Ringraziamo Bryan Venema e Eric Martinson per costruire l&#39;apparato electroformation. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of General Medical Sciences del National Institutes of Health (R01GM100718 a SEG) e il National Eye Institute del National Institutes of Health (R01EY017564 a SEG).

1. Deposizione di lipidi da solventi organici: Protocollo Classica <ol><li> Rimuovere i lipidi dalla conservazione a -20 ° C o -80 ° C; caldo per RT. Attenzione: i lipidi sono estremamente igroscopico, e molti sono sensibili all&#39;ossigeno. Coprire lipidi nella secca Argon o Azoto e in tutte le fasi minimizzare l&#39;esposizione all&#39;aria. </li><li> Se necessario, sospendere i lipidi in cloroformio o cicloesano a mg / ml 1-10; notare che le concentrazioni indicate dal costruttore sono in genere solo nominale ATTENZIONE: Indossare guanti ed altri dispositivi di protezione individuale appropriati quando si utilizzano solventi organici.. Rimuovere il PPE rapidamente se solvente viene versato su di loro, come la maggior parte dei materiali sono ancora permeabili a questi solventi e forniscono solo una protezione temporanea. </li><li> Pulire entrambi i lati di due 25 x 37,5 millimetri ITO vetrini rivestiti con etanolo </li><li> Mescolare i lipidi per ottenere i desiderati rapporti molari. Per ogni 1 cm 2 di area di ITO diapositive essere rivestita con labbroid, mix ~ 15-20 mg di lipidi. Ad esempio, se entrambi 25 x 37,5 millimetri diapositive dovevano essere completamente rivestito, saremmo di solito utilizziamo 30 ml di 10 mg / ml di miscela lipidica. Nota: aggiungere 0.1 mol% Texas Red-PDPE per l&#39;imaging a fluorescenza, e vedi sotto per avvertenze circa coloranti fluorescenti. </li><li> Verificare che il lato rivestito ITO dei vetrini è rivolto verso l&#39;alto, misurando la resistenza di superficie con un ohmetro o multimetro. </li><li> Aspirare i lipidi in una resistente ai solventi siringa. Attenzione: Nessun colle o plastica, diversi da PTFE, devono contattare il solvente organico. </li><li> Con l&#39;ago della siringa non proprio toccare la superficie ITO, applicare lentamente il lipide muovendo l&#39;ago avanti e indietro attraverso la diapositiva. Coprire la superficie il più uniformemente, in cerca di un &quot;arcobaleno lucentezza&quot; sulla superficie del vetro. </li><li> Porre i vetrini rapidamente sotto &lt;1 Torr (1 mmHg) vuoto per 0,5-1 ore per eliminare ogni traccia di solvente. Rilascio del vuoto con gas inerte. </li><li> Applicare una guarnizione in silicone, con unsottile strato di silicone vuoto grasso su entrambi i lati. Lasciare almeno 5 mm di diapositiva non coperto esposto ad una estremità della slitta. </li><li> Procedere immediatamente alla Sezione 4. </li></ol> 2. Piccolo Preparazione liposomi per disidratazione controllata <ol><li> Preparare la miscela di lipidi, come nei passi da 1.1 a 1.4. </li><li> Asciugare i lipidi utilizzando un flusso di gas argon o azoto in una provetta di coltura diametro 10-15 mm. Per piccole quantità di lipidi, ≤ 0,5 mg, la pellicola risultante può essere idratato direttamente dopo la messa sotto vuoto per 0,5-1 ore per rimuovere il solvente residuo; procedere al punto 2.5. Quantità maggiori di lipidi tendono ad intrappolare solventi organici in un gel denso, anche sotto vuoto, e sono più preparati mediante liofilizzazione; vedi procedura 2.3-4. </li><li> Sospendere il film lipidico essiccato in cicloesano, coprire con Argon e sigillare con un tappo, porre la provetta in un blocco freddo e congelare a -80 ° C per 1 ora minimo. </li><li> Posizionare il blocco freddo e lipidi campione in un sistema di vuotoin grado di raggiungere i 100 mTorr. Applicare il vuoto, lo farà &quot;stallo&quot; a circa 1 Torr come sublima solvente off. Una volta solvente viene completamente rimosso (~ 1 ora) vuoto scenderà sotto questo livello. Rilascio del vuoto con gas inerte e sigillare il tubo o idratare immediatamente. </li><li> Mentre i lipidi sono sotto vuoto, buffer di idratazione Degas usando il vuoto e sparge 15-17. </li><li> Idratare la lipidi utilizzando tampone degasato in finale concentrazione 1-10 mg / ml. Lasciare i lipidi per idratare lentamente. Dopo 30 minuti-1 ora, vortice di rompere grumi rimasti. Attendere un ulteriore 0,5-1 ore per consentire la completa idratazione. Utilizzare un osmoticant, come il sorbitolo o saccarosio fino a 200 mM, per prevenire la disidratazione completa in passi di seguito. </li><li> Preparare liposomi 100-200 nm di diametro per estrusione. Vedi protocollo di estrusione del produttore per i dettagli. Si noti che il buffer deve avere meno di 25 ~ forza ionica mM, o protocolli di tensione electroformation speciali saranno necessari nella sezione 4. </li></ol> 3.Deposizione di lipidi da disidratazione controllata di liposomi <ol><li> Attenzione: Il nostro protocollo richiede lipidi da collocare in equilibrio vapore con soluzioni saline sature per molte ore. Si consiglia vivamente di eseguire il protocollo in atmosfera di gas inerte, con un vano portaoggetti o contenitore simile. </li><li> Attenzione: se la preparazione di campioni contenenti proteine, evitare di completa disidratazione. Idratare l&#39;atmosfera in un vano chiuso con un bicchiere di acqua calda o di un umidificatore a base sonicator. Utilizzare un igrometro per assicurarsi che ci sia almeno il 30% di umidità relativa. Utilizzare sorbitolo o saccarosio nel piccolo buffer di liposomi come ulteriore precauzione per prevenire la disidratazione totale. </li><li> Preparare una soluzione satura di adeguata umidità relativa. Obiettivo umidità dipende dalla osmolarità della preparazione delle vescicole. Per i preparati con osmolarità fisiologica, utilizzare 30-45% di umidità relativa, mentre i preparativi delle vescicole bassa osmolarità possono essere adeguatamente disidratato inequilibrio con il 75-90% di umidità relativa (vedi anche tabella 1). </li><li> Mettere la soluzione satura di sale e il sale in eccesso in un contenitore ermeticamente sigillabile con un ripiano interno. Contenitori per alimenti commerciali per lo yogurt e muesli funzionare molto bene. Sostituire lo scaffale dopo il riempimento, e assicurarsi fluido è 5-10 mm al di sotto della mensola. </li><li> Pulire vetrini rivestiti di ITO come nella sezione 1. Utilizzare il multimetro per determinare quale lato è conduttivo, ed etichettare il lato non conduttivo con il nome del campione. </li><li> Ungere leggermente entrambi i lati del silicone (USP VI) guarnizione (s) con uno o più fori. </li><li> Posizionare il lato conduttivo diapositive sulla panca, e applicare la guarnizione (s) per ciascuna diapositiva a cui verrà applicato lipidico, assicurandosi che vi sia almeno 5 mm di diapositiva esposta ad una estremità per collegare all&#39;apparato electroformation. Smooth la guarnizione per garantire una buona tenuta. </li><li> Diluire la preparazione vescicola in un buffer isosmotic basso contenuto di sale per ~ 1-2 mg / ml. Troviamo che Concentrazione superiorezioni producono scarsi risultati. </li><li> Applicare lipidi alla diapositiva in gocce microlitri 1-10. Gocce più piccole producono generalmente risultati migliori. </li><li> Posizionare il cursore sul ripiano interno sopra la soluzione satura di sale e sigillare il contenitore ermeticamente. Lasciare a temperatura ambiente per 3 ore di O / N. Il contenitore può essere posto a 4 ° C, ma si noti che per alcuni sali, l&#39;umidità relativa dipende fortemente dalla temperatura, e che freddo aumenterà tempo di equilibrazione. </li><li> Il film risultante può avere una leggera lucentezza arcobaleno ad esso, ma in ogni caso dovrebbe apparire quasi essiccato. Soluzioni a partire altamente osmotici possono essere impossibile asciugare completamente per un film lipidico, questo non pregiudicherà i risultati. </li></ol> 4. Electroformation di liposomi giganti <ol><li> Film lipidici, specialmente quelli formati da liposomi vengono disidratati, si spostano facilmente. Cautela idrato ogni pozzetto inserendo un ago di siringa 27 G sul bordo della guarnizione e applicando lentamente buffer. Buffer possonocomprendono acqua, ≤ 200 mM saccarosio, ≤ 1 M sorbitolo e ≤ 5 HEPES. Più di 10 mM di soluzione salina può richiedere protocolli di tensione electroformation alternativi. Troppo-pieno ogni guarnizione ben di ~ 10%. </li><li> Nota: una volta che i lipidi sono idratati, procedere rapidamente attraverso i passaggi rimanenti, dal momento che i film di lipidi iniziano a delaminate immediatamente. Resa e dimensioni sono massimizzati se electroformation inizia prontamente. </li><li> Con un movimento uniforme, applicare una seconda slitta, faccia conduttivo ITO in, per la parte superiore della guarnizione. Assicuratevi di avere almeno 5 mm di sporgenza al di fuori della zona guarnizione e di fronte al primo sbalzo. Premere delicatamente per garantire una buona tenuta. </li><li> Pulire le due sporgenze che utilizzano l&#39;etanolo e verificare che le parti che affrontano la guarnizione sono conduttivi con il multimetro. </li><li> La camera può essere ulteriormente fissato con parafilm o leggeri tensione clip a molla, se desiderato. </li><li> Collegare la camera electroformation ad una sorgente di tensione, garantendo in alluminio o rame bar, &quot;EMI Gasket schiuma &quot;, o nastro conduttivo adesivo alle superfici conduttive delle due slitte. Usiamo EMI guarnizione in schiuma. piani per una giga e morsetto sono mostrati in figura 5. </li><li> Verificare che non vi sia un corto elettrico tra i contatti, e che i contatti sono connessi correttamente alle superfici ITO, usando il multimetro. </li><li> Riscaldamento della camera di 10 ° C la temperatura più alta di fusione di qualsiasi dei lipidi presenti; esempio per DPPC, riscaldare a 52 ° C minimo, 10 ° C sopra la temperatura di fusione catena di 42 ° C. </li><li> Per buffer basso contenuto di sale, applicare una Hz sinusoidale 10, ~ 0.7 V rms per ogni millimetro gap tra le due superfici rivestite ITO, per 60-90 min. Per i tamponi alti di sale, altri protocolli di tensione devono essere utilizzati (vedi riferimenti). </li></ol> 5. Imaging e risoluzione dei problemi <ol><li> Immagine del liposomi utilizzando un microscopio invertito dotato di un cubo filtro rodamina o Texas coloranti rossi. Il liposoma dovrebbe essere sferica,prevalentemente unilamellare a occhio, e priva di difetti come &quot;stringhe&quot; appesi fuori il liposoma. </li><li> Se i liposomi sono troppo piccole, usare meno lipidi. </li><li> Se ci sono molti difetti o poche liposomi, ciò può essere dovuto al lipidi gel trifase. Considerare l&#39;aumento della temperatura electroformation. </li><li> Se pochi o nessun liposomi giganti formate affatto dal disidratate piccoli liposomi, ridurre la forza osmotica del buffer liposoma, o aumentare la forza osmotica del buffer electroformation. Uno spunto di tampone nella soluzione tampone concentrata interstiziale può causare delaminazione del film lipidico depositato. </li><li> Se resa vescicola, la qualità o la dimensione è scarsa, e si inclusi sali o buffer pH nel electroformation o liposomi buffer, considerare protocolli di tensione electroformation alternativi. Per esempio, Pott, et al. 11, raccomandare un protocollo a tre fasi utilizzando una sinusoide 500 Hz, alzando la tensione da 50-1,300 Vpp / m in 30 min, tenendo per 90 min, lan diminuendo la frequenza di 50 Hz per 30-60 min. Platino o titanio elettrodi possono essere necessari in questo caso, ma questo non alterare sostanzialmente il protocollo. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Electroformation di liposomi giganti si è sviluppato in una tecnica flessibile, compatibile con diversi lipidi, preparati, e buffer. Attento controllo del processo di deposizione lipidica è più critico per il successo. Abbiamo presentato strumenti semplici per rendere deposizione controllata di lipidi da piccole preparazioni liposomiali un processo semplice. L&#39;umidità relativa è critica per la disidratazione dei liposomi iniziali, e il valore ottimale varia con la concentrazione iniziale di soluti nella sospens...

Liposomi giganti (spesso chiamati vescicole unilamellari giganti, o GUVs) sono stati principalmente utilizzati per lo studio della fisica e della chimica fisica di doppi strati lipidici, inclusi studi di deformazione doppio strato, la coesistenza di fase laterale (&quot;zattere&quot;), la fusione di membrana, ecc 1-4. Hanno una cella grossolanamente struttura simile: guscio sferico di membrana che circonda un interno acquosa che può essere facilmente reso diverso rispetto al tampone acquoso circostante. Essi sono, per definizione, ≈ 1-100 micron di diametro, in modo che possano essere esposte utilizzando una varietà di approcci di microscopia ottica. Possono essere realizzati utilizzando gradienti osmotici tesa o dalla tensione applicata meccanicamente, in modo che mentre generalmente morbido, le loro proprietà possono essere manipolati per una facile movimentazione. In particolare, il controllo della &quot;rigidità&quot; del liposoma rende semplice per formare patches &quot;liposoma iscritti&quot; o asportato per elettrofisiologia. In passato, canale ionico ricostituzione è stata in gran parte svolta in planare lipidi bilayer. Ora, la capacità di formare le patch da liposomi giganti e utilizzare il notevole faretra di strumenti sviluppati per elettrofisiologia convenzionale (microscopia a fluorescenza, micropipetta aspirazione, rapido perfusione e il controllo della temperatura, ecc) rende liposomi giganti sempre più attraente per gli studi di ricostituzione 5,6. Liposomi giganti sono stati fatti da molte strategie. Infatti, liposomi giganti formano spontaneamente da un processo di rigonfiamento quando un film lipidico essiccato viene reidratato 4,7,8. Il desiderio di preparare più rapidamente grandi, liposomi più uniformi ha portato i ricercatori ad altri approcci, primo fra tutti electroformation 1,9. Electroformation basa anche su idratazione di un film lipidico essiccata, ma accelera il processo attraverso l&#39;applicazione di un campo elettrico oscillante attraverso il film lipidico. Il campo viene applicato tramite due elettrodi, sia fili di platino o di indio-stagno-Oxide (ITO) vetrini rivestiti, separati da acqua otampone e su cui i lipidi sono depositati. Accelerando il gonfiore di liposomi, si raggiunge una maggiore resa di liposomi più grandi. Così, electroformation è diventato il metodo predefinito per produrre liposomi giganti 4. Il meccanismo di electroformation non è pienamente compreso, e la maggior parte dei protocolli sono sviluppati empiricamente (es. 10,11). Tuttavia, siamo in grado di imparare un po &#39;su cosa aspettarsi considerando la teoria e alcuni risultati empirici. E &#39;opinione diffusa che electroformation avviene guidando il flusso elettro-osmotico di cuscinetto tra i singoli doppi strati lipidici accatastati nel film lipidico depositato 10,11. Accoppiamento elettrostatico a fluttuazioni termiche dei doppi strati lipidici è probabilmente coinvolto anche 12. Queste ipotesi qualitativamente predicono limiti superiori per la frequenza di campo elettrico e forza che può essere utilizzato 10,12. In particolare, si prevede che le soluzioni ad alta conduttività ( <eM&gt; cioè soluzioni saline fisiologiche) riducono le forze electrohydrodynamic che può avviare la electroformation liposomi 12. Portate elettroosmotico generalmente diminuiscono all&#39;aumentare della concentrazione di sale e sono spesso alzato a qualche campo elettrico frequenza di oscillazione (es sebbene in una diversa geometria, Green et al. 13). Così, più elevate intensità di campo e frequenze più alte sono ragionevoli per le soluzioni ad alta conduttività, entro i limiti di 10. Tuttavia, proteine ​​di membrana sono suscettibili di essere incompatibile con il solito metodo di deposizione lipidi sul elettrodi per la procedura electroswelling, ossia in solventi organici che vengono poi evaporato per lasciare un sottile film lipidico. Ci sono due principali sentieri intorno a questa difficoltà: per incorporare le proteine ​​dopo la formazione di liposomi giganti, o di adattarsi come i lipidi si depositano. Il nostro approccio si basa su altri 5,11 per depositare i lipidi e ricostituito proteina di membrana insieme da una sospensione di piccole o grandi &quot;proteoliposomi&quot;. Descriviamo il processo lungo e più impegnativo di produrre proteoliposomi da purificata proteine ​​e lipidi altrove (Collins e Gordon, in revisione). Qui si descrive il protocollo, in assenza di qualsiasi proteina, ma è la stessa quando la proteina è compresa; includiamo risultati mostrano che proteoliposomi contenenti il ​​canale ionico TRPV1 può essere trasformato in GUVs e utilizzati per patch-clamp elettrofisiologia. In qualsiasi approccio electroformation, ispezione visiva del campione lipidi durante il processo di deposizione di lipidi è fondamentale per il successo. Il nostro approccio può essere pertinente al di là della domanda specializzata di canale ionico ricostituzione. Nel tempo da quando abbiamo sviluppato questo protocollo e ora, è stato anche dimostrato come il modo in cui i lipidi sono depositati su elettrodi per electroformation colpisce l&#39;eterogeneità composizionale dei GUVs risultanti. BayKal-Caglar et al. 14 hanno mostrato che GUVs formate da liposomi attentamente disidratate avevano 2,5 volte più piccola variazione nella temperatura di transizione di miscibilità GUVs formati da miscele di vari fosfolipidi e colesterolo. Il loro lavoro indica che i lipidi, e soprattutto il colesterolo, possono precipitare dalla miscela lipidica quando depositati da solventi organici, con conseguente grande variazione spaziale nella composizione del film lipidico depositato. Questo è particolarmente importante per gli studi del comportamento di fase membrana lipidica, ma può anche essere fondamentale per esperimenti quantitativi sulla funzione del canale ionico. Protocollo Baykal-Caglar et al s &#39;.&#39; Simile ma non identico al nostro, ed i lettori sono incoraggiati a studiare pure. Questo protocollo (vedere la panoramica, la Figura 1) è uno dei tanti che potrebbero essere utilizzati. In linea di principio electroformation successo dipende dalla miscela lipidica, idratazione, temperatura, altri soluti (in particolare ioni), e diNaturalmente la tensione e la frequenza utilizzata in formazione. Come electroformation diventa meglio compresa, ci aspettiamo di affinare il nostro protocollo di più. Infine, vi è spesso una ripida curva di apprendimento in elettroformatura liposomi giganti. Suggeriamo la padronanza del protocollo convenzionale (sezioni 1 e 4, e, se necessario, la sezione 5) prima di imparare a depositare i lipidi dalle sospensioni liposomiali (sezioni 2-5).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

La ricostituzione dei canali ionici in membrane lipidiche chimicamente definite per registrazione elettrofisiologica è una tecnica potente a individuare e studiare la funzione di queste proteine ​​importanti. Tuttavia, le preparazioni classiche, come doppi strati planari, limitano le manipolazioni ed esperimenti che possono essere eseguite sul canale ricostituito e il suo ambiente di membrana. La struttura più alveolare dei liposomi giganti permette esperimenti di patch-clamp tradizionali senza sacrificare controllo dell&#39;ambiente lipidico. Electroformation è un mezzo efficace per produrre liposomi giganti&gt; 10 micron di diametro, che si basa sull&#39;applicazione della tensione alternata ad un sottile film lipidico, ordinata depositato su una superficie dell&#39;elettrodo. Tuttavia, poiché il protocollo classico prevede i lipidi da depositare da solventi organici, non è compatibile con meno robusti proteine ​​di membrana come canali ionici e deve essere modificata. Recentemente, protocols sono stati sviluppati per electroform liposomi giganti da parzialmente disidratati piccoli liposomi, che si sono adattati a liposomi contenenti proteine ​​nel nostro laboratorio. Presentiamo qui lo sfondo, le attrezzature, le tecniche, e le insidie ​​di electroformation di liposomi giganti da piccole dispersioni liposomi. Cominciamo con il protocollo classico, che dovrebbe essere masterizzato prima di tentare i protocolli più impegnativi che seguono. Dimostriamo il processo di disidratazione parziale controllata di piccoli liposomi con equilibrio vapore con soluzioni saline sature. Infine, abbiamo dimostrato il processo di electroformation stesso. Noi descriveremo semplice attrezzatura, poco costoso che può essere fatto in casa per la produzione di liposomi di alta qualità, e descrivere l&#39;ispezione visiva della preparazione in ogni fase per garantire i migliori risultati.

Nei nostri esempi, preparando liposomi da una miscela di circa 55% molare POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-phosphocholine), 15 mol% POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-phosphoserine , 30 mol% colesterolo, e 0.1 mol% Texas Red-etichettato 1,2-dipalmitoil-sn-phosphoethanolamine (TxR-PDPE). Questa composizione è stata scelta da circa rappresentante della radice dorsale lipidi gangliari 18. Prendiamo atto che il 15% molare addebitato lipidi (qui POPS) è vicina al limite di ciò...

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Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Views.  University of Washington. Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Ricerca

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Preparazione di doppi strati artificiali per esperimenti Elettrofisiologia

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elettrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Introduzione alla membrana supportata Solid Sulla Elettrofisiologia

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...