Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of concede Salute R01-R01-HL70393 e NS060706 a JCJC è Professore di Ingegneria Biomedica sul Spencer T. Olin Endowment.

1. L&#39;iniezione di mRNA in oociti <ol><li> Iniettare ,05-50 ng di RNA messaggero che è stato trascritto in vitro in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI) con Nanoject II Auto-nanoliter Injector (Drummond società Scientific, modello 3-000-204). Ripetere l&#39;iniezione su una decina di ovociti per ogni mRNA. </li><li> Risciacquare gli ovociti iniettati due volte usando ND-96 soluzione (96 mM di cloruro di sodio (NaCl, il signor 58,44 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, il signor 74,56 g / mol), 1,8 mM di cloruro di calcio (CaCl 2 • 2H 2 O , il signor 147,02), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, il signor 203,31 g / mol), 5 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, il signor 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato di sodio (il signor 110,04 g / mol) e 1x penicillina-streptomicina. pH 7,6), poi mettetele in una piastra di coltura e incubare a 18 ° C per 2 giorni +. </li></ol> 2. Preparazione del sistema di perfusione <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Illustrazione del ValveLink Automatizzare 16 Sistema di perfusione. Il sistema di perfusione utilizza l&#39;azoto pressurizzato per spingere soluzioni di perfusione fuori dei serbatoi soluzione, attraverso i tubi di perfusione, e la matita perfusione e mancia escluse. Il flusso di ogni flusso della soluzione di perfusione è controllato da una valvola serbatoio e una valvola elettronica. In questo protocollo, uno dei serbatoi non è pressurizzato e funziona come un raccoglitore così come un meccanismo di rilascio della pressione. (Foto adattato da http://www.autom8.com sito venditore) <ol><li> Collegare i tubi alla matita perfusione. Accendere il controller valvola elettronica e aprire le valvole elettroniche. </li><li> Per garantire che i tubi e la matita perfusione sono liberi di bolle d&#39;aria e di intasare, spingere deionizzata (DI) attraverso ogni tubo usando una siringa riempita con acqua deionizzata. </li><li> Collegare i tubi ai serbatoi soluzione e aprire la valvola della bombola di gas da applicare azoto pressurizzato. </li><li> Aprire il rubinetto serbatoio per riempire il tubo con la soluzione di riserva. Flick la valvola serbatoio per rimuovere le bolle nella soluzione, se necessario. Chiudere la valvola dopo che il tubo è riempito di soluzione. </li><li> Riempire la punta perfusione con acqua e avvitarlo sulla matita perfusione. Fare attenzione a non intrappolare le bolle quando si collega la punta. </li><li> Fissare la matita perfusione allo stadio bagno con plastilina. Assicurarsi che la punta perfusione è in bagno. Il sistema di perfusione è ora impostato. </li><li> Aggiungere acqua deionizzata nella vasca da bagno. Assicurarsi che la punta perfusione è sommerso in acqua. </li><li> Prova che ogni soluzione perfusione esce dalla punta perfusione correttamente. Chiudere la valvola elettronica collegata al tubo di raccolta dei rifiuti e aprire la valvola per una soluzione di perfusione alla volta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil) -1 - piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;- tetracetico acido (EGTA, M r 380,35 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + e Mg2 + viene aggiunto alla concentrazione desiderata quando necessario). Sotto il microscopio, osservare il getto di liquido di perfusione che esce dalla punta di perfusione. Chiudere la valvola per la soluzione di perfusione e aprire la valvola per la raccolta dei rifiuti. Il getto perfusione dovrebbe quasi scomparire. Ripetere la stessa prova per tutte le soluzioni di perfusione. </li><li> Quando hai verificato che tutte le soluzioni di flusso di perfusione correttamente, sostituire acqua distillata nella vasca da bagno con la soluzione (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM cloruro di potassio (KCl, M r 74,56 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)). </li></ol> 3. Patch di serraggio <ol><li> Ricopertura l&#39;elettrodo di registrazione Ag con AgCl prima di ogni patch di serraggio sessione. In primo luogo, rimuovere il filo elettrodo dal titolare pipetta e immergere la metà punta del filo elettrodo in un flacone di candeggina fresca per almeno 15 minuti. Questo depositi uno strato di AgCl sul filo. </li><li> Sciacquare il filo elettrodo con acqua deionizzata e asciugare. Quindi installare l&#39;Ag / AgCl indietro nel supporto pipetta. </li><li> Collegare il (di riferimento) elettrodo bagno al headstage e posizionarlo nella vasca da bagno. Questo prepara gli elettrodi per la registrazione. </li><li> Ora preparate per l&#39;acquisizione dei dati. Accendere il computer e inserire la chiave hardware alla porta stampante del computer. La chiave hardware deve essere collegato per poter utilizzare il software di acquisizione dati, che è HEKA impulsi. </li><li> Accendere l&#39;amplificatore (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) e iniziare a HEKA Pulse. Caricare il file di protocollo e regolare le impostazioni di configurazione, come la Scala di stimolo. L&#39;obiettivo per regolare le impostazioni di configurazione è di assicurare che il potenziale di test è esattamente uguale al potenziale di comando. Questo prepara le apparecchiature di acquisizione dati. </li><li> Preparare ovociti. Immergere l&#39;ovocita in soluzione stripping (200 mm N-Metil-D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM aspartato (senza K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;-tetracetico acido (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), pH viene regolato a 7,4 con idrossido di sodio (NaOH, M r 40,0 g / mol) per 5 - 10 min. La soluzione stripping stacca la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile mettere a nudo la membrana vitellina. </li><li> Delicatamente la striscia di membrana vitellina da ovocita usando due paia di pinzette. Un ovocita devitellinized è estremamente fragile e quindi deve essere spostato il meno necessario. </li><li> Avendo cura di evitare di esporre l&#39;ovocita devitellinized a bolle d&#39;aria o, usare una pipetta di vetro riempita con una soluzione sufficiente per trasferire l&#39;ovocita al bagno. Questo prepara l&#39;ovocita per la registrazione. </li><li> Preparare pipette patch. Tirare le pipette di vetro dopo aver inserito un tubo capillare di vetro (VWR International, Cat # 53432-921) in una Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipetta Puller. Osservare le pipette al microscopio per determinare la forma della punta e diametro di apertura. Il diametro di apertura dovrebbe essere di 2-4 micrometri. </li><li> Per ridurre la corrente capacitiva durante la registrazione e per garantire una punta liscia, cappotto la punta con la cera e poi il fuoco-polacco. </li><li> Riempire la punta della pipetta posizionando la punta della pipetta all&#39;interno della soluzione di pipetta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM cloruro di magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)) e il disegno lo stantuffo. Questo bagna la punta. </li><li> Riempire la pipetta 1 / 3 pieno con una soluzione pipetta usando una siringa e inserire la pipetta nel supporto pipetta con l&#39;Ag / AgCl all&#39;interno elettrodo e contatto con la soluzione di pipetta. Questo prepara la pipetta di patch. </li><li> Per accise uno inside-out patch dal ovocita preparato, trovare il chiaro vantaggio di ovociti al microscopio. Spostare la pipetta di patch vicino al ovociti mediante manipolatore. Registrare la resistenza di serie pipetta. La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno. </li><li> Spingere lentamente la pipetta contro l&#39;ovocita fino a quando la resistenza raddoppia. </li><li> Applicare aspirazione delicato per la membrana per via orale attraverso un tubo di aspirazione che è collegato al titolare pipetta fino a quando un giga ohm sigillo è ottenuto. Stabilizzare la patch tenendolo in tensione -30 mV per un paio di minuti. </li><li> Per ottenere un inside-out patch, la patch da accise rapidamente spingendo la pipetta ulteriormente nel citoplasma dell&#39;ovocita e poi delicatamente tirando fuori. </li><li> L&#39;inside-out patch è ora pronto per il bloccaggio. Spostare la pipetta tenendo la inside-out patch per circa 100 micron di distanza dall&#39;apertura della punta perfusione. </li><li> Chiudere la valvola elettronica per la raccolta dei rifiuti e aprire la valvola serbatoio per la soluzione di perfusione desiderato </li><li> Iniziare a registrare le correnti attraverso la patch. Modificare le soluzioni di tensione e perfusione come desiderato. </li><li> Quando si è finito di registrare, pulire la perfusione tubi, matita e punta spingendo attraverso l&#39;acqua deionizzata per evitare intasamenti. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Durante la preparazione di ovociti per la patch clamp, il trattamento 5-10 min di soluzione stripping sarebbe staccare la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile togliere la membrana vitellina. La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno. Che segue è una registrazione rappresentante della wild-type canali BK su una patch di membrana dell&#39;ovocita. In alto a sinistra, le onde quadre indicano la tensione applicata la patch - il secondo passo di aumenti di tensione da 50 mV a 200 mV con incrementi di 50 mV. Di seguito le tracce corrispondente corrente quando la soluzione di perfusione è nominale 0 Ca 2 + (libero [Ca 2 +] è di circa 0,5 nM). L&#39;apiega di ampiezza della corrente indica che la probabilità di apertura dei canali BK aumenta con la tensione. Sul lato destro, la stessa patch è perfuso con 1.0 mM Ca 2 + quando è applicato con il protocollo stessa tensione. L&#39;ampiezza della corrente aumenta di più sotto la stessa tensione, indicando che la probabilità aumenta con l&#39;aperta [Ca 2 +]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Figura 2" />

<ol>
	<li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes:+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels.">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pfl&#252;gers Arch. 407, 577-588 (1986).</li><li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maxi-K+(Ca),+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily.">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li><li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hair+cell+tuning.">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li><li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder.">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li><li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone.">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li><li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family.">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li><li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mg2++enhances+the+function+of+BK-type+Ca2+-activated+K++channels.">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li><li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+mechanism+of+BK+(Slo1)+channels:+so+near,+yet+so+far.">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li><li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conductance+Ca2+-activated+K++(BK)+channel:+activation+by+Ca2++and+voltage.">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li><li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K++channel.">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li><li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2+-dependent+activation+of+BK-type+mslo1.">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li><li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2++coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1.">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li><li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term={beta}+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia.">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema di espressione degli ovociti è ideale per la caratterizzazione elettrofisiologica di canali voltaggio-dipendenti di ioni a causa di fondo relativamente basso di canali endogeni. Inoltre, poiché si tratta di un sistema di espressione transiente, fornisce un metodo efficiente di eseguire studi di mutagenesi di questi canali. Tuttavia, va notato che il sistema di espressione ovocita è diverso da quello in cellule di mammifero, quindi ci possono essere differenze di modificazioni post-traduzionali ed associazi...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion System and Electronic Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutoMate Scientific, Inc.</td>
<td>ValveLink 16</td>
<td>Inner diameter of perfusion tip: 100 microns</td>
</tr>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>CKX31</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>AXOPATCH 200B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer Interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>INSTRUTECH Corporation</td>
<td>ITC-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>CV 203BU</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patch clamp and perfusion techniques for studying ion channels expressed in xenopus oocytes

Il protocollo presentato qui è stato progettato per studiare l&#39;attivazione della conduttanza di grandi dimensioni, tensione e Ca 2 +-attivati ​​K + (BK) canali. Il protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rapporto struttura-funzione di canali ionici e di altri recettori dei neurotrasmettitori 1. Canali BK sono ampiamente espresse in diversi tessuti e sono stati implicati in molte funzioni fisiologiche, tra cui regolazione della contrazione della muscolatura liscia, regolazione frequenza di cellule ciliate interne e la regolamentazione del rilascio dei neurotrasmettitori 2-6. BK canali sono attivati ​​da depolarizzazione della membrana e dal intracellulare di Ca 2 + e Mg 2 + 6-9. Pertanto, il protocollo è stato progettato per controllare sia il potenziale di membrana e la soluzione intracellulare. In questo protocollo, l&#39;RNA messaggero di canali BK viene iniettato in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI), seguita da 2-5 giorni di incubazione a 18 ° C 10-13. Patch di membrana che contengono uno o più canali BK sono escisse con l&#39;inside-out configurazione utilizzando tecniche di patch clamp 10-13. Il lato intracellulare della patch è perfuso con soluzioni desiderato durante la registrazione in modo che l&#39;attivazione del canale in condizioni diverse può essere esaminato. Per riassumere, l&#39;mRNA dei canali BK viene iniettato in oociti di Xenopus laevis per esprimere le proteine ​​canale sulla membrana dell&#39;ovocita, tecniche di patch clamp vengono utilizzati per registrare la corrente che fluisce attraverso i canali controllati in tensione e soluzioni intracellulari.

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Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi in<em&gt; Ovociti di Xenopus</em&gt; Mediante iniezione di RNA messaggero. La soluzione intracellulare durante le registrazioni di patch clamp è controllato da un sistema di perfusione.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

20.8K Views.  Washington University in St. Louis. Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi in Ovociti di Xenopus Mediante iniezione di RNA messaggero. La soluzione intracellulare durante le registrazioni di patch clamp è controllato da un sistema di perfusione.

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

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Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

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Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...