Questo lavoro è stato supportato dal programma di Bernard L. Schwartz per gli scienziati di medico presso la Rockefeller University, il fondo di sviluppo terapeutico Robertson presso la Rockefeller University e la Sackler Center per la biomedicina e nutrizione ricerca presso la Rockefeller University.

tutte le procedure sono state approvate dal Rockefeller University &#39; s istituzionale Animal Care e Comitato di uso. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche.
 1. chemiotassi In Vitro <ol><li>cultura THP-1 cellule 6 nel 1640 di Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 4-(2-idrossietil) -1- acido piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 mM) (completo di media), mantenendo la densità tra 0,5-1,0 x 10 6 cellule/mL.</li>
	<li>Coltura di cellule in un 35 mm piatto, etichetta 3,5 x 10 5 THP-1 cellule per condizione con calceina acetossimetil (calceina-AM; 2,5 µM) o altre adatta tintura fluorescente nei media completi a 37 ° C per 30 min. 
	Nota: Coloranti devono essere permeabile della membrana cellulare e compatibile con cellule vive etichettatura.</li>
	<li>Pre-caldo un lettore di piastra a 37 ° C. 
	Nota: Oltre a controllo di temperatura, funzione inferiore-lettura è anche richiesto. Vedere il punto 1.10.2 per un'alternativa a un lettore di piastra per la quantificazione della migrazione cellule.</li>
	<li>Mentre le cellule sono etichettatura, preparare la piastra di dosaggio e la camera bassa.
	Piastra <ol><li>uso una cultura di tessuto 24 pozzetti, con una condizione per pozzetto. Eseguire ogni condizione in triplice copia.</li>
		<li>Aggiungere 750 µ l di Hank &#39; s soluzione salina tamponata (HBSS) tamponata con 25mm HEPES e 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) per la piastra a 24 pozzetti. Questo serve come la condizione basale di controllo.
		<ol><li>Uso altri pozzi per le condizioni di comparatore, mantenendo sempre il volume totale nel vano inferiore a 750 µ l. 
			Nota: In questo esempio, umano monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) serve come controllo positivo per chemiotassi 7.
			<ol><li>Assemblare la miscela reagente combinando HBSS con 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Utilizzare siero bovino adulto (2,7% v / v) con MCP-1 come un controllo positivo aggiuntivo. 
				Nota: Concentrazione delle chemochine e chemochine dipenderà l'asse chemiotattica sotto studio. Liofilizzato di MCP-1 è risospeso in acqua distillata con BSA (0,1%) per fare una soluzione di riserva con una concentrazione finale di 50 μg/mL. Questo può essere diluito in acqua per una soluzione di lavoro di 10 μg/mL. Aggiungere 5,6 μL della soluzione per la camera inferiore.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Dopo aver completata la composizione delle sezioni inferiore, collocare un inserto poroso in ciascun pozzetto, assicurando che le schede dell'inserto allineano con le tacche della piastra. 
		Nota: Scegliere il formato del poro appropriato per gli inserti. Per i monociti e linfociti, un diametro dei pori di 3 μm si comporta bene. Alcuni tipi di cellule e/o sistemi di chemokine possono richiedere una superficie verniciata a matrice per migrazione ottimale. Ad esempio, per misurare la chemiotassi di monociti THP-1 verso MCP-1, fibronectina o rivestite con collagene inserti sono raccomandati. Per il lettore per la quantificazione, l'inserto deve avere un rivestimento luce-impermeant, come polietilene tereftalato, per impedire il rilevamento di migrazione non celle nella parte superiore dell'alloggiamento 8.</li>
	</ol></li> <li>Dopo incubazione le cellule per 30 min con calceina-AM, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15mL. Cellule di centrifugare a 1.000 x g per 2 min. Ispezionare visivamente le cellule per confermare l'assorbimento di calceina-AM ( Figura 1).</li>
	<li>Rimuovere con cautela il supernatante utilizzando un aspiratore. Lavare le cellule con etichettate in privo di siero RPMI 1640 completati con 25mm HEPES. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 minuti e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in privo di siero RPMI 1640 completati con 25mm HEPES. Contare le celle e regolare il volume in modo che le cellule sono ad una concentrazione finale di 1.0-1.5 x 10 6 cellule/mL.</li>
	<li>Dispensare 250 μL della sospensione delle cellule nell'inserto (camera superiore).</li>
	<li>Dopo che tutte le camere superiori sono state riempite, delicatamente sollevare la piastra e ispezionare la parte inferiore per la presenza di bolle d'aria che potrebbero interferire con la migrazione e la rilevazione. Per rimuovere una bolla, prima di provare a rimuovere poi ri-posizionamento dell'inserto. In caso contrario, utilizzare un ago 27G per bucare la bolla e quindi riposizionare l'inserto.</li>
	<li>Collocare la piastra nel lettore di piastra preriscaldata 37 ° C.
	<ol><li>Letture di fluorescenza di acquisire dal fondo ad intervalli di 1-3 min. Quando si utilizza calceina-AM, impostare la fluorescenza lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione a 485 nm e 520 nm, rispettivamente. A seconda del sistema di tipo e chemochine cella, chemiotassi si verifica in genere oltre 1-4 h ( Figura 2A).</li>
		<li>Come alternativa alle misurazioni continue di immagine utilizzando un lettore di piastra, pozzi usando un microscopio fluorescente invertito ( Figura 2B), in grado di eccitazione e di rilevamento della luce a 485 nm e 520 nm, rispettivamente. Utilizzare un basso ingrandimento per acquisire la maggior parte della parte inferiore dell'inserto. Quantificare le cellule di elaborazione delle immagini con ImageJ o simili software 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Trasferimento adottivo di linfociti murini <ol><li>preparazione delle cellule erogarici <ol><li>Anesthetize 8-12 settimana-vecchi topi di donatore maschio C57BL/6J con isoflurano anestesia (1-3%) utilizzando un vaporizzatore. Confermare appropriata profondità dell'anestesia di punta-pizzico.</li>
		<li>Posizionare il mouse nella posizione supina. Fare un'incisione del midline con un bisturi e individuare la milza nello spazio peritoneale superiore di sinistra. Asportare la milza intera e metterli in media completi (RPMI completato con 10% FBS e 25mm HEPES; 1 mL/milza) su ghiaccio. Eutanasia di animali anestetizzati donatori per decapitazione.</li>
		<li>Macinare tessuto della milza delicatamente attraverso 40 µm in nylon mesh in completa per i media (1ml /spleen) usando l'estremità di un stantuffo della siringa per fare una cella singola sospensione e trasferimento di una provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi di lisi di ammonio cloruro potassio (ACK) buffer e incubare per 5 min a temperatura ambiente per lisare gli eritrociti.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Se gli eritrociti rimangono nel pellet, risospendere in buffer di lisi ACK, incubare per 5 min a temperatura ambiente, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 min e gettare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in completa per i media ad una concentrazione di 2-5 x 10 7 cellule/mL, quindi colare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon di 40 µm per rimuovere i detriti cellulari.</li>
		<li>Etichetta 1 x 10 7 mouse di cellule/destinatario con un colorante fluorescente compatibile con cellule vive e che sarà mantenuto anche dopo la fissazione successiva, ad esempio 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentrazione finale 2 μM) 10 . Incubare a 37 ° C per 30 min. 
		Nota: Per tenere traccia di più di una popolazione di cellule, utilizzare altri coloranti fluorescenti con popolazioni di altre cellule. Se, ad esempio, una porzione delle cellule erogarici possa essere etichettata con 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoile) ammino) tetrametilrodamina (concentrazione finale 2 μM) 11.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi HBSS completati con 25mm HEPES, poi Centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti e scartare surnatante. Risospendere il pellet in HBSS completati con 25mm HEPES ad una concentrazione finale di 1 x 10 8 cellule/mL.
		<ol><li>Se si utilizza più di un colorante fluorescente, mantenere popolazioni cellulari separate fino al momento immediatamente precedente iniezione.</li>
			<li>Trasferire una piccola aliquota (10 μL) delle cellule di ogni colore a una soluzione fissante (1 mL) per compensazione di cytometry di flusso successivo.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Trasferimento dei linfociti <ol><li>anestetizzare 8-12 settimana-vecchio C57BL/6J topi maschi destinatari con isoflurano (1-3%) utilizzando un vaporizzatore; confermare la profondità dell'anestesia di punta-pizzico. Applicare unguento veterinario animale &#39; gli occhi per evitare l'essiccazione.</li>
		<li>Brevemente le cellule erogarici vortice (1 s) e trasferimento a siringa di iniezione da 1 mL con 27 G, 0,5 in ago, combinando le popolazioni delle cellule differenzialmente etichettati, se applicabile.
		<ol><li>Una piccola aliquota (10 μL): trasferimento di cellule miste a una soluzione fissante (1 mL) per le analisi di citometria a flusso successivo.</li>
		</ol></li> <li>Posto animali donatori in posizione prona. Applicare pressione caudale lieve sulla pelle dorsale per l'occhio, causando il bulbo oculare a sporgere leggermente.</li>
		<li>Dirigere l'ago medialmente e iniettare 100 µ l di sospensione cellulare donatore retrò-orbitally in ogni destinatario mouse. Cellule possono anche essere iniettate tramite vena caudale.</li>
		<li>, Gradualmente, ritirare l'ago per iniezione e posizionare il mouse da solo in una gabbia di recupero. Animale di monitor fino a quando ha riacquistato coscienza; una volta completamente recuperato ritorno l'animale all'housing sociale.</li>
	</ol></li> <li>Raccolta e l'analisi <ol><li>dopo 1 h, anestetizzare destinatari topi con isoflurano anestesia (1-3%) utilizzando un vaporizzatore; confermare la profondità dell'anestesia di punta-pizzico. Raccogliere la milza (o altri tessuti di interesse) (punto 2.1.2.) da ogni destinatario mouse e posto in un supporto completo (1 mL/destinatario). Eutanasia di animali anestetizzati per decapitazione. 
		Nota: Gli intervalli più lunghi prima del raccolto del tessuto aumenterà accumulo di tessuto attraverso almeno 24 h.</li>
		<li>Macinare tessuto della milza delicatamente attraverso 40 µm in nylon mesh in completa per i media usando la parte di un stantuffo della siringa per fare una cella singola sospensione e trasferimento per provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi di lisi ACK buffer e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.000 x g per 2 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in colorazione buffer (tampone fosfato salino completato con 1% FBS). Contare le celle e regolare a una concentrazione finale di 3 x 10 7 cellule/mL. Trasferire 100 µ l di sospensione cellulare a un 96 pozzetti fondo piatto rotondo.</li>
		<li>Cellule di macchia per marcatori desiderati (vedere la tabella materiali) per l'analisi di citometria a flusso. Aggiungere anticorpi coniugati fluoroforo (Vedi la tabella materiali) contro marcatori desiderati e incubare a 4 ° C per 20 min al buio. Aggiungere 100 µ l tampone di colorazione, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 200 µ l tampone di colorazione, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in macchiatura di 125 µ l tampone e acquisire campioni usando un cytometer di flusso utilizzando le procedure standard. 
		Nota: Il colorante verde viene eccitato da un laser a 488 nm e l'emissione viene rilevata con filtri dicroici 505 e 530/30. Il colorante arancio viene eccitato da un 561 nm e l'emissione viene rilevata da un filtro dicroico 582/15.
		<ol><li>Uso salvato le cellule dalla 2.1.8.2 per compensare ogni tintura fluorescente. 
			Nota: Utilizzando la compensazione basata sul tallone con fluorofori l'eccitazione e spettri di emissione delle tinture d'etichettatura corrispondenti si tradurrà in compensazione suboptimali.</li>
			<li>Utilizzare le celle di input salvate dal punto 2.2.2.1 per determinare con precisione il rapporto tra differenzialmente etichettato celle di input se si utilizza più di una popolazione con etichetta ( Figura 3). Calcolare la migrazione specifica del tessuto sulla base del rapporto di etichettati alle cellule senza etichetta ( Figura 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Quantificazione della migrazione delle cellule immuni può essere compiuta usando semplice e veloce saggi sia in vitro che in vivo. Dimostriamo la chemiotassi in vitro di monociti umani in risposta un gradiente di MCP-1 e l'aumento di siero. In vivo, gli splenocytes murini donatore differenzialmente sono stati etichettati e a seguito di trasferimento adottivo, sono stati recuperati dal destinatari animali.
Utilizzando un lettore di piastra ha il vantaggio di...

Robusta immunità richiede il complesso coordinamento temporale e spaziale di una miriade di tipi di cellule al fine di rispondere in modo appropriato alla lesione, infezione e generare auto-tolleranza. Parecchi dozzina recettori per le chemochine e loro corrispondenti ligandi sono stati scoperti e caratterizzati fornendo meccanismi molecolari da cui le cellule specifiche possono essere diretto in un tessuto specifico in un momento specifico. Pertanto, studiare chemiotassi e migrazione è una componente indispensabile di ricerca in immunologia. Infatti, l'analisi descritta in vitro è stata recentemente usata come uno strumento di screening per identificare un cofattore chemiotattico che accelera la chemiotassi delle cellule T verso C-C chemochine 19 e 213. Lo scopo dei metodi descritti qui sono per consentire valutazioni quantitative della chemiotassi delle cellule immuni in vitro e in vivo.
L'analisi della camera di Boyden (migrazione cellulare e invasione) è un metodo poco costoso, riproducibile e rapido per valutare la migrazione cellulare4,5. In analisi standard, camera superiore è seminata con le cellule ed è separata da un inserto poroso da un alloggiamento più basso, in cui le cellule migrano. Al momento desiderato, le cellule che hanno migrato alla parte inferiore dell'inserto possono essere fissa e macchiate per quantificazione di microscopia chiara. Tuttavia, tali misure vincolano la raccolta di dati di un singolo punto di fine, che preclude la raccolta di dati dinamica e possono richiedere la vasta ottimizzazione per determinare il punto di tempo ottimale per l'analisi. Qui, diversi adattamenti sono descritti che consentono misurazioni in tempo reale, quantitative e multiplex di chemiotassi in vitro.
Per in vivo gli studi, viene utilizzato un punto di fine funzionale, vale a dire l'accumulo specifico delle cellule in un vano dato tessuto. Le cellule erogarici pre-etichettata vengono introdotti in animali destinatari attraverso trasferimento adottivo. Queste cellule del donatore possono essere identificate successivamente tramite flusso cytometry dopo il raccolto di destinatario del tessuto. È anche presentata una strategia co-etichettatura che consente per la determinazione del traffico di tipi differenti delle cellule all'interno di un singolo animale destinatario. Questo metodo elimina la variazione inter-animale da iniezione di cellule e conti per fisiologica variabilità.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

La chemiotassi è migrazione lungo un gradiente chimico specifico1. Le chemochine sono citochine chemiotattiche che promuovono il traffico cellulare con specificità anatomiche e temporale2. La chemiotassi è una funzione critica dei linfociti e altre cellule immuni che possono essere quantitativamente valutata in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi che consentono la valutazione della chemiotassi, sia in vitro che in vivo, per tipi cellulari diversi tra cui linee cellulari e cellule native. Lo in vitro, formato basato su piastra permette il confronto delle diverse condizioni contemporaneamente in tempo reale e può essere completato entro 1-4 h. In vitro analisi condizioni possono essere manipolate per introdurre gli agonisti e antagonisti, come bene come differenziare la chemiotassi da chemokinesis, che è il movimento casuale. Per le valutazioni traffico in vivo , le cellule immuni possono essere contrassegnate con le tinture fluorescenti più e utilizzate per trasferimento adottivo. L'etichettatura differenziale delle cellule consente di popolazioni di cellule miste ad essere introdotti nello stesso animale, quindi diminuendo la varianza e riducendo il numero di animali necessari per un esperimento adeguatamente alimentato. Migrazione nel tessuto linfoide si verifica in meno di 1 h e compartimenti multipli possono essere campionati. Citometria a flusso successivo vendemmia del tessuto permette un'analisi rapida e quantitativa dei flussi migratori di più tipi di cellule.

Quando si utilizza il colorante calceina-AM, ispezione visiva delle cellule confermerà l'assorbimento etichetta (Figura 1). Letture di fluorescente automatizzate terrà traccia migrazione come transito di cellule sulla parte inferiore dell'inserto nel corso del tempo. Questi dati mostrano chiaramente un'induzione della migrazione cellulare verso MCP-1, così come un aumento di questa risposta dal siero (Figura 2A). A seconda del...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Views.  The Rockefeller University. Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Isolamento linfociti T umani, la cultura e l&#39;analisi delle migrazioni In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.