Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft a SW (DFG WA 2804) e una borsa di studio universitaria a SW dal Centro di Ricerca Sperimentale e Clinica, una collaborazione del Centro Max Delbrück per la medicina molecolare e la Facoltà di Medicina Charité di Berlino. I finanziatori non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il Sig. Robert Westphal per il supporto tecnico durante il suo stage presso il nostro laboratorio.

Tutte le procedure sugli animali devono essere approvati dal comitato di benessere degli animali istituzionale locale prima dell&#39;esecuzione. Durante le misurazioni MR un adeguato livello di anestesia e monitoraggio fisiologico (temperatura corporea, frequenza respiratoria) sono requisiti indispensabili. 1. Generazione di mouse derivate dal midollo osseo cellule dendritiche <ol><li> Estrarre le cellule del midollo osseo da topi C57BL / 6 come precedentemente descritto 12. Tale protocollo risale al 1992 13 ed è stato originariamente descritto dal gruppo di Ralph M. Steinman (1943-2011), scopritore della cellula dendritica 14. </li><li> Brevemente, estrarre tibia e perone subito dopo sacrificare i topi. Lavorare sotto la cappa a flusso laminare (per prevenire la contaminazione microbica), lavare il midollo osseo in una piccola scatola di Petri con terreno di lavaggio (5% FBS, 1% penicillina / streptomicina e 1% HEPES in RPMI) 12. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare attraverso una stra cellainer (100 pm dimensione di maglia, nylon) in una provetta da centrifuga da 50 ml sterile per rimuovere tessuto osseo e avanzi. Dopo varie fasi di lavaggio e un passo 12 lisi, contare le cellule vitali mediante trypan blu e un emocitometro. </li><li> Risospendere le cellule del midollo osseo ad una concentrazione di 400.000 cellule -1 ml nel terreno di coltura (RPMI supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, 1% HEPES e 1% di L-glutammina) contenente 75 ng ml -1 della granulociti topo macrofagi fattore stimolante le colonie (MGM-CSF) ottenuto da surnatanti di 293FT cellule HEK trasfettate con un plasmide GMCSF del mouse. Trasferire 10 ml di sospensione cellulare (4 x 10 6 cellule) in piastre Petri (100 mm x 20 mm) e incubare in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Il giorno 3, ricostituire vecchia media con 10 ml di mezzo fresco (mantenendo la concentrazione finale di MGM-CSF a 75 ng ml -1). Il giorno 6, rimuovere 10 ml di vecchi media e ricostituirecon 10 ml di mezzo fresco (concentrazione finale MGM-CSF = 75 ng ml -1). Il giorno 8, rimuovere 10 ml di vecchi media e ricostituire con 10 ml di mezzo fresco (concentrazione finale MGM-CSF = 150 ng ml -1). </li><li> Il giorno 10, maturare la DC differenziata con 1 mg ml -1 lipopolisaccaride (LPS) per 24 ore. </li></ol> 2. Etichettatura delle cellule dendritiche con 19 F-ricchi Particelle <ol><li> Durante la fase di maturazione 24 ore (1.5), l&#39;etichetta DC con 1 mM di fluoro-ricchi perfluoro-15-crown-5-etere (PFCE) particelle (500-560 nm), anche per 24 ore. Preparare le grandi particelle di fluoro-etichettati emulsionando PFCE in Pluronic F-68 (volume totale 2,5 ml) utilizzando una cella-interrompendo titanio sonotrodo e impiegando un programma di impulso continuo (ampiezza 100%, power = 250 W) per 60 sec. </li><li> Seguendo le fasi di incubazione sopra, raccogliere il DC mature e fluoro-marcato utilizzando un tessuto coltura cellulare raschietto, trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml e centrifugarea 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Per eliminare ogni particella di avanzi e cellule morte, lasciare cellule raccolte di aderire su piatti poli-L-lisina. Per prepararsi a questo passo, cappotto Petri con poli-L-lisina (1 mg ml -1) a 37 ° C per 1 ora, poi lavare via il non legato poli-L-lisina con PBS. </li><li> Incubare sopra cellule raccolte sulle piastre poli-L-lisina in terreno privo di siero e consentono alle cellule di aderire (1 ora a 37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Lavare il medium di scartare le cellule non aderenti, particelle rimanenti e le cellule morte e lavare tre volte con pre-riscaldato (37 ° C) PBS. </li><li> Raccolto cellule aderenti dalla tripsina-EDTA trattamento (0,25% tripsina-EDTA, 3 min di incubazione a 37 ° C). </li><li> A seguito di un altro passo centrifugazione lavaggio, risospendere la quantità necessaria di DC mature nel siero PBS sterile. </li><li> Per determinare se le cellule sono state etichettate con successo, si consiglia di controllare il physicochecaratteristiche chimici innovativi delle cellule usando la citometria a flusso (FACS). La dispersione lateralmente (SSC) dovrebbe rivelare un maggiore granularità in queste cellule, come descritto in precedenza 11. Va tenuto inoltre presente che fibroblasti potrebbero contaminare le culture CC e potrebbero anche prendere le particelle 19 F in parallelo. Pertanto la purezza cc deve essere valutata (misurando la percentuale di CD11c + CD11b + cellule usando FACS) prima applicazione in vivo. </li></ol> 3. Applicazione in vivo di 19 cellule dendritiche F-etichettati <ol><li> Somministrare DC (10 giugno-10 luglio) in un volume di 50 - 100 l intracutaneously nelle arti posteriori di un C57BL / 6 del mouse posizionando il mouse in un supporto ed inserendo accuratamente un ago G 26 ½ negli strati superiori della pelle prima dell&#39;applicazione (uso 0,5 ml siringhe tubercolina con ago permanentemente collegati a ridurre al minimo il volume morto). Per garantire unan applicazione appropriata intracutaneous, è importante che la parte inserita dell&#39;ago sia parzialmente visibile sotto la pelle. Se l&#39;ago non è più visibile, l&#39;ago è stato inserito troppo in profondità negli strati cutanei. Per l&#39;individuo non addestrato, l&#39;applicazione intracutaneous potrebbe essere eseguita in anestesia. </li><li> Immagine degli arti dal vivo in fluoro (19 F) / protone (1 H), la risonanza magnetica (vedi sezione successiva) 21 ore dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 4. In Vivo 19 F / 1 H Risonanza Magnetica Le istruzioni dettagliate per la configurazione delle scansioni MR si riferiscono a uno scanner MR Bruker utilizzando il software di controllo Paravison (versione 5.1). Nomi riguardanti le funzioni e gli elementi specifici del produttore sono stati evidenziati in corsivo. Per altri scanner MR questi passaggi possono essere adattate secondo le direttive dei produttori. <ol><li> Disporre l&#39;accesso ad un appositopiccolo MR scanner animale. Per un&#39;adeguata qualità delle immagini, un sistema con un campo magnetico di 9.4 Tesla o più e su misura bobine a radio frequenza (ad esempio, 1 H / F 19 dual-sintonizzabile volume di bobina RF, a 35 mm di diametro interno, 50 mm di lunghezza; Rapid Biomed, Würzburg, Germania) sono raccomandati. </li><li> Prima di risonanza magnetica, preparare la configurazione dello scanner MRI per l&#39;anestesia e il monitoraggio fisiologico. Assicurarsi che la maschera respiratoria del letto / titolare animale è collegato al sistema di isoflurano e che la sonda di temperatura e pad respirazione sono collegati ad un sistema di monitoraggio remoto animale (ad esempio modello 1025, SA Instruments Inc., New York, USA). Quest&#39;ultimo serve per monitorare i parametri vitali dell&#39;animale nei quali la temperatura del corpo e la respirazione. </li><li> Anestetizzare topi da narcosi inalazione utilizzando una camera di mouse collegato a un sistema di isoflurano. Regolare la portata per aria e O 2 a 0,2 L min -1 e 0,1 L min-1, rispettivamentee il 3% isoflurano (regolata da un vaporizzatore) per circa 2 minuti fino a quando il livello richiesto di anestesia è raggiunto (nessuna risposta seguente pinch tep). Portate ottimali possono variare a seconda della configurazione in uso. Essere consapevoli del fatto che portate elevate possono portare alla disidratazione. Attento monitoraggio delle condizioni degli animali è necessaria in ogni momento come detto sopra. </li><li> Posizionare il mouse prona sul letto del mouse / titolare del piccolo animale MR scanner (figura 1). </li><li> Pur mantenendo la velocità di flusso per l&#39;aria e O2 costante, regolare il vaporizzatore isoflurano al 0,8-1,5% fino al raggiungimento di un modello di respirazione ottimale. Si raccomanda 70 respiri al minuto - una frequenza respiratoria di 50. </li><li> Mantenere la temperatura corporea a 36-37 ° C durante l&#39;esperimento utilizzando un acqua calda (o alternativamente aria calda) sistema di circolazione. </li><li> Tenete gli occhi del umida mouse con sterile pomata lubrificante occhio durante la misurazione. </li><li> Dopo aver assicurato il animalesul supporto imaging e le connessioni al sistema di monitoraggio, spostare il supporto al centro della H 1/19 F RF coil (che viene posizionato all&#39;isocentro del magnete scanner animale). </li><li> Impostare la posizione del mouse tale che il ginocchio si trova all&#39;interno all&#39;isocentro del magnete, sia con un metodo automatico (per esempio usando un laser di posizionamento combinata con un supporto animale motorizzato) oppure calcolando manualmente la distanza del titolare deve essere spostata nel magnete per raggiungere la isocentro. </li><li> Per confermare il corretto posizionamento dell&#39;animale nello scanner e successivamente pianificazione della geometria porzione di immagine (cioè le dimensioni, posizione e rotazione nello spazio), acquisire esplorare immagini in tre orientamenti standard (assiale, coronale, sagittale) risoluzione dell&#39;immagine basso e veloce utilizzando metodi di acquisizione (es. protocollo TriPilot, che utilizza una sequenza di impulsi FLASH). </li><li> Accordare la bobina RF alla frequenza di risonanza H 1 (ad esempio. 400,1 MHz per 9,4 T) e alla frequenza di risonanza 19 F (376,3 MHz per es 9.4 T) e abbinare l&#39;impedenza caratteristica della bobina a 50 Ohm utilizzando il monitor sintonia del MR scanner animale. Messa a punto e di corrispondenza è necessario per raggiungere le condizioni ottimali per la trasmissione e la ricezione del segnale. </li><li> Eseguire le impostazioni di sistema automatici necessari compresi spessoramento per ottimizzare l&#39;omogeneità del campo magnetico (ad esempio ADJ_SHIM), regolazioni di frequenza di sistema per sintonizzare la RF alla frequenza Lamor del mouse (per esempio ADJ_SF) e il guadagno di riferimento per regolare l&#39;ampiezza RF ( es ADJ_REFG). Tutte queste impostazioni sono importanti per rendere i campi magnetics statici e variabili (B 0, B 1) nella regione di interesse più possibile omogeneo. </li><li> Acquisire una seconda serie di immagini di scout (come sopra) lungo i tre orientamenti ortogonali, dopo aver regolato il campo di vista (FOV) tale che entrambi gli arti inferiori are visibile dal bacino al piede (LxWxH = 50x25x25 mm). Queste immagini servono per programmare gli orientamenti delle 3D 1 H / F 19 scansioni finali. </li><li> Impostare un protocollo TurboRARE 3D per 1 H-scan: TR / TE = 1,500 / 53 msec, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, Fattore RARE = 16 (. Scansione di tempo circa 60 min). Regolare FOV con l&#39;aiuto delle immagini di scout, avviare la scansione (semaforo). </li><li> Caricare un singolo impulso FID-sequenza con TR di almeno 1.000 msec. Aprire Edit Scan e impostare nucleo a 19 F. Utilizzare le impostazioni manuali di guadagno deselezionando il guadagno automatica del riferimento nel metodo Edit della Casella degli strumenti. </li><li> Avviare la misura senza registrazione dei dati per visualizzare un segnale MR in tempo reale utilizzando GSP (vai setup). Se il segnale spettrale 19 F entro la finestra di acquisizione è troppo bassa, aggiungere più medie in Modifica Metodo e / o modulare l&#39;attenuatore impulsi (TX0 o slider SP0) finché un SIgnale è chiaramente visibile. Regolare la frequenza di base per centrare il picco spettrale 19 F a 0 Hz nella finestra di acquisizione. Applicare frequenza di base e premere Stop. Si noti che l&#39;isoflurano utilizzata come anestesia può generare un segnale di fondo. A 9.4 Tesla MRI chemical shift tra le particelle 19 contenenti F e l&#39;isoflurano è di circa 1.800 Hz. Assicurarsi che la larghezza di banda di eccitazione è più piccolo di 3.600 Hz per evitare emozionante il isoflurano insieme con i 19 cellule o particelle F-etichettati. La frequenza di base deve essere impostata correttamente sul segnale generato dalle celle 19 F-etichettati. In alternativa, un altro metodo di anestesia potrebbe essere utilizzato come sperimentatore ritiene opportuno. </li><li> Clone (duplicare) il protocollo TurboRARE 3D dal precedente 1 H scansione. Vai a Modifica metodo e deselezionare il guadagno di riferimento automatico (come sopra). Set 19 F nucleo da Edit Scan. Cambiare la matrice di 128x64x64e il raro-Factor per almeno 40 (fino a 64). Per un TR / TE 1000/6 msec e 64 medie, il tempo di scansione è di circa 70 min. Impostare il guadagno del ricevitore di 101 (casella degli strumenti) e avviare la scansione senza ulteriori regolazioni utilizzando GOP (vai gasdotto). </li><li> Quando le scansioni sono finiti ritrarre il supporto per mouse dallo scanner MR. Staccare con cautela dal supporto del mouse. Se il mouse non viene sacrificato per analisi ex vivo (istologia o spettroscopia, vedi sotto), subito dopo le misurazioni MR, monitorare attentamente finché non ha completamente recuperato da anestesia. Regolazione della temperatura corporea è influenzata dalla anestesia, quindi durante il processo di recupero, mettere il mouse in una gabbia separata che è posto su un tampone a temperatura regolata caldo. Una volta che il mouse ha completamente recuperato da anestesia, riportarlo nella sua gabbia di detenzione e alla sala degli animali. </li><li> Per sovrapporre le 19 immagini F a 1 immagini H, utilizzare il menu Visualizza option sullo stesso software (Paravison). La funzione di sottotetto può essere trovato sotto Correlare. Salvare il sottofondo, caricare la nuova immagine ed evidenziare lo strato F 19 per la definizione di un nuovo colore dalla tabella di ricerca. Per discriminare tra i 19 F e 1 H scansioni, modificare la soglia per il colore scelto (tagliare Look up table) in modo che il segnale 19 F avrà il colore scelto e il 1 image H sfondo rimarrà in scala di grigi. Altri programmi di post-elaborazione (ad esempio ImageJ) sono a disposizione per creare le H 1/19 F sovrapposizioni di immagini. </li><li> Se una quantificazione in vivo del segnale 19 F essere necessario, seguire un semplice protocollo quantitativa come descritto in precedenza 15,16. In breve, la quantificazione può essere fatto mettendo un tubo di riferimento con una concentrazione nota di PFCE-Emulsione all&#39;interno del FOV vicino al mouse. Dopo aver acquisito le immagini MR, quanviduare le intensità dei segnali F 19 utilizzando regione d&#39;interesse analisi (ROI) e confrontare la curva di calibrazione in vitro come mostrato in Figura 2. </li></ol> 5. Linfonodo spettroscopia di risonanza magnetica (MRS) <ol><li> Dopo aver sacrificato il mouse, rimuovere il linfonodo popliteo e posto in una piccola 5 millimetri tubo NMR e aggiungere 100 ml di 2% PFA. </li><li> Installare una bobina spettroscopia 19 F (ad esempio una bobina toroidale), che ha un&#39;apertura di almeno 5 mm per reggere il tubo NMR contenente il linfonodo. </li><li> Porre il tubo NMR all&#39;interno della bobina e spostare la bobina in all&#39;isocentro del magnete. </li><li> Sintonizzare la bobina RF alla frequenza di risonanza 19 F (es 376,3 MHz per 9,4 T) e abbinare l&#39;impedenza caratteristica della bobina a 50 Ohm utilizzando il monitor sintonia del MR scanner animale. Messa a punto e di corrispondenza è necessario per raggiungere le condizioni ottimali per la trasmissione e il segnalericezione. </li><li> Impostare tutti i parametri spessori all&#39;interno della Casella degli strumenti Shimming a 0 e premere applicare. Solitamente, non è necessario applicare metodi spessoramento poiché il volume del campione è relativamente piccolo. Se un sufficiente segnale 19 F è disponibile, metodi automatizzati possono essere applicate per lo spessoramento, frequenza di sistema e il guadagno del ricevitore come descritto sopra. </li><li> Caricare un singolo impulso FID sequenza con un TR di almeno 1.000 msec. Aprire Modifica scansione e impostare il nucleo a 19 F. Utilizzare le impostazioni manuali di guadagno deselezionando il guadagno automatica del riferimento nel metodo Edit della Casella degli strumenti. Impostare il numero di medie a 1. </li><li> Avviare la sequenza usando GSP. Se il segnale spettrale 19 F entro la finestra di acquisizione è troppo bassa, aggiungere più medie in Modifica Metodo e / o modulare l&#39;attenuatore impulsi (TX0 o slider SP0) finché un segnale è chiaramente visibile. Regolare la frequenza di base in modo che il 19 F spepicco ctral è al centro della finestra di acquisizione a 0 Hz e applicare frequenza di base. Regolare nuovamente l&#39;attenuatore impulso per massimizzare il segnale, per raggiungere 90 ° eccitazione. Quando il segnale è al massimo di arresto stampa. </li><li> Impostare le medie in Edit Method tra 64 e 256 (o più se necessario, a seconda del segnale) e avviare l&#39;acquisizione utilizzando GOP. Il segnale rilevato correla linearmente con il numero di medie. Durante quantificazione tenere presente che il segnale rilevato deve essere normalizzato ad una media. Inoltre, uno standard di calibrazione di una concentrazione nota o una curva di calibrazione è necessario calcolare il numero di cellule del segnale normalizzato F 19 (Figura 2). </li><li> Una volta che la scansione è terminata, rimuovere il campione, posizionare il campione successivo e procedere con passo 5.3. </li></ol>

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M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy.">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).</li><li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo metodo di impiegare 19 F / 1 H MRI di seguire il movimento della CC nella linfonodo dà la possibilità di studiare i modelli di migrazione di cellule immunitarie in vivo. Le cellule dendritiche sono eccellenti esempi di rapida migrazione di cellule immunitarie che sono in grado di manovrare attraverso strutture tridimensionali senza strettamente aderire a substrati specifici 17. Sebbene la scarsa risoluzione spaziale (gamma micron) della tecnica descritta non è comparab...

Il monitoraggio delle cellule in vivo è un aspetto cruciale in diversi campi della biomedicina. Per questo, le tecniche di imaging non invasive che possono localizzare selettivamente le cellule per un periodo di tempo sono estremamente preziose. Prima dello sviluppo di tridimensionale risonanza magnetica (MRI), il monitoraggio della migrazione delle cellule immunitarie stato limitato alle analisi microscopiche o biopsie tissutali. Monitoraggio delle cellule con l&#39;aiuto della risonanza magnetica ha riscosso un enorme attenzione in questi ultimi anni, non solo per gli immunologi che studiano il comportamento delle cellule immunitarie in vivo, ma anche per i ricercatori clinici e di cellule staminali. Durante la metà degli anni &#39;90, i primi studi sulle nanoparticelle di ossido di ferro 1 avviato una cascata di sviluppi per le celle di rilevamento con la risonanza magnetica. Particelle di ossido di ferro abbreviare il tempo di rilassamento MR (T2 *) delle cellule marcate e quindi causare deplezione segnale nelle immagini RM. Le particelle di ossido di ferro sono stati impiegati per i macrofagi etichetta 2, oligodendrociti progenitors 3 e molti altri tipi di cellule. Alcune di queste particelle sono anche stati clinicamente approvato dalla FDA per l&#39;etichettatura di vaccini cellulari nei pazienti con melanoma 4. Dal momento che in vivo o l&#39;etichettatura ex vivo di cellule con particelle di ossido di ferro si basa su una riduzione del segnale T2 * e quest&#39;ultimo potrebbe essere portato anche su di suscettibilità in vivo relativi alla T2 * effetti come micro emorragie, depositi di ferro o bolle d&#39;aria, potrebbe essere difficile identificare cellule marcate in vivo da altra sfondo T2 * estinzioni di segnale 5. In questo articolo, si descrive una tecnica per il monitoraggio delle cellule dendritiche (DC) in vivo impiegando 19 F / 1 H risonanza magnetica (MRI). Questa tecnologia di tracciamento delle cellule è stato introdotto solo nel 2005 6, diversi anni dopo le prime applicazioni riconosciute per 19 F a risonanza magnetica sono stati riportati 7. Uno ADVA importantentage di 19 F su ferro ossido particella marcatura delle cellule è la bassa incidenza biologica di 19 F in tessuto, questo rende possibile l&#39;individuazione celle molto selettivamente con immagini praticamente prive sfondo. Inoltre, è possibile sovrapporre il segnale MR 19 F dalle cellule marcate trapiantate con immagini anatomiche ottenute da convenzionale 1H RMN. F 19/1 H MRI è quindi considerevolmente rilevante per studi che studiano migrazione delle cellule in vivo. Le cellule studiate con questo metodo sono etichettati con 19 particelle F-ricchi. Perfluorocarburi sinteticamente-derivati ​​(PFC) costituiti principalmente da carbonio e atomi di fluoro sono comunemente usati per preparare le particelle. Questi composti sono insolubili in acqua e devono essere emulsionato prima dell&#39;applicazione in vitro o in vivo. La dimensione usuale delle particelle PFC che sono stati impiegati da altri gruppi per in vivo 19 esperimenti di monitoraggio F-MRIvaria tra 100 nm e 245 nm 6,8-10. Tuttavia abbiamo dimostrato che l&#39;efficienza nella etichettatura cellule dendritiche con perfluoro-15-corona-5-etere (PFCE) particelle aumenta con l&#39;aumentare delle dimensioni delle particelle (&gt; 560 nm). 11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Charles River, Berlin</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21875-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS Superior</td>
 <td>Biochrom AG</td>
 <td>S 0615</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Gibco-Invitrogen</td>
 <td>15630-056</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15140-122</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25030-024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D8662</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Santa Cruz</td>
 <td>sc-281692</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfluoro-15-crown-5-ether </td>
 <td>ChemPur</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-68 </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P5556</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27 &frac12; G syringes</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>612-0151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon cell strainers (100 &mu;m mesh) </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>734-0004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NMR tubes </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>634-0461</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection tools</td>
 <td>FST</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator </td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small animal MR system</td>
 <td>Bruker Biospin</td>
 <td></td>
 <td>9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1H/19F dual-tunable volume RF coil </td>
 <td>Rapid Biomed, W&uuml;rzburg, Germany</td>
 <td></td>
 <td>35 mm inner diameter, 50 mm length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>19F spectroscopy coil </td>
 <td>in-house</td>
 <td></td>
 <td>tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isoflurane inhalation system</td>
 <td>F&ouml;hr Medical Instruments GmbH</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Animal monitoring system Model 1025</td>
 <td>SA Instruments Inc., New York, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

monitoring dendritic cell migration using 19f / 1h magnetic resonance imaging

Progressi continui in modalità di imaging non invasive, come la risonanza magnetica (MRI) hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di studiare i processi fisiologici o patologici negli organismi viventi. RM è anche dimostrando di essere un valido strumento per l&#39;acquisizione di cellule trapiantate in vivo. Strategie di etichettatura iniziali di cellule per uso MRI fatta di agenti di contrasto che influenzano i tempi di rilassamento MR (T1, T2, T2 *) e portare ad un miglioramento (T1) o esaurimento (T2 *) del segnale in cui sono presenti cellule marcate. T2 * agenti di miglioramento come ultrasmall ferro agenti di ossido (USPIO) sono stati impiegati per studiare la migrazione delle cellule e alcuni sono stati anche approvato dalla FDA per l&#39;applicazione clinica. Un inconveniente di T2 * agenti è la difficoltà di distinguere l&#39;estinzione segnale creato dalle cellule marcate da altre risorse come coaguli di sangue, micro sanguinamenti o bolle d&#39;aria. In questo articolo, descriviamo una tecnica emergente per le cellule di monitoraggio in vivo chesi basa sulla etichettatura delle cellule con fluoro (F 19) ricchi di particelle. Queste particelle sono preparate emulsionando perfluorocarburi (PFC) composti e poi utilizzata per etichettare le cellule, che successivamente può essere ripreso con 19 F MRI. Importanti vantaggi di PFC per il monitoraggio delle cellule in vivo includono (i) l&#39;assenza di carbonio-bound 19 F in vivo, che poi produce immagini sfondo-free e completa delle cellule selectivityand (ii) la possibilità di quantificare il segnale della cella di 19 F spettroscopia MR .

Diciotto a 21 ore dopo l&#39;applicazione intracutanea, 19 F-etichettati cellule dendritiche (DC), migrano nel linfonodo popliteo drenante. Il movimento delle DC attraverso i dotti linfatici nel linfonodo drenante politeal può essere apprezzata con sovrapposizione delle immagini 1 H anatomiche con le immagini CD 19 F (Figura 2A). Abbiamo precedentemente riportato sulla migrazione di queste cellule in vivo, così come l&#39;impatto di dimensione 19 F-...

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Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoraggio delle cellule utilizzando la risonanza magnetica ha guadagnato notevole attenzione negli ultimi anni. Questo protocollo descrive l&#39;etichettatura delle cellule dendritiche con fluoro (<sup&gt; 19</sup&gt; Particelle F)-ricchi, l&#39;applicazione in vivo di queste cellule, e monitorare l&#39;entità della loro migrazione verso il linfonodo drenante con<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H MRI e<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS.

Monitoraggio migrazione delle cellule dendritiche usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

11.7K Views.  A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine. Monitoraggio delle cellule utilizzando la risonanza magnetica ha guadagnato notevole attenzione negli ultimi anni. Questo protocollo descrive l'etichettatura delle cellule dendritiche con fluoro ( 19 Particelle F)-ricchi, l'applicazione in vivo di queste cellule, e monitorare l'entità della loro migrazione verso il linfonodo drenante con 19 F / 1 H MRI e 19 F MRS.

Video: Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

In tempo reale immagini di leucotriene B 4 Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Competitivo saggi Homing allo Studio Gut-tropico Migrazione cellulare T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Analisi della maturazione polmonare delle cellule dendritiche e migrazione durante l&#39;infiammazione allergica delle vie aeree

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Generazione di un nuovo vaccino a cellule dendritiche con melanoma e cellule staminali tumorali squamose

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Un test CFSE-based per studiare la migrazione delle cellule dendritiche murini della pelle in drenanti linfonodi durante l&#39;infezione con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...