Questo lavoro è stato supportato da F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), e R01 NS052669 (GKP) e EIA9100012. Gli autori ringraziano Eileen Kasperek per la competenza e l&#39;assistenza con la biologia molecolare e la cultura dei tessuti; e Jason Myers per la condivisione dei dati ottenuti dai primi neuroni corticali prefrontali.

1. Coltura cellulare e proteine ​​Expression <ol><li> Mantenere cellule HEK293 (numero ATCC CRL-1573) tra i passaggi 22 e 40, che comprende i passaggi eseguiti da ATCC, in coltura monostrato in DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina miscela al 5% di CO 2 e 37 ° C. Tra gli esperimenti, le cellule di passaggio in fiasche T25 5-20 diluizioni in un volume finale di 10 ml. Nota: Utilizzando cellule durante questi passaggi garantisce la salute delle cellule favorevole che consentirà per la formazione tenuta ottimale e la stabilità patch. </li><li> Per la trasfezione, le cellule HEK293 in piastra da 35 mm ad una densità di ~ 10 5 cellule / piastra, che corrisponde a ~ 0,5-0,6 ml di sospensione cellulare per ogni piatto e crescere le cellule in 2 ml di mezzo per 18-24 ore. </li><li> In una sterile 1,5 ml tubo da centrifuga, preparare la miscela di trasfezione per quattro piatti il ​​35 mm per l&#39;aggiunta (in questo ordine): (1) 1 mg di ciascun cDNA (GluN1, GluN2A, e GFP); (2) 315 ml diacqua bidistillata (DDH 2 O); (3) 350 ml di 42 mM 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), e (4) 35 ml di 2,5 M CaCl 2 goccia a goccia, che viene utilizzato per formare il precipitato. </li><li> Tubo Vortex per 5 sec e aggiungere 175 ml di sospensione trasfezione in ciascuno dei quattro piatti 35 millimetri piastrate il giorno prima, che ora contiene globuli a 50-60% di confluenza, le cellule e incubare a 37 ° C per 2 h. </li><li> Aspirare il mezzo off trasfezione, lavare con PBS e sostituire con 2 ml di terreno di coltura addizionato con 2 mM MgCl 2 per prevenire recettore NMDA mediata eccitotossicità 9. Nota: Le celle possono essere utilizzati per le registrazioni elettrofisiologiche 24-48 ore dopo la trasfezione. </li></ol> 2. Elettrodo Preparazione <ol><li> Generare due pipette di registrazione simmetriche tirando tubi in vetro borosilicato con un estrattore verticale. In base alle dimensioni e geometria della punta risultante, altre pipette formacon una lucidatrice. Nota: Il formato di punta può essere valutata visivamente ed elettricamente. Visivamente, il diametro esterno dovrebbe essere nel range 1,4-5,6 micron. Elettricamente, una punta massima dimensione, quando riempita con una soluzione extracellulare, dovrebbe produrre resistenze nel range 12-24 mW (vedi Figura 2B). </li><li> Utilizzare una soluzione di pipetta, che per esperimenti sulle cellule divisoria rappresenta il mezzo extracellulare che produrrà canale attività massima e ampiezze elevate correnti. Nota: per i recettori NMDA, questo corrisponde ad una soluzione contenente saturazione concentrazioni di agonisti (glutammato e glicina), 1 mM EDTA, che chela inibitori bivalenti cationici e bloccanti, ed ha concentrazioni fisiologiche di sodio (150 mm) come unico ione permeante ( in mM: 1 glutammato, glicina 0,1, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA 1, e 10 HEPBS, tamponata a pH 8,0 con NaOH 1 N). </li></ol> 3. Cell-allegato patch-clamp registrazione <ol><li> Aperto acquisizione dati QUB Softwari (www.qub.buffalo.edu), e selezionare la finestra di acquisizione sotto &#39;layout&#39;. Aprire un nuovo file di dati QUB (QDF) cliccando su &#39;New Data&#39; sotto il menu a tendina intitolato &#39;File&#39; e inserire i seguenti parametri iniziali: frequenza di campionamento, 40 kHz; A scala D /, 3000; canale di uscita, 1; e la dimensione dei dati A / D, 2. Regolare la scala di ampiezza di 0,1 V / pA facendo clic destro sul file di dati, selezionare Proprietà e fare clic sulla scheda &quot;dati&quot;. Nota: Questi parametri possono essere affinate per ogni impostazione utilizzando un modello cellulare in modalità cella-attached. Istruzione supplementare su acquisizione dati con software QUB e le proprietà QDF sono online in www.qub.buffalo.edu. </li><li> Selezionare un piatto 35 millimetri contenente canale ionico cellule esprimenti e sostituire terreno di coltura con 2 ml di PBS contenente calcio e magnesio; montare il piatto sul palco microscopio e concentrarsi sul campo di cellulare utilizzando la microscopia a contrasto di fase per valutare che le cellule sono sani e ben attaccate al piattoin modo monostrato (Figura 1A). Passare alla rivelazione della fluorescenza per verificare che la trasfezione era successo (Figura 1B). Nota: L&#39;intervallo di intensità di fluorescenza può essere utilizzato come misura grezza di espressione della proteina. </li><li> Per la registrazione canale singolo, impostare il guadagno dell&#39;amplificatore di uscita per x10, configurazione patch per β = 1, filtro analogico a 10 kHz, la modalità di tensione-clamp e applicata tensione a +100 mV. Con il comando dell&#39;azienda di tensione in posizione OFF, selezionare il pulsante &#39;prova di tenuta&#39;. </li><li> Sulla base di fluorescenza e la salute delle cellule, scegliere una cella di patch. Verificare in contrasto di fase che la cella è ben attaccato al piatto, ha una grande porzione della superficie cellulare esposta per la permutazione, e altrimenti sembra sano. Nota: Mantenere l&#39;illuminazione a contrasto di fase per evitare di sbiancamento cella durante l&#39;avvicinamento e patch-bloccaggio. </li><li> Riempire una pipetta appena lucidato con appena soluzione sufficiente in modo che rende il contatto con il elettrodoe e agitare delicatamente per rimuovere le bolle d&#39;aria intrappolate nella punta. Fissare la pipetta di registrazione sul headstage amplificatore serrando la vite di tenuta del supporto pipetta e fare in modo che il filo di argento viene immerso nella soluzione pipetta. </li><li> Usando un piccolo (5 cc) siringa di plastica, che è collegato al supporto pipetta dalla tubazione, applicare delicatamente pressione positiva per evitare l&#39;ingresso delle impurità e intasamento della punta durante l&#39;avvicinamento (Figura 2A). </li><li> Utilizzando il micromanipolatore, dirigere la pipetta nel bagno e posizionare direttamente sopra la cella selezionata per la permutazione (Figura 1C), chiudendo il circuito elettrico. Prendere nota dell&#39;oscilloscopio, che dovrebbe indicare una forma d&#39;onda rettangolare corrispondente al segnale di prova di tenuta dell&#39;amplificatore (Figura 2B). Nota: Al momento dell&#39;entrata in vasca, la resistenza pipetta nel range ottimale è 12-24 mW. Per un segnale di prova 5 mV, il r corrente misurataange corrisponde a ~ 20-40 pA. </li><li> Durante il monitoraggio posizione pipetta visivamente attraverso la resistenza microscopio e pipetta elettricamente sull&#39;oscilloscopio, continuare l&#39;avvicinamento in piccoli incrementi finché la pipetta incide delicatamente sulla cella, e il segnale di test diminuisce leggermente a indicare una maggiore resistenza (Figura 2B). </li><li> Per formare un sigillo, prendere la siringa ed applicare una leggera pressione negativa attraverso il tubo laterale tirando lo stantuffo della siringa, che tira la membrana cellulare nella punta della pipetta registrazione e avvia la formazione di un sigillo GΩ resistenza 10. Prendere nota della forma d&#39;onda del segnale di prova sull&#39;oscilloscopio, in cui la formazione sigillo è indicato dal suo appiattimento completo, con solo transienti capacitivi visibili (Figura 2B). Nota: Se il segnale non appiattire completamente o la linea di base diventa rumoroso, questo indica un sigillo debole con sostanziale perdita di corrente intorno alla tenuta. Questo consentirà di evitare resolving uno correnti canale. Se questo è il caso, ritirare la pipetta dalla cella e lontano dal bagno, rimuoverlo dalla fase testa e scartarla. Ripetere il processo con una pipetta appena lucidato fino ad ottenere un sigillo nella gamma adeguata (≥ 1 GΩ). </li><li> L&#39;amplificatore, spegnere l&#39;interruttore di comando esterno da &#39;prova di tenuta&#39; a &#39;off&#39;; attivare il comando di tensione che tiene a positivo (che è stato fissato in precedenza a &#39;off&#39;); e aumentare il guadagno per x100. Osservare l&#39;oscilloscopio per l&#39;attività di canale, che, se presente, verrà visualizzata come deviazioni verso l&#39;alto quadrati dalla linea di base precedentemente piatta (Figura 2C). </li><li> Se l&#39;attività del canale viene visualizzato sul oscilloscopio, acquisire i dati in file digitale aperto in precedenza QUB, premendo il tasto &#39;play&#39; seguito dal tasto &#39;record&#39;. Per interrompere l&#39;acquisizione dei dati, premere il pulsante stop in QUB, e salvare il file QDF ad un facile reperimentoposizione grado sul disco rigido del computer selezionando &#39;Salva dati con nome ...&#39; nel menu a tendina intitolato &#39;File&#39;. </li></ol> 4. Dati pre-elaborazione e idealizzazione Nota: Le informazioni importanti possono essere estratte dalle registrazioni di singolo canale da analisi statistiche che assegna ogni punto dati per una classe di conduttanza appropriata (nel caso più semplice, chiuso o aperto). Questo processo è indicato come idealizzazione dati e una breve descrizione di idealizzazione dati con i mezzi k segmentale (SKM) metodo 11 in QUB è descritta di seguito. <ol><li> Aprire il file di dati in QUB, e visualizzare le tracce attuali nell&#39;interfaccia &#39;Pre&#39; sotto &#39;layout&#39;. Visualizzare il file registrato non filtrato (rimuovere il filtro digitale) deselezionando la casella &#39;Fc.&#39; </li><li> Visivamente la scansione del registro per individuare le irregolarità e artefatti (Figura 4A). Correggere brevi picchi di corrente che occur all&#39;interno della traccia (Figura 4A) selezionando una regione pulita adiacente della stessa classe conduttanza, mettendo in evidenza questa regione, tasto destro del mouse e selezionando &#39;buffer di cancellazione impostata.&#39; Zoom sul picco fino a singoli punti di campionamento sono visibili, selezionare la regione da sostituire e cancellare evidenziando solo questa regione e quindi fare clic destro &#39;cancellazione&#39;. </li><li> Definire la linea di base corrente zero per l&#39;intero record selezionando una porzione iniziale del record in cui la linea di base è stabile, evidenziare, fare clic destro e selezionare &#39;basale set&#39;. Verificare che la linea guida che appare esattamente rappresenta il livello di base (viola in Figura 4B) </li><li> Identificare punti nel record in cui la linea di base dati grezzi si discosta visibilmente dalla linea di fondo set. Correggere questo selezionando una piccola sezione della linea di base nella regione deviando destro del mouse e selezionare il comando &#39;aggiungere un nodo di base&#39;. </li><li> Identificare le regioni di tegli registrazione contenente eccesso di rumore o artefatti che non possono essere facilmente corretti (Figura 4C). Evidenziare la regione da scartare, fare clic destro e selezionare &#39;cancella&#39;. Nota: In questo caso sarà persa informazioni cinetica: il record elaborato sarà più breve ei punti che si verificano dopo il punto di giunzione sembrerà essere continuo con la regione pre-rumore. </li><li> Per idealizzare i record utilizzando l&#39;algoritmo SKM 11, evidenziare una porzione della traccia contenente sia aperto ed eventi chiusi e inserire l&#39;interfaccia &#39;Mod&#39; sotto &#39;Layout&#39;. Nel pannello &quot;modello&quot;, evidenziare una parte pulita del tracciato rappresentativo della linea di base in tutto il file, fare clic con il quadrato nero (stato chiuso) e selezionare &quot;afferrare&quot;. Fare lo stesso per le aperture dei canali, mettendo in evidenza la conduttanza aperto, fare clic destro sul quadrato rosso nel pannello &quot;modello&quot; e selezionare &quot;afferrare&quot;. </li><li> Eseguire la idealizazione per l&#39;intero record selezionando il pulsante &#39;File&#39; sotto &#39;Origine dati.&#39; Fare clic destro sulla scheda &#39;idealizzare&#39; sotto la sezione &#39;Modeling&#39; per verificare che i parametri desiderati per l&#39;analisi siano corrette, quindi fare clic su &#39;Esegui&#39;. Il risultato della idealizzazione, insieme con istogramma ampiezza per l&#39;intero file, viene sovrapposto con i dati per consentire l&#39;ispezione visiva del idealizzazione (Figura 5). Nota: idealizzazione inadeguato può portare alla generazione di &quot;eventi falsi,« in cui QUB rileva aperture dei canali e chiusure che in realtà non si verificano. Entro la risoluzione di registrazione, che è impostato dal filtro analogico dell&#39;amplificatore e la frequenza di campionamento, la risoluzione con cui SKM rileva gli eventi di apertura e chiusura può essere controllata impostando un tempo morto per le analisi. Tempi morti ottimali devono essere selezionati per tentativi ed errori e dipenderà dalla frequenza di campionamento, tuttavia, una buona regola èper selezionare un tempo morto che è 2-3 campioni 12. </li><li> Per verificare che l&#39;idealizzazione rappresenta con precisione i dati grezzi, la scansione manualmente la traccia idealizzato. Dopo l&#39;identificazione di errori nella idealizzazione, evidenziare la traccia sopra il falso evento, fare clic destro e selezionare &#39;Join Idl.&#39; Nota: per ulteriori opzioni e una spiegazione dettagliata dei vari comandi e funzioni in QUB, consultare il QUB Manuale on-line (www.qub.buffalo.edu). </li></ol>

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Gli autori di questo manoscritto dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Nel campo canale ionico, un area di ricerca è dedicata alla comprensione della sequenza di eventi che conduce al canale meccanismo di apertura o gating del canale. Per la maggior parte dei canali, questo processo è complesso e prevede diversi passaggi cinetici che non possono essere dedotti da un segnale multicanale macroscopico. Al contrario, gli esperimenti possono essere progettati in cui osservando la sequenza di eventi aperti / chiusi in record di singolo canale può produrre informazioni più dettagliate su gati...

Comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche si basa quasi esclusivamente su oligomeriche formanti pori proteine ​​di membrana, comunemente indicato come canali. Queste proteine ​​sono molto diverse in segnali di attivazione, meccanismi di gating, e le proprietà di conduttanza. Proteine ​​canale cui pori sono selettivi per ioni sono classificati come canali ionici; la loro attivazione produce correnti ioniche attraverso la membrana, e le risposte possono essere registrati con alta risoluzione in tempo reale utilizzando tecniche elettrofisiologiche. I segnali di attivazione abbracciano una vasta gamma di input chimici e fisici, tra cui gradienti di concentrazione, forze meccaniche ed elettriche, e la temperatura; in tal modo, un ulteriore classificazione canali ionici in ligando recintato, meccanosensibili, tensione recintato, o tipi sensibili al calore. In questo articolo, i protocolli sono descritti per registrare l&#39;attività di un canale da un canale ligando gated, il recettore NMDA, e un canale meccanosensibili, PIEZO1, utilizzando la tecnica del patch-clamp.0; Patch-clamp elettrofisiologia è il primo e più diffuso metodo sperimentale sufficientemente sensibile per consentire l&#39;osservazione di singole molecole 1, 2. In aggiunta a questa sensibilità squisita, ha potenziato notevolmente i preparati biologici suscettibili di registrazione elettrofisiologica e inoltre ha permesso l&#39;osservazione dei canali ionici in membrane intatte. In primo luogo, perché entrambi serraggio tensione e corrente di registrazione sono realizzate con lo stesso elettrodo, può essere utilizzato per registrare segnali attraverso piccole cellule o membrane patch. La tecnica ha rivelato che i canali ionici non sono limitati alle membrane eccitabili dei muscoli della rana, electroplaques anguilla, o assoni giganti di calamaro 3, 4, ma piuttosto che essi rappresentano infissi onnipresenti di meccanismi di segnalazione transmembrana e sono intrinseci a tutti i tipi di membrane cellulari di uni-o organismi multicellulari, e anche alle membrane intracellulari. Importantly, la capacità di registrare le correnti transmembrana semplicemente collegando una pipetta di vetro di una cellula intatta fornito l&#39;opportunità senza precedenti per registrare l&#39;attività di canali ionici nelle loro membrane undisrupted nativi. Così, l&#39;allegata patch-clamp cella, che è descritto in questo protocollo, consente il monitoraggio dell&#39;attività di canali ionici ininterrottamente per decine di minuti o più nel loro ambiente nativo. In normali fluttuazioni termiche, tutte le proteine, tra cui proteine ​​del canale ionico, subiscono cambiamenti strutturali su vasta scala di tempo, con i riarrangiamenti più veloci e più frequenti rappresentato probabilmente dai movimenti della catena laterale e molto più lento, meno frequenti cambiamenti rappresentate dal riposizionamento dell&#39;intero domini o subunità, o in alcuni casi di modificazioni post traduzionali o interazioni proteina-proteina 5, 6. Osservando lunghi periodi di attività generate da una molecola può aiutare a comprendere la funzionedinamica zionali di canali ionici in membrane fisiologiche intatte e fornisce preziose informazioni circa il meccanismo di funzionamento della molecola osservata. In contrasto con la crescente comprensione della diversità dei canali ionici attraverso tipi di cellule e fasi di sviluppo, le conoscenze sulla composizione molecolare dei canali ionici in membrane native è ancora limitata. Tutti i canali ionici sono proteine ​​multimeriche e la maggior parte dei canali ionici nativi assemblare da diversi tipi di subunità che producono proteine ​​di diversità molecolare ampia, che è spesso accompagnata con conduttanza e gating diverse proprietà. Per questo motivo, canali ionici di composizione molecolare definita sono studiati su espressione in sistemi eterologhi. In particolare, cellule HEK293, che sono una linea clonale delle cellule renali embrionali umane immortalizzate 7, ampiamente accettato come il sistema preferito per l&#39;espressione eterologa di canali ionici ricombinanti. Tra l&#39;uomovantaggi y che le elevate cellule HEK293 come il sistema ideale per elettrofisiologia canale ionico sono la facilità e la convenienza di coltura e il mantenimento delle culture stabili di lunga durata, la loro capacità di svolgere post-traslazionale piegatura, l&#39;elaborazione e il traffico di proteine ​​di mammiferi, e in molti casi , il livello basso o addirittura assenza di espressione endogena per il canale di interesse 7, 8. Esprimendo canali ionici ricombinanti e studiare le loro proprietà funzionali in cellule HEK293 continua ad essere un valido approccio per ottenere informazioni sulle proprietà struttura-funzione dei canali ionici e le proprietà specifiche delle isoforme del canale ionico e il loro ruolo nel tessuto nativo. I protocolli descritti in questo articolo possono essere applicati ugualmente bene a canali ionici ricombinanti espressi in cellule HEK293 e canali ionici nativi. In sintesi, la tecnica del patch-clamp, attraverso la sua capacità senza precedenti di risolvere segnales da una molecola rimane, ad oggi, il metodo più diretto per osservare il comportamento delle singole molecole. Nella sua modalità cella-attached, la registrazione patch-clamp consente lunghi periodi di osservazione che, se fatto per una molecola, può fornire indicazioni eccezionale sul funzionamento dei canali ionici. Qui di seguito viene presentato un protocollo per l&#39;ottenimento di registrazioni correnti ad alta risoluzione da cellulari patch allegati contenenti una proteina del canale ionico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:189px;">Chemicals</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">Various</td>
			<td style="width:205px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosillicate Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bright field inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1x51</td>
			<td>Nikon also has similar microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluroescent box</td>
			<td>X-cite</td>
			<td>Series 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Light Guide</td>
			<td>X-cite</td>
			<td>OEX-LG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td colspan="2">Axon Axopatch 200B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table</td>
			<td>TMC</td>
			<td align="right">63561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIDAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>776844-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Microforge MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday Cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td align="right">8133306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Pressure Clamp</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA HSPC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pressue/Vaccuum Pump</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PV-PUMP</td>
			<td>For HSPC-1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-channel cell-attached patch-clamp recording

Proteine ​​canale Ion sono dispositivi universali per la comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche. La firma temporale del flusso di ioni generano dipende dalle proprietà intrinseche di ciascuna proteina canale così come il meccanismo attraverso il quale è generato e controllato e rappresenta un&#39;importante area di ricerca corrente. Informazioni sulle dinamiche operative delle proteine ​​del canale ionico può essere ottenuta osservando lunghi tratti di corrente prodotte da una singola molecola. Qui descritto è un protocollo per ottenere patch-clamp registrazioni di corrente di un canale Cell-attached per una gated canale ionico ligando, il recettore NMDA, espresso eterologamente in cellule HEK293 o nativo in neuroni corticali. Sono fornite anche le istruzioni su come adattare il metodo per gli altri canali ionici di interesse presentando l&#39;esempio del canale PIEZO1 meccano-sensibili. Questo metodo può fornire dati riguardanti le proprietà conduttanza del canale e la sequenza temporale di opeconformazioni n chiusi che compongono il meccanismo di attivazione del canale, contribuendo così a capire le loro funzioni in materia di salute e di malattia.

Ricombinante NMDA recettori Recettori NMDA legano e rispondere all&#39;azione concomitante di due co-agonisti: glutammato e glicina. Si assemblano come heterotetramers di due glicina vincolanti subunità GluN1 e vincolante subunità GluN2 due glutammato. Subunità GluN2 sono codificate da quattro geni (AD) e di questi le forme più ampiamente trascritti nel cervello sono GluN2A in adulti e GluN2B negli animali giovani. A causa della diversità dei sottotipi del recettore NMD...

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One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

one-channel-cell-attached-patch-clamp-recording

Research

JoVE Journal

Biology

24.2K Views.  University at Buffalo, SUNY.  Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate. 

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Ricerca

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Ambulatory ECG Recording in Mice

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although the surface ECG is utilized for short-term measurements of waveform intervals, it is not practical for long-term studies of heart rate variability or the capture of rare episodes of arrhythmias. Implantable ECG telemeters offer the advantages of simple surgical implantation, long-term recording of electrograms in ambulatory mice, and scalability with simultaneous recordings of multiple animals. Here, we present a step-by-step guide to the implantation of telemeters for ambulatory ECG recording in mice. Careful adherence to aseptic technique is required for favorable survival results with the possibility of implantation and recording from weeks to months. Thus, implantable ECG telemetry is a valuable tool for detection of critical information on cardiac electrophysiology in ambulatory animal models such as the mouse. 

Telemetric ECG has emerged as an essential tool in evaluating animal models for cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Here, we present a stepwise guide to telemetric ECG recordings for application in long-term ambulatory ECG monitoring in mice.

La registrazione ECG ambulatoriale nei topi

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...