol> 3. Sonda di posizionamento e fissaggio sul cranio intatto <ol><li> Girare a destra incisione cutanea paramediana (per il diritto MCAO) e sezionare il tessuto sottocutaneo per raggiungere la fascia cranica (galea aponeurotica). </li><li> Fai una incisione paramediana destra nella fascia cranica ed eseguire smussa per raggiungere l&#39;osso del cranio, preparare una zona ossea del cranio, che è abbastanza grande per l&#39;applicazione del portasonda. </li><li> Si prega di notare: c&#39;è bisogno di perforazione o assottigliamento delle ossa. </li><li> Applicare la soluzione Merbromina per disinfettare e asciugare la superficie del cranio. </li><li> Utilizzare un asciugacapelli (impostato per aria fredda) per accelerare l&#39;asciugatura della superficie del cranio. </li&gt; <li> A questo punto, le suture craniche e del bregma sono chiaramente visibili. </li><li> Personalizzare il supporto sonda tagliando i bordi con le forbici sterili. </li><li> Applicare una piccola quantità di colla chirurgica (cianoacrilato, veterinaria approvato) alla superficie sottostante portasonda, evitando accuratamente l&#39;apertura inferiore dei tubi di plastica (nota: se una notevole quantità di colla rimane tra la superficie ottica della sonda e il cranio, questo può produrre un segnale basso e può danneggiare la sonda dopo usi multipli). </li><li> Applicare il supporto sonda alla superficie del cranio, la compatibilità del bregma con la X il punto di riferimento. Applicare una leggera pressione sul supporto della sonda. </li><li> Utilizzare un asciugacapelli (impostato per aria fredda) per accelerare l&#39;asciugatura della colla chirurgica. </li><li> Fissare il supporto della sonda legando un filo chirurgico intorno al supporto sonda e la testa dell&#39;animale, abbiate cura di posizionare il filo chirurgico sulla mandibola, evitando la regione sottomandibolare e THe collo. </li><li> Opzionale: riempire il tubo di plastica (s) del portasonda con un gel ottico (ad esempio, un comune o gel ultrasuoni elettrocardiografia); questo aumenta la qualità del segnale LD. </li><li> Posizionare la sonda (s) nel porta-sonda e verificare la lettura effettiva del misuratore LD. Utilizzare il flussometro LD secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Fissare la sonda (s) legare intorno testa dell&#39;animale, abbiate cura di posizionare il filo chirurgico sulla mandibola, evitando la regione sottomandibolare e il collo. </li></ol> 4. Perfusione di monitoraggio cerebrale durante MCAO <ol><li> Posizionare il ratto in posizione supina, evitando accuratamente forze trazionali sulla sonda (s) o porta sonda. </li><li> Avviare il monitoraggio cerebrale durante la perfusione MCAO. </li></ol> 5. Rimozione della sonda (s) e Porta sonda <ol><li> Tagliare le suture attorno al (s) sonda, porta sonde e la testa dell&#39;animale. </li><li> Delicatamente smussato sezionare tessuti molli del cranio e la pelle intorno alla base in gomma naturale del portasonda. </li><li> Rimuovere il supporto della sonda. </li><li> Applicare una soluzione antisettica per la superficie del cranio. </li><li> Suturare la pelle del cranio. </li></ol> 6. Assistenza post-operatoria <ol><li> Somministrare 2,5 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e mantenere il caldo animale con un cuscinetto riscaldante dopo l&#39;arresto anestesia gassosa. </li><li> Per la chirurgia sopravvivenza: fornire preemptive analgesia con ketoprofene 4 mg / kg per via sottocutanea e ripetere la stessa dose a 12 ore dopo l&#39;intervento </li><li> Nelle nostre condizioni sperimentali, eutanasia è stata eseguita a 24 ore post-chirurgico da CO 2 inalazione. </li></ol>

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Il finanziamento per la produzione di questo video-articolo è stato fornito da Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, Regno Unito), che produce gli strumenti laser Doppler riportati nel nostro studio sperimentale. Il protocollo sperimentale è stato approvato dalla commissione per l&#39;Animal Care dell&#39;Università degli Studi di Milano Bicocca, in conformità con le linee guida nazionali per l&#39;uso di animali da laboratorio (DL 116/1992) e la direttiva dell&#39;Unione europea per esperimenti su animali (2010/63/UE ), su licenza del progetto (n. 219/2011-B) da parte del Ministero della Salute italiano.

Abbiamo sviluppato in-house un sistema semplice ed economico per un attaccamento sicuro di una o più sonde a doppia fibra (penetrazione) LD al cranio intatto dei ratti durante la procedura MCAO. Seppur apparentemente un problema banale, ottenendo un fissaggio affidabile della sonda LD al cranio è in realtà una questione importante in questo modello sperimentale, in quanto è il presupposto per un segnale di rilevamento regolare e un monitoraggio efficace di perfusione cerebrale. Procedure invasive, come i fori bave e le viti ossee, di solito prolungare il tempo chirurgico e introdurre variabili più sperimentali relativi alla craniotomia, e questo può scoraggiare i ricercatori ed evitare loro di utilizzare il monitoraggio LD. D&#39;altra parte, l&#39;uso di singola fibra (bassa penetrazione) sonde, che sono più sottili e relativamente facile da incollare direttamente alla superficie del cranio, dà bassa qualità del segnale e non può essere utilizzato in modo affidabile con ratti adulti senza forare o diradamento cranio. Abbiamo usato materiali semplici e di basso costo, come la gomma naturale, tubi di plastica e un mandrino metallico. Una misura porta sonda può essere prodotta in pochi minuti e adattato alle condizioni sperimentali. Questi porta sonde in grado di ospitare uno o più profonda penetrazione sonde LD, per il monitoraggio classico singolo sito sul core ischemico o per più siti di monitoraggio in diversi territori arteriosi nello stesso emisfero o tra i due emisferi. Porta sonde molti potrebbe essere prodotta, chimicamente sterilizzato, e conservati per uso futuro. Veterinaria approvato colla chirurgica (cyanoacrilate), accelerati da aria fredda, è utilizzato per fissare il supporto sonda intatta la superficie del cranio ratto, secondo le coordinate craniche desiderati. Infine, la sonda set-up è ulteriormente fissato in posizione mediante suture comuni. Il tempo complessivo di questa sonda LD set-up, dopo padroneggiare questa tecnica, è di circa 10 min. Come ho mostraton questo video, regolarmente monitorare la perfusione cerebrale nel MCA centrale territorio (LD sonda 1: cuore ischemica) e nelle regioni periferiche MCA territorio (LD sonda 2: principalmente una zona penombra). Nel nostro recente studio abbiamo dimostrato che la variabilità delle variazioni del flusso sanguigno in LD sonda 2 (media 52% ± 16% SD, rispetto al basale) è maggiore rispetto al LD ​​sonda 1 (media 31% ± 6% SD, rispetto al basale) e può essere usato per predire 4 tempi outcome. Possiamo fornire alcuni consigli sulla risoluzione dei problemi per i ricercatori che desiderano utilizzare il nostro in-house sistema sviluppato. All&#39;inizio dell&#39;esperimento, fare attenzione ad asciugare molto bene la superficie del cranio (con Merbromina e aria fredda) prima di collegare il supporto sonda per evitare il distacco prematuro. Inoltre, assicurarsi di applicare la colla sulla gomma naturale, evitando il contatto con l&#39;estremità aperta del tubo di plastica e la superficie ottica della sonda LD, per impedire poco segnale potenziali danni alla sonda. Nel legare la sutura intorno alla testa dell&#39;animale, prestare attenzione per evitare l&#39;ostruzione delle vie aeree (questo è impedito posizionando la sutura sopra l&#39;osso mandibolare). Dopo aver posizionato e garantire le sonde, fare attenzione a non i cavi delle sonde di trazione quando si accende l&#39;animale in posizione supina per la chirurgia del collo dell&#39;utero, questo passaggio richiede di solito due persone, una persona che tiene l&#39;animale e una seconda persona che tiene i cavi delle sonde e delicatamente posizionamento nella posizione desiderata. Infine, l&#39;eventuale contaminazione del sangue del twin-fibra LD sonda è facilmente gestito seguendo le istruzioni fornite dal produttore. Il nostro sistema ottimizzato per il monitoraggio di perfusione cerebrale, come mostrato in questo video, potrebbe fornire una alternativa più semplice, più rapido e più affidabile per la sonda set-up sistemi attualmente venduti da aziende commerciali in questo campo. Inoltre, si ritiene che l&#39;uso di questo sistema da altri ricercatori possono aumentare il pernoy dell&#39;emodinamica cerebrale nel campo sperimentale corsa, che portano allo sviluppo di una nuova generazione di terapie collaterali cerebrali.

Ricerca traslazionale sui fattori che influenzano emodinamici fisiopatologia e la terapia ictus deve essere attuata, in quanto questa importante questione è spesso paradossalmente trascurato dagli studi di ricerca di base 1. Monitoraggio perfusione cerebrale è uno strumento essenziale, ma sottoutilizzata, per una precisa modellazione ictus ischemico 2. A parte la conferma di occlusione vaso arterioso e l&#39;esclusione di emorragia subaracnoidea 3, il monitoraggio continuo della perfusione cerebrale può fornire dati utili circa il grado e la consistenza del deficit di perfusione, lo stato funzionale dei vasi collaterali intracranici e l&#39;effetto emodinamico di nuovi approcci terapeutici. Un recente studio condotto dal nostro gruppo indicano che il multi-sito di monitoraggio emodinamico possono essere utilizzati per valutare la circolazione intracranica garanzia e in grado di prevedere dimensioni dell&#39;infarto e deficit funzionale 4. Questi risultati sperimentali sono consistent con studi clinici che hanno dimostrato che le prestazioni funzionali della circolazione collaterale cerebrale è predittivo di outcome clinico nei pazienti con ictus ischemico 5, 6. Per questo motivo, collaterali cerebrali sono stati proposti come potenziale bersaglio terapeutico nella fase acuta di ictus ischemico 7. Laser-Doppler (LD) gli strumenti sono lo strumento più utilizzato per misurare la perfusione cerebrale in experimental ictus ischemico e il loro utilizzo è raccomandato dalle linee guida più recenti su questo tema 8. LD perfusione microvascolare strumenti misurano in un piccolo volume corticale, la profondità del segnale registrato dipendere dalla larghezza di separazione delle fibre, con sonde gemelle fibra LD permettono una penetrazione più profonda rispetto alle sonde singole fibre LD 9. Valori di flusso del sangue sono espressi come unità arbitrarie perfusione (PU) che indicano relativo piuttosto che assoluto del flusso sanguigno cerebrale. Taratura di PU è di solito eseguita usinnorme motilità g, secondo le istruzioni del produttore. LD flowmetry permette un continuo monitoraggio dinamico e generazione dei dati quantitativi all&#39;interno della stessa sessione. Tra i problemi tecnici che attualmente limitano l&#39;uso di LD, una questione importante è l&#39;ottenimento di un attaccamento sicuro e prolungato di una profonda penetrazione del laser Doppler sonda al cranio animale. Ciò è essenziale per il monitoraggio prolungato e se sonde multiple sono utilizzate per diversi territori arteriosi cerebrali, come si sta eseguendo nel nostro laboratorio. In particolare, prolungato tempo chirurgico è necessario se le sonde sono collegate al cranio con fori bave o viti cranici, mentre poco segnale attaccamento unsecure verifica se fibra singola (bassa penetrazione) LD sonde sono attaccati al cranio dalla semplice colla chirurgica. Twin fibra (profonda penetrazione) sonde LD fornire un segnale più alto e più coerente, ma sono più grandi di sonde a singola fibra e non può esserestaccati al cranio con colla chirurgica solo. In questo video, dimostriamo il nostro sistema ottimizzato per il monitoraggio della perfusione cerebrale durante transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media di filamento intraluminale nel ratto. Descriviamo un metodo semplice per ottenere un efficiente, misura, titolare basso costo per singolo o multiplo twin-fibra (deep-penetrazione) sonde LD, da utilizzare per il monitoraggio prolungato di perfusione cerebrale sul cranio intatto. La procedura chirurgica per MCAO transitoria nel ratto potrebbe essere visto nel video-articolo di Uluc e collaboratori 10 e non viene mostrato in questo video.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> MoorVMS LDF-2 canali Laser Doppler Monitor </td><td> Moor Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VP12 sonda </td><td> Moor Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente / Materiale </td></tr><tr><td> Doccol siliconato dimensioni filamento 4-0, diametro con rivestimento 0,39 millimetri </td><td> Doccol Corporation </td><td> 403956PK10 </td><td></td></tr><tr><td> Gomma naturale, ad esempio, ciucci comune per i neonati </td><td></td><td></td><td> Multiplofornitori </td></tr><tr><td> Stiletto in metallo, ad esempio da spinale ago 18 GA x 90 mm </td><td></td><td></td><td> Fornitori più </td></tr><tr><td> Tubi di plastica, ad esempio, dalla vena set per infusione 25 GA x 20 mm </td><td></td><td></td><td> Fornitori più </td></tr><tr><td> Non assorbibili sutura, spalmati, seta intrecciata </td><td></td><td></td><td> Fornitori più </td></tr><tr><td> Cianoacrilato colla chirurgica </td><td></td><td></td><td> Fornitori più </td></tr><tr><td> Isoflurano (100% v / v) per uso veterinario </td><td></td><td></td><td> Fornitori più </td></tr></tbody></table>

optimized system for cerebral perfusion monitoring in the rat stroke model of intraluminal middle cerebral artery occlusion

Il potenziale traslazionale di pre-clinica corsa dipende dalla precisione di modellazione sperimentale. Monitoraggio della perfusione cerebrale in modelli animali di ictus ischemico acuto permette di confermare il successo occlusione arteriosa ed escludere emorragia subaracnoidea. Monitoraggio della perfusione cerebrale può essere utilizzato anche per studiare la circolazione intracranica collaterale, che sta emergendo come fattori determinanti per la corsa e il risultato possibile bersaglio terapeutico. Nonostante un ruolo riconosciuto di monitoraggio laser Doppler perfusione nel quadro delle attuali linee guida per l&#39;ischemia cerebrale sperimentale, una serie di difficoltà tecniche idonee che ne limitano l&#39;uso diffuso. Uno dei problemi principali è l&#39;ottenimento di un attaccamento sicuro e prolungato di una profonda penetrazione del laser Doppler sonda al cranio animale. In questo video, dimostriamo il nostro sistema ottimizzato per il monitoraggio della perfusione cerebrale durante transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media di filamento intraluminale nel ratto. Abbiamo sviluppato in-casa di un metodo semplice per ottenere un supporto su misura per doppia fibra (deep-penetrazione) sonde laser Doppler, che consentono multi-sito di monitoraggio, se necessario. Un monitoraggio continuo e prolungato di perfusione cerebrale potrebbe essere facilmente ottenuta nel cranio intatto.

Transitoria MCAO (60 min) è stata indotta inserendo un siliconato filamento nella carotide esterna. Il filamento è stato poi spinto attraverso l&#39;estremità terminale della carotide interna fino all&#39;origine della MCA, sotto monitoraggio LD. Arteria carotide comune e arteria pterygopalatin state transitoriamente occluse durante l&#39;inserimento chirurgico del filamento. Una rappresentazione schematica della procedura chirurgica è mostrato nella Figura 1A. Le coordinate cranica per il posizionamento dei due sonde LD sono stati scelti in funzione del territorio sottostante arteriosa. Esperimenti preliminari con gelatina inchiostro perfusione (Figura 1B), hanno mostrato che il nucleo ischemico è atteso nel territorio MCA centrale (bregma -1 mm, 5 mm dalla linea mediana; Probe 1), mentre il flusso collaterale è atteso nel territorio borderzone tra l&#39; rami corticali delle arterie cerebrali medie e anteriore (bregma 2 millimetri, 2 mm dalla linea mediana; sonda 2). Emodinamica cerebrale è stata studiata utilizzando multi-sito sonde laser Doppler durante l&#39;intero periodo della procedura chirurgica, ossia prima, durante e dopo MCAO (Figura 2). Il deficit di perfusione cerebrale durante MCAO era più piccola e ha mostrato un alto grado di variabilità nella sonda 2 rispetto alla sonda 1, suggerendo differenze inter-individuali nelle prestazioni funzionali di collaterali intracranici in condizioni ischemiche. Il multi-sito di monitoraggio laser Doppler permette inoltre di studiare i cambiamenti emodinamici cerebrali durante l&#39;occlusione delle arterie cerebrali prossimali extra-cranici (arteria carotide comune, carotide interna, arteria pterygopalatin). Esito ictus è stata valutata 24 ore dopo la riperfusione in volume dell&#39;infarto, calcolato su 19 sezioni consecutive colorate con violetto cresolo (Figura 3), e Garcia funzionale neuroscore 11. Immunoistochimica per specifici marcatori di associato con lesione cerebrale ischemico è stata eseguita, in modo da ottenere una distribuzione topografica di perdita neuronale (proteina associata ai microtubuli 2, MAP2) e penombra ischemica (heat shock protein-70, Hsp70) in relazione al multi-sito di monitoraggio emodinamico di circolazione intracranica (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig1highres.jpg"/> Figura 1. Perfusione cerebrale durante il monitoraggio MCAO intraluminale nel ratto. A. Rappresentazione schematica della procedura chirurgica per MCAO transitoria. A siliconata filamento è stato utilizzato per occludere l&#39;origine del MCA, dopo essere stato introdotto nella carotide esterna e spinto attraverso l&#39;arteria carotide interna. Prossimali arterie cervicali erano o ligati (carotide esterna) o temporaneamente occluso (arteria pterygopalatin e arteria carotide comune) durante la proceduraDure. B. Un cervello rappresentante viene visualizzato dopo gelatina-ink colorazione. Perfusione transcardiaca di gelatina-inchiostro soluzione sono stati eseguiti 60 min dopo l&#39;insorgenza di ischemia, senza riperfusione. Il cervello normalmente perfuso è stata colorata da gelatina-ink ed è apparso come di colore grigio con il nero vasi colorati, mentre l&#39;area ischemica (non-perfuso) sono rimasti senza macchia (di colore rosa). Coordinate craniche per il posizionamento delle due sonde LD sono mostrati. Sonda 1 = -1 mm dal bregma, a 5 mm dalla linea mediana; sonda 2 = +2 mm dal bregma, 2 mm dalla linea mediana. <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig2highres.jpg"/> Figura 2. Emodinamiche cerebrali registrazioni utilizzando multi-sito Laser sonde Doppler. Un modello emodinamico tipico che suggerisce collaterali intracranici funzionalmente attivi in condizioni di ischemia è mostrato. In questo animale, tracciati LD mostrava una piccolaperfusione deficit er in Probe 2 canali, rispetto a sonda 1 canale, sia in fase di occlusione CCA e MCA occlusione. MCA-O = occlusione dell&#39;arteria cerebrale media. CCA-O = comune occlusione dell&#39;arteria carotide. UC = unità di perfusione. <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig3highres.jpg"/> Figura 3. Sezioni cerebrali rappresentative per il calcolo del volume dell&#39;infarto istologiche sezioni coronali (50 pm; n = 19 con intervallo di 250 micron; bregma 2,5 millimetri a -3,0 mm). Sono fissati in paraformaldeide al 4% e colorate con violetto cresolo 0,1%. Volume dell&#39;infarto è calcolato utilizzando il software di elaborazione immagini ImageJ, corretto per asimmetrie a causa di edema cerebrale inter-emisferiche, ed espressa in mm 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50214/50214fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> <img src alt = &quot;/ files/ftp_upload/50214/50214fig4.jpg&quot; = &quot;Figura 4&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50214/50214fig4highres.jpg&quot; /&gt; Figura 4. Immunocolorazione di marcatori molecolari di perdita neuronale e penombra rappresentativi sezioni cerebrali consecutivi sono presenti, che sono state colorate con violetto cresolo 0,1% (A) o immunostained con marcatori di perdita neuronale (proteina associata ai microtubuli 2, MAP2, B). E penombra ischemica (calore shock protein-70, Hsp70, C).

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Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Monitoraggio perfusione cerebrale è stata dimostrata per migliorare l&#39;accuratezza in modelli ictus ischemico. Le difficoltà tecniche spesso limitano l&#39;uso di questo strumento essenziale per la ricerca cerebrovascolare. In questo video, un sistema ottimizzato viene mostrato per ottenere un monitoraggio singolo o multi-sito emodinamico durante intraluminale occlusione dell&#39;arteria cerebrale media nel ratto.

Sistema ottimizzato per il monitoraggio perfusione cerebrale nel modello Rat Stroke of intraluminale occlusione dell&#39;arteria cerebrale media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

23.0K Views.  University of Milano Bicocca. Monitoraggio perfusione cerebrale è stata dimostrata per migliorare l'accuratezza in modelli ictus ischemico. Le difficoltà tecniche spesso limitano l'uso di questo strumento essenziale per la ricerca cerebrovascolare. In questo video, un sistema ottimizzato viene mostrato per ottenere un monitoraggio singolo o multi-sito emodinamico durante intraluminale occlusione dell'arteria cerebrale media nel ratto.

Video: Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Corsa di modellazione in Mouse - Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale con il Modello Filament

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

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Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modello murino di Mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

Intraluminali occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) Modello per l&#39;ictus ischemico con la guida flussimetria laser Doppler in topi

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

L&#39;applicazione di permanente legatura dell&#39;arteria cerebrale media nel mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilaterale occlusione comune Arteria carotide come uno stimolo precondizionamento in grado di indurre tolleranza ischemica precoce di focale Ischemia Cerebrale

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

L&#39;endotelina-1 indotta cerebrale media occlusione dell&#39;arteria modello per l&#39;ictus ischemico con guida laser flussimetria Doppler in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizzando una finestra craniale per visualizzare l&#39;arteria cerebrale media Durante endotelina-1 indotta da occlusione dell&#39;arteria cerebrale media

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell&#39;arteria cerebrale media distale

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Embolic occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) per l&#39;ictus ischemico con omologhi coaguli di sangue nei ratti

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Quantificazione della Protezione Neurovascular seguito ripetitivo ipossico precondizionamento e transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media nei topi

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...