Ringraziamo J. Garcia-Celma, io Smirnova e R. Kaback per i contributi per le misure Lacy e E. Bamberg per il supporto e discussioni utili.

1. Impostazione di un apparato per SSM-based Elettrofisiologia I dettagli sono forniti in due delle nostre pubblicazioni tecniche, che contengono anche disegni schematici e le fotografie dei nostri cuvette e impostare 1, 2. Diverse configurazioni di scambio di soluzioni e protocolli di flusso sono discussi anche nel nostro documento metodo 2. Nel seguito si aggiungono alcuni miglioramenti recenti e dettagli tecnici che sono di diretta rilevanza per il video di presentazione. Controllo della valvola e l&#39;acquisizione dei dati La scatola contiene una interfaccia di uscita / interfaccia USB commerciale digitale di ingresso analogico (NI 6009 NI USB) e dei driver delle valvole. Esso controlla il flusso della soluzione ed è responsabile per l&#39;acquisizione dati. Le valvole sono normalmente guidati con 12 V. Tuttavia, per una rapida commutazione delle valvole possono essere guidati con una tensione massima di 18 V. Nel video si usa un alimentatore a 12 V. &lt;/ P&gt; Il circuito driver di valvola può operare quattro valvole. E &#39;stato prodotto dalla bottega del Max Planck Institute di Biofisica. Le valvole possono essere controllati da computer o manualmente tramite switch sul pannello frontale. Quest&#39;ultimo è utile per la pulizia-procedure-e vampate di calore. Durante la misura, la scatola di interfaccia è controllato dal computer utilizzando una valvola di controllo e software di acquisizione dati (Surfe 2 software R, IonGate Biosciences). 2. Preparativi In questa sezione sono indicati i diversi protocolli per la preparazione di un esperimento di elettrofisiologia SSM-based. 2.1 Rendere la soluzione di lipidi per la formazione del SSM <ol><li> Miscelare 25 pl octadecilammina (5 mg / ml di cloroformio) e 375 Diphytanoylphosphatidylcholine microlitri (20 mg / ml di cloroformio) in una fiala glas. </li><li> Utilizzando un evaporatore rotante e il flusso continuo di gas azoto, si evapora il cloroformio percirca 30 min. </li><li> Rimuovere il lipide dalle pareti della fiala di vetro agitando con 500 ml di n-decano. La concentrazione di lipidi finale è di 15 mg / ml con 1:60 (w / w) octadecilammina. </li><li> Trasferire la soluzione nella fiala di vetro di stoccaggio. Conservare la soluzione lipidica a -20 ° C. </li></ol> 2.2 clorazione dell&#39;elettrodo di riferimento Gli elettrodi di riferimento devono essere clorurato ad intervalli regolari per abrasione. <ol><li> Togliere il resto del vecchio strato silverchloride utilizzando carta abrasiva fine prima che il processo di clorazione. </li><li> Posizionare il filo d&#39;argento con un elettrodo di platino in una soluzione M di acido cloridrico 1 e cloro per 15 min a 0,5 mA. Dopo aver completato clorazione, il filo di argento cambia colore ad un grigio scuro omogeneo. </li></ol> 2.3 Preparazione del ponte gel di poliacrilammide <ol><li> Preparare una soluzione contenente 100 mM KPI a pH = 7, 100 mM KCl e 6% Acrilammide. </li><li> Aggiungere 0,3% APS (10% Archivio) e 0,6% TEMED e poco miscelare la soluzione con una pipetta. </li><li> Immediatamente dopo la miscelazione della soluzione, utilizzare una pipetta per iniettare 30 microlitri della miscela nel contenitore vuoto ponte gel. È importante evitare bolle d&#39;aria durante l&#39;iniezione. </li><li> Durante un tempo di incubazione di 20 min gel polimerizza. </li><li> Dopo la polimerizzazione il ponte gel è memorizzato in soluzione (100 mM pH 7 KPI, 100 mM KCl). Per prolungare la durata di vita del ponte gel la soluzione viene conservata a 4 ° C. </li></ol> 2.4 Preparazione delle soluzioni di misura A causa della forte interazione dei soluti con il SSM, artefatti elettrici sono generati quando le soluzioni di diversa composizione vengono scambiati. Pertanto, la preparazione delle soluzioni è un passaggio fondamentale. Adottare le seguenti precauzioni durante il processo di preparazione della soluzione per ridurre al minimo gli artefatti di scambio di soluzione. <ol><li> Make non attivando e attivando soluzioni da un lotto, regolare il pH e forza ionica. </li><li> Sfondo di sale aiuta a ridurre i tassi di artefatti soluzione. </li><li> Dividere la soluzione lotto in due volumi. </li><li> Aggiungere il composto attivante alla soluzione attivante. Usare un preparato compensativo nella soluzione non-attivante per mantenere l&#39;osmolarità e forza ionica di entrambe le soluzioni il più possibile simili. </li><li> Se le soluzioni sono conservati a 4 ° C, assicurarsi che tutte le soluzioni hanno raggiunto la temperatura ambiente prima di iniziare una misurazione, perché anche piccole differenze di temperatura possono produrre artefatti. </li></ol> 3. Un esperimento Elettrofisiologia SSM-based Qui vi presentiamo un protocollo tipico per un esperimento elettrofisiologico SSM-based. 3.1 Preparazione del Setup SSM Mentre l&#39;installazione SSM non è in uso, i tubi sono riempiti con un etanolo al 30%Soluzione / acqua per evitare la crescita batterica. <ol><li> Lavare il sistema con acqua pura per eliminare l&#39;etanolo dal tubo prima di montare la cuvetta. Sostituire i contenitori etanolo con contenitori per l&#39;acqua. Utilizzando ad alta pressione (da 0,6 a 1,0 bar) pulire il sistema con 20-30 ml di acqua. </li><li> Ripetere la procedura di pulizia utilizzando un buffer di 100 mM KPI a pH 7.6 o soluzione non attivante. </li><li> Assicurarsi che non rimangano bolle d&#39;aria nel sistema fluido. </li></ol> 3.2 Montaggio della cuvetta <ol><li> Fissare un o-ring per l&#39;elettrodo di riferimento </li><li> Prendete il ponte di gel dalla soluzione di storage e collegare l&#39;elettrodo di riferimento. </li><li> Prefill il raccordo di uscita con tampone non-attivante, inserire un o-ring e collegare il ponte gel per completare il gruppo elettrodo di riferimento. Faccia particolare attenzione che non vi siano bolle d&#39;aria al bivio del ponte di gel e la presa di soluzione flusso percorso. </li><li> Preassemblare la parte principale della cuvette aggiungendo il perno di contatto a molla (collegamento all&#39;amplificatore), il tubo di ingresso (collegamento alla valvola terminale), l&#39;anello di tenuta (tenuta per la SSM) e le viti. </li><li> Utilizzando una pinzetta, prendere il chip del sensore dalla soluzione di memorizzazione (10 mM OCTADECANETIOLO in etanolo). </li><li> Usando una pipetta, lavare la soluzione rimanente con ca. 5 ml di etanolo puro. </li><li> Asciugare l&#39;elettrodo sotto azoto. </li><li> Posizionare il chip del sensore con precisione sulla parte di base della cuvetta in modo che il foro di ingresso della parte principale della cuvetta è diretto verso l&#39;area attiva del sensore circolare. </li><li> Aggiungere 1 ml della soluzione lipidica all&#39;area attiva del chip sensore. Accertarsi che lo strato di oro è interamente coperto dalla lipidico. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;aggiunta della soluzione lipidica, chiudere la cuvetta aggiungendo la parte principale preassemblato. </li><li> Prima di montare la cuvetta nella gabbia di Faraday, assicurarsi che tutte le superfici siano completamente asciutti. </li><li> Connect dell&#39;amplificatore al pin di contatto a molla e il tubo di ingresso alla valvola terminale. Quindi fissare la provetta con le viti all&#39;interno della gabbia di Faraday. </li><li> Avvitare il raccordo di uscita all&#39;inizio della cuvetta. Infine collegare il tubo di uscita per il raccordo di uscita ed il generatore di tensione all&#39;elettrodo di riferimento. </li><li> Immediatamente dopo il montaggio della cuvetta lavare il sistema con tampone a 0,6 bar. Ciò porta alla formazione spontanea SSM. </li></ol> 3.3 Parametri di membrana di misura Per verificare la qualità della SSM, capacità e conduttanza sono misurate utilizzando il generatore di funzioni. <ol><li> Utilizzando il generatore di funzioni, applicare 100 mV tensione in CC per misurare la conduttanza. </li><li> Calcolare la conduttanza: Il decadimento attuale dimostra la carica del condensatore membrana. Dopo il condensatore è completamente carica i rendimenti attuali misurati la conduttanza della membrana utilizzando la legge di Ohm. Per ragioni di semplicità usiamo la current 1 sec dopo che la tensione è applicata per calcolare la conduttanza G = I / U. </li><li> Applicare una tensione alternata triangolare di 50 mV picco a picco ampiezza e la frequenza di 0,5 Hz per misurare la capacitanza. </li><li> Calcolare la capacità: L&#39;ampiezza della corrente risultante onda quadra rappresenta le correnti di carica del condensatore. La capacità C è uguale alla carica trasferita Q = IΔt diviso ΔU = 100 mV. (ΔU è due volte la tensione applicata di 50 mV perché I è la corrente differenza di pendenza positiva minus negativo della tensione triangolare.) </li><li> Monitorare i parametri elettrici della membrana ripetutamente ogni 10 min per ca. 30 e 40 minuti, fino a raggiungere valori costanti. Lavare con tampone tra Kpi ad alta pressione nell&#39;intervallo da circa 0,6 a 1 bar. </li><li> Stimare la qualità del SSM: Parametri ottimali sono nell&#39;intervallo da 0,1 a 0,2 ns e 2-3,5 nF. Un alto conduttanza sopra 0,8 nS e bassa capacità al di sotto di 1 nF indicache la SSM non si forma correttamente. Un alto capacitanza 4 nF sopra può comportare che la zona attiva non è coperto completamente dal SSM. </li><li> Se i parametri non sono nel range ottimale, la membrana deve essere scartata ed un&#39;altra SSM preparato, utilizzando un chip appena preparato elettrodo. </li></ol> 3.4 Controllo di scambio artefatti soluzione Dopo che i parametri di membrana sono stati controllati, i buffer di misura dovrebbero essere testati per i tassi di artefatti soluzione. <ol><li> Inserire i rispettivi contenitori soluzione del sistema fluido. </li><li> Rimuovere le bolle d&#39;aria dal sistema fluido, utilizzando le valvole manuali. </li><li> Utilizzando il software di acquisizione dati ha scelto il protocollo di flusso che si desidera utilizzare nel vostro esperimento. </li><li> Regolare la pressione a 0,6 bar e avviare la misurazione. </li><li> A parte gli artefatti di commutazione delle valvole meccaniche, idealmente non correnti artefatti dovrebbero essere misurati o dovrebbero essere molto smaller che i segnali della proteina di trasporto previsti. Se si osservano tassi di artefatti soluzione, cercare di ottimizzare le composizioni di buffer e / o la procedura di preparazione prima di continuare l&#39;esperimento. </li></ol> 3.5 Aggiunta del campione di proteine Di solito proteoliposomi o frammenti di membrana sono conservati congelati a -80 ° C. Per una misurazione è necessaria una aliquota di circa 30 microlitri. <ol><li> Sciacquare la SSM con soluzione non attivante. </li><li> Scongelare il campione di proteine ​​in ghiaccio. </li><li> Tre cicli di sonicazione di 10 secondi si alternano a intervalli di 10 secondi di raffreddamento sul ghiaccio. Proteoliposomi sono sonicati utilizzando un bagno di sonicazione. Per i frammenti di membrana è usato un sonicatore punta (50W, 30 kHz, 1 mm di diametro sonotrode, intensità 20%, ciclo di 0,5). Dopo l&#39;ultimo passo sonicazione non mettere il campione torna sul ghiaccio, ma iniettare immediatamente nella cuvetta. </li><li> Svitare il connettore della presa insieme al elettrodo di riferimento asseMBLY. </li><li> Usando una pipetta, aspirare 30 ml del campione di proteine ​​e montare la punta della pipetta alla presa di annoiarvi. </li><li> Aprire la valvola manuale nella via non-attivante al contenitore dei rifiuti e iniettare i liposomi nel volume della cuvetta. Fare attenzione a non iniettare aria nel volume della cuvetta con il sensore. </li><li> Prima di rimuovere la punta della pipetta, chiudere la valvola manuale per evitare l&#39;ulteriore flusso di soluzione. </li><li> Lasciare le proteoliposomi di adsorbimento al SSM per un tempo di incubazione di 1-2 ore. È anche possibile incubare durante la notte. </li></ol> 3.6 Procedura generale di un esperimento SSM-based <ol><li> Scaldare i buffer di misura nel tempo, se conservato a 4 ° C. Tutti i tamponi di misura devono essere a temperatura ambiente prima di iniziare la misurazione per evitare artefatti. </li><li> Quando si cambiano le soluzioni, prima pulire i tubi all&#39;interno dei contenitori di soluzione con un tessuto non-fuzzing, quindi inserire le nuove bottiglie. </li><li> Prima di avviare la misurazione, utilizzare le valvole manuali per rimuovere le bolle d&#39;aria, che potrebbero sono evoluti dalla procedura di modifica. </li><li> Regolare la pressione poco prima di iniziare una misurazione. Noi abitualmente uso una pressione di 0,6 bar, che a nostra valvola e tubo specifica configurazione produce una velocità di flusso di 1,0 ml / sec. </li><li> Le prime misurazioni possono essere effettuate direttamente uno dopo l&#39;altro e dovrebbero essere rifiutati fino alla corrente di picco rimane costante. Se le soluzioni differiscono pH un tempo di incubazione per almeno 3 minuti è necessario per regolare il pH interno delle proteoliposomi prima della misurazione. </li><li> Ora il set up è pronto per la misura. Per ridurre il rumore di almeno 3 misurazioni devono essere effettuate e media. </li></ol> 3.7 Misure di controllo Una carrellata segnale durante una serie di misurazioni potrebbe verificarsi a causa di degradazione della proteina o una perdita di adsorbimento. Ogni esperimento deve SSM iNCLUDE un controllo fatiscente. Questo è fatto da misurazioni ripetute con soluzioni identiche. Il controllo avvitatura minima significa una misurazione all&#39;inizio e uno alla fine dell&#39;esperimento, utilizzando la stessa soluzione. Si consiglia di fare il controllo della riduzione di attività in condizioni in cui ci si aspetta la massima ampiezza di picco nell&#39;esperimento. Questo rende più facile quantificare la riduzione di attività del segnale. La carrellata di segnale può essere quantificata da un confronto tra le ampiezze di picco dei due controlli fatiscenti. Il valore percentuale risultante può essere utilizzato per correggere i segnali misurati ipotizzando un tempo di dipendenza lineare della avvitatura. 3.8 Controlli Artefatto Se possibile, cercare di convalidare i risultati per inibire la proteina di interesse dopo l&#39;esperimento. Segnali rimanenti sono probabilmente tassi artefatti soluzione. I segnali devono poi essere corretti per i manufatti misurati. <ol><li> Lavare il sistema con 20-30 ml di acqua pura e 20-30 ml di 30% di etanolo / acqua. La soluzione etanolica evita la crescita batterica quando il sistema non è in uso. </li><li> Dopo questa procedura di pulizia, togliere la pressione dal sistema e spegnere tutti gli strumenti. </li><li> Rimuovere la cuvetta dalla gabbia di Faraday e toglierla. Tutte le parti della cuvetta possono essere pulite con acqua ed etanolo puro, se necessario, utilizzando un bagno sonicatore. </li><li> Posizionare il chip del sensore in un bicchiere di vetro con etanolo puro. Sonicazione il becher per circa 1 a 2 minuti usando un bagno sonicatore. </li><li> Asciugare il chip del sensore sotto azoto. </li><li> Memorizzare il chip sensore lontano dalla luce in una soluzione etanolica Octadecanthiol 10 mM. Dopo un tempo di incubazione di circa 30 min chip del sensore è pronto per il riutilizzo. </li></ol>

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

1. Vantaggi di elettrofisiologia SSM-based rispetto ai metodi convenzionali Elettrofisiologia SSM-based si è dimostrata un valido strumento della casella degli strumenti elettrofisiologico. E &#39;particolarmente utile nei casi in cui convenzione elettrofisiologia, e cioè patch clamp e metodi clamp di tensione, non può essere applicato: A parte qualche rara eccezione trasportatori batterici non possono essere studiati usando morsetto di tensione o di metodi di patch clamp a causa delle piccole dimensioni dei batteri e perché sono difficili da esprimere in cellule di mammifero o ovociti. Ma anche fisiologicamente rilevanti trasportatori di mammifero possono essere esaminati. In questo caso elettrofisiologia SSM-based è attraente per i trasportatori di membrane intracellulari e per applicazioni di screening nella scoperta della droga per la sua robustezza e la sua potenzialità per l&#39;automazione. SSM-basedUsing convenzionale elettrofisiologia, ora risolto caratterizzazione di trasporters è impegnativo. Dal momento che il fatturato dei trasportatori è basso un &#39;cerotto gigante&#39; o è necessaria la configurazione di un &#39;intera cellula&#39;, che hanno una risoluzione di intrinsecamente bassa volta in un esperimento di scambio soluzione. La complicazione può essere superato utilizzando rilascio substrato fotolitico. Tuttavia, solo un numero limitato di substrati sono adatti per questo approccio. Qui il tasso di rapida soluzione al SSM offre l&#39;opportunità unica di effettuare studi elettrofisiologici con una risoluzione temporale elevata utilizzando substrati arbitrari. 2. Limitazioni e passaggi critici In contrasto patch clamp e tecniche di voltage clamp, elettrofisiologia SSM-based non può essere usato per applicare un potenziale. Caratterizzazione Transporter è pertanto limitata ai modi, che non si basano su un potenziale di membrana trasportare. In generale, elettrofisiologia SSM-based ha limitazioni sul tipo di trasportatore (elettrogenica). Ma cl tensioneamp o di patch clamp metodi possono avere vantaggi, se sono necessari componenti intracellulari come proteine ​​leganti per la funzionalità delle proteine. Limitazioni possono sorgere, se scambio soluzione crea grandi correnti artefatto. Ciò accade quando il substrato interagisce fortemente con la SSM come nel caso di composti lipofili. Controlli artefatto possono essere utilizzati per correggere i segnali misurati. Inoltre elevato background sale in tutti i buffer di misura può essere usato per ridurre gli artefatti. Ma nei casi in cui le dimensioni del manufatto è paragonabile al segnale proteina, è quasi impossibile isolare il segnale correlato proteina dal manufatto. Fortunatamente, alta artefatti sono insoliti in uno scambio soluzione ottimizzata. Ci sono alcuni passaggi che sono fondamentali per la riuscita realizzazione di un esperimento di elettrofisiologia SSM-based. La preparazione del campione di proteine ​​è la parte più importante. Se si utilizzano proteoliposomi, accertarsi che i reconsprocesso prostituzione produce un ambiente pulito, campione riproducibile di una sufficiente LPR e il trasportatore è orientata in modo corretto. La LPR può essere controllata freeze frattura microscopia elettronica e di orientamento da un esperimento ELISA se gli anticorpi sono disponibili. Utilizzare solo un SSM che mostra i parametri ottimali per l&#39;incubazione del campione proteico. L&#39;iniezione della proteina è un altro aspetto critico. Sonicazione è essenziale e bolle d&#39;aria deve essere evitato durante l&#39;iniezione. Dopo incubazione le misurazioni campione stesso sono critiche, poiché le bolle d&#39;aria si rimuovere il campione proteina adsorbita dal chip sensore. Quindi togliere sempre le bolle d&#39;aria dopo aver cambiato le soluzioni. Tuttavia una carrellata segnale può verificarsi. Per correggere un eventuale segnale carrellata, è essenziale per realizzare controlli degradate durante l&#39;esperimento. 3. Sistemi specializzati L&#39;SSM-Setup può essere modificato in base alla sua applicazione. Inoltre tqui sono completamente diverse, configurazioni altamente specializzati disponibili. C&#39;è la possibilità di misurare segnali proteici in condizioni asimmetriche, ad esempio sotto un gradiente di pH. Per stabilire composizioni tampone asimmetriche dentro e fuori le proteoliposomi una terza soluzione, la soluzione di riposo, deve essere introdotto e questo richiede una configurazione a doppio scambio. Qui è necessaria una valvola supplementare a tre vie di commutazione tra le soluzioni non-attivazione e di riposo. Per aumentare la risoluzione temporale del sistema abbiamo sviluppato un percorso di flusso alternativo privo della valvola terminale, ma utilizzando un diverso tipo di cuvetta. Qui la giunzione di attivazione e soluzione non attivante si trova all&#39;interno della cuvetta, 3 mm davanti al SSM. Questa configurazione è particolarmente adatta per l&#39;analisi cinetica dei processi di trasporto veloci. Si è potuto dimostrare che una risoluzione di tempo a partire da 2 msec è possibile. F Commercialeully sistemi automatizzati sono disponibili puntando ad una velocità significativamente più alto per lo screening farmacologico. Unità mobile soluzioni raccoglie e li inserisce sulla superficie del sensore in piastre da 96 pozzetti in un formato standard micropiastra.

Qui mostriamo un nuovo approccio elettrofisiologico basato su una solida membrana sostenuta (SSM) per la caratterizzazione di proteine ​​di membrana elettrogeniche. Il supporto solido costituito da un sottile strato d&#39;oro su un vetrino, il chip del sensore. La superficie d&#39;oro idrofilo viene utilizzato per legare il gruppo tiolico di un reagente alcanethiol. Successivamente, selfassembly di un monolyer fosfatidilcolina completa la formazione della SSM. Per misurare le reazioni elettrogeniche di proteine ​​di membrana, proteoliposomi o frammenti di membrana sono adsorbite alla SSM (Figura 1). La proteina contenente membrana e la SSM poi formare un sistema a membrana capacitivamente accoppiato. Pertanto, traslocazione carica al membrana contenente proteina può essere rilevata mediante accoppiamento capacitivo attraverso il SSM. Questo metodo produce solo correnti transitorie. La corrente di picco rappresenta l&#39;attività di trasporto stazionaria. Il tempo dipende trasportatore currents possono essere ricostruite attraverso l&#39;analisi del circuito. Il chip sensore è montato in un sistema cuvetta (Figura 2). La vaschetta ha un volume della cuvetta cilindrica di 17 ml (volume netto con o-ring montato). Un pin di contatto a molla crea il contatto con l&#39;amplificatore. Un connettore di uscita è avvitato alla parte superiore della parte principale e porta l&#39;elettrodo di riferimento, un filo d&#39;argento clorurato. La cuvetta è montato in una gabbia di Faraday. Esso è collegato ad un percorso di fluido, che viene utilizzato per indurre l&#39;attività di trasporto della proteina di membrana in risposta ad uno scambio veloce soluzione (figura 3). Nel singolo soluzione Exchange Protocol due soluzioni, una non-attivazione e una soluzione di attivazione, sono obbligatori. Il flusso è controllato da aria in pressione mediante un software di controllo valvola su un computer o interruttori manuali su una scatola di interfaccia.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath Sonicator</td>
 <td>Bandelin</td>
 <td>RK 52 H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tip Sonicator</td>
 <td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td>
 <td>UP50H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-way valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Terminal valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manometer</td>
 <td>Greisinger electronics</td>
 <td>GDH 14 AN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvette</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml solution containers</td>
 <td>Kartell</td>
 <td>1623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O-rings</td>
 <td>Seal Science Inc.</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oscilloscope</td>
 <td>Tektronix</td>
 <td>TDS 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reference electrode</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Function generator</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubings</td>
 <td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td>
 <td>AAC00006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor chip</td>
 <td>Fraunhofer Institut f&uuml;r Schicht und Oberfl&auml;chentechnik</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Interface box</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Keithley</td>
 <td>427</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual cog</td>
 <td>Vygon GmbH</td>
 <td>876</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>USB analog-to-digital converter</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr> 
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Regeants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2&#x2011;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>850356</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3574</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3678 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-(+)-Glucose </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>G8270 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>43819</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol absolut</td>
 <td>VWR AnalaR NORMAPUR</td>
 <td>603-002-00-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Natural E. coli lipids polar extract</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>100600</td>
 <td>for LacY reconstitution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Decane</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D901 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecanethiol</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>O1858 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecylamine</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>74750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P3786 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P9791 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetramethylethylenediamine</td>
 <td>BIO RAD</td>
 <td>1610801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;-Lactose monohydrate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L8783 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

Il metodo elettrofisiologico che presentiamo si basa su una membrana solida supportato (SSM) costituito da uno strato OCTADECANETIOLO chemisorbita rivestito su un chip del sensore oro e un monostrato fosfatidilcolina in cima. Questo gruppo è montato in un sistema cuvetta contenente l&#39;elettrodo di riferimento, un filo d&#39;argento clorurato. Dopo adsorbimento di frammenti o proteoliposomi contenenti la proteina di membrana di interesse membrana, uno scambio veloce soluzione è usato per indurre l&#39;attività di trasporto della proteina di membrana. Nel singolo soluzione Exchange Protocol due soluzioni, una non-attivazione e una soluzione di attivazione, sono necessari. Il flusso è controllato da aria pressurizzata e un sistema di valvole e tubazioni all&#39;interno di una gabbia di Faraday. La cinetica dell&#39;attività di trasporto elettrogenica è ottenuta mediante accoppiamento capacitivo tra la SSM ei proteoliposomi o frammenti di membrana. Il metodo, quindi, produce solo transient correnti. La corrente di picco rappresenta l&#39;attività di trasporto stazionaria. I tempi correnti trasportatori dipendenti possono essere ricostruite attraverso l&#39;analisi del circuito. Questo metodo è particolarmente adatto per trasportatori procariote o trasportatori eucariotiche da membrane intracellulari, che non possono essere studiati da patch clamp o metodi clamp di tensione.

Fino ad ora, SSM basata elettrofisiologia stato usato per caratterizzare più di 20 trasportatori, principalmente di origine procariotica, es melb 3, 4 e Nhaa PutP 5 (riassunti in 6). Ma anche i trasportatori eucariotiche da membrane intracellulari, come ad esempio ClC7 7 così come i canali ionici, ad esempio il recettore nicotinico 8 sono stati indagati. Qui vi presentiamo come esempio misurazioni dello zucchero / H + cotrasportatore Lacy da Escherichia coli utilizzando proteoliposomi con almeno il 85% sul dritto orientata Lacy in un LPR 5 9, 10. Ci concentriamo sulle principali fasi che portano ad un modello minimo cinetica di questa proteina di trasporto. 1. Caratterizzazione elettrofisiologica di tipo selvatico Lacy Il primo passo è la caratterizzazione generale della reazione elettrogenica misurando diversi valori di pH ( <strong<html> &gt; Figura 4), ​​concentrazioni di substrato (Figura 5) e substrati. Per convalidare la tecnica, K valori del pK M e dato in letteratura sono stati riprodotti. Il pH dipendenza di Lacy mostra due differenti reazioni elettrogeniche. Gli aumenti di corrente capacitiva accoppiata tra pH 5 e pH 8.5, ma anche cambia la sua forma. In ambiente alcalino si osserva trasporto stato stazionario, mentre per valori di pH acido solo una reazione elettrogenico rapida rimane. Per distinguere i segnali di stato stazionario dalle rapide reazioni elettrogeniche abbiamo usato l&#39;analisi del circuito di ricostruire le correnti trasportatore (Figura 6). A pH 7 il segnale diventa monofasico bifasica. Questo indica anche che ci sono due differenti reazioni elettrogeniche. Stimata dalla carica trasferita (integrale dei segnali), le due reazioni sono circa il 6% e il 94% del electrogenicity totale del ciclo di trasporto. ove_step &quot;&gt; 2. Assegnazione delle reazioni elettrogeniche Per assegnare le due reazioni elettrogeniche a particolari fasi del ciclo di reazione di Lacy, la variante Lacy E325A è stata misurata (Figura 7). Questa variante mostra solo scambio lattosio ma è carente per tutti i modi di trasporto attive, a causa della inibizione del rilascio di protoni. Il segnale di E325A Lacy rappresenta un transitorio veloce ed è costante per tutti i valori di pH misurati. La forma e ampiezza del segnale è simile al segnale di tipo selvatico Lacy in condizioni acide. Inoltre si osserva una piccola fase negativa dopo il picco di corrente diminuisce, che è caratteristico per correnti transitorie rapide misurate in sistemi accoppiati capacitivamente. Perché lattosio vincolante e rilascio non è elettrogenico, il transitorio veloce deve correlarsi con una transizione conformazionale elettrogenico seguendo lattosio vincolante. È noto che la fase di rilascio protone è tasso Limiting per fatturato Lacy nella modalità di trasporto guidato lattosio gradiente di concentrazione. In questo caso ci aspettiamo un aumento del tasso di trasporto con pH alcalino, in quanto il rilascio di protoni è favorita. Questo è il caso per il trasporto stato stazionario del segnale di tipo selvatico Lacy correlato. Inoltre si potrebbe dimostrare mediante misurazione gradiente di pH che solo il pH interno influenza il trasporto costante stato di Lacy (non pubblicato). Pertanto la reazione di grandi dimensioni elettrogenica potrebbe essere assegnato alla fase di rilascio protone. 3. Misure per l&#39;analisi cinetica Dopo l&#39;identificazione delle reazioni elettrogeniche e fuori prezzi di trasporto, sono stati determinati utilizzando un programma di installazione SSM con una risoluzione elevata di tempo di circa 4.5 msec. Questo è possibile solo in condizioni, quando una reazione domina il segnale. In questo caso le costanti di velocità possono essere derivate dalle correnti transitorie in esame della risoluzione temporale dei segnali utilizzando un iterativo ai minimi quadrati de<html> algoritmo di convoluzione (Figura 8). Le costanti di velocità determinate così come il modello cinetico minima proposta (Figura 9), infine, sono stati utilizzati per la simulazione della cinetica trasportatore. Le curve simulate riproducono i dati SSM che dimostra ulteriormente il modello cinetico. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> Figura 1. Adsorbimento geometria proteoliposomi sul SSM. L&#39;SSM si forma su un chip sensore, un oro rivestito vetrino strutturato. Per misurare le reazioni elettrogeniche di proteine ​​di membrana, proteoliposomi o frammenti di membrana sono adsorbite alla SSM. Le due membrane formano un sistema accoppiato capacitivamente. Questo è il motivo per cui vengono rilevate solo le correnti transitorie. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. L&#39;SSM cuvetta porta il chip del sensore e l&#39;elettrodo di riferimento. Il chip sensore è inserito tra la base e la testa cuvetta cuvetta. L&#39;elettrodo di riferimento è isolato dal percorso di flusso da un gel di poliacrilammide ponte salino. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> Figura 3. Pathway fluido e circuito elettrico della Setup SSM. Nel protocollo singolo scambio soluzione sono necessari solo un non-attivante (NA) e una attivazione (A) soluzione. Il flusso è controllata da due valvole a due vie (V1) e una valvola terminale (V2). La valvola commuta tra terminali soluzioni non attivanti ed attivando, dirigendo una delle soluzioni alla cuvetta e l&#39;altra soluzione per un contenitore di rifiuti (W). Il chip sensore (SSM) è collegato all&#39;amplificatore (I / U),<html> mentre l&#39;elettrodo di riferimento (AgCl) è collegato al generatore di funzioni (F) nel circuito elettrico esterno. Un computer (PC) e una scatola di interfaccia sono utilizzati per il funzionamento della valvola e acquisizione dati. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> Figura 4. Correnti transitorie misurate con wild-type proteoliposomi Lacy dopo 100 mm lattosio salti di concentramento di diversi valori di pH. La soluzione non-attivante contenevano 100 mM di glucosio, mentre la soluzione attivante conteneva 100 mM lattosio. Tutte le soluzioni sono state preparate in 100 mM tampone fosfato di potassio a pH indicato con 1 mM DTT. Per i dettagli delle condizioni di misura in questa e le seguenti figure si rimanda a 9 e 10. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Medi correnti di picco normalizzato misurati con wild-type proteoliposomi Lacy dopo salta concentramento lattosio a diverse concentrazioni e dei valori di pH. I valori di K M sono stati ottenuti dai fits iperboliche. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> Figura 6. Ricostruzione delle correnti trasportatore. Le correnti transitorie (A) per ricostruire le correnti trasportatore (B) sono stati misurati con la wild-type proteoliposomi Lacy dopo 100 mm lattosio salti di concentramento a pH 8.5 (traccia blu) e pH 5.2 (traccia rossa). A pH 8,5 continuo turnover si osserva mentre a pH 5.2 si verifica una reazione elettrogenico veloce. Questo è chiaramente osservato nel corrente ricostruita (B). files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;alt =&quot; Figura 7 &quot;fo: contenuti-width =&quot; 4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Transitorio di corrente misurata con E325A proteoliposomi Lacy dopo un salto di 100 mM lattosio concentrazione a pH 5.2. Questa variante Lacy è inibita in fase di rilascio di protoni del ciclo di trasporto e quindi il trasporto-carenti. La piccola componente negativa osservata è caratteristica per correnti transitorie rapide misurate in modo capacitivo sistemi accoppiati ed è causato dalla scarica della capacità di membrana dopo una reazione elettrogenico veloce. Sua costante π0 tempo è determinata dalle capacità e delle conduttanze del sistema (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="Figura 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> Figura 8. Correnti transitorie misurate con wild-type proteoliposomi Lacy after diversi salti di concentrazione di lattosio a pH 5.2. In queste condizioni nessun trasporto stato stazionario si osserva, ma una transizione conformazionale elettrogenico su lattosio vincolante. La linea tratteggiata mostra la funzione di trasferimento che rappresenta la risoluzione temporale del sistema. L&#39;inserto mostra la determinazione del tasso di on e off costanti dal tasso osservati costanti kobs con una misura iperbolica ai dati. La costante di velocità osservata è stata determinata dalle correnti transitorie con un algoritmo di deconvoluzione iterativi minimi quadrati 10. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="Figura 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> Figura 9. Un modello cinetico per il ciclo di reazione di Lacy. Due passi elettrogeniche potrebbe essere identificato e caratterizzato da misure di SSM. Una reazione fortemente elettrogenico rappresentando ~ 94% dello spostamento carica totale nella reazioneciclo si osserva solo a valori di pH neutro e di base. Potrebbe essere assegnato al passo di rilascio protone (freccia blu). Un passo debolmente elettrogenico viene osservata a pH acido, quando turnover continuo di wild-type Lacy è inibita. Abbiamo assegnato questa reazione ad una transizione conformazionale elettrogenico upon lattosio vincolante, che rappresenta il 6% del dislocamento carica totale nel ciclo di reazione.

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Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Qui vi presentiamo un metodo elettrofisiologico basata su solide membrane supportati con attenzione le sue applicazioni per la caratterizzazione dei trasportatori di membrana elettrogeniche.

Introduzione alla membrana supportata Solid Sulla Elettrofisiologia

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  Max Planck Institute of Biophysics. Qui vi presentiamo un metodo elettrofisiologico basata su solide membrane supportati con attenzione le sue applicazioni per la caratterizzazione dei trasportatori di membrana elettrogeniche.

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Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Applicando Microfluidica di Elettrofisiologia

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Ricerca

Biologia

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elettrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solida piastra a base di restrizioni alimentari, Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine ​​di membrana

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

Applicazione di misura di elettrofisiologia di studiare l'attività dei trasportatori di Electro-neutro

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...