Questo lavoro è stato svolto in parte presso il Centro per i sistemi su nanoscala (CNS), un membro della rete nazionale per le infrastrutture Nanotechnology (NNIN), che è supportato dalla National Science Foundation NSF in premio n. ECS-0335765. CNS fa parte della Harvard University.

Il protocollo di generare allineato tessuto funzionale del miocardio può essere divisa in tre parti principali. La fabbricazione del master micropatterned utilizzando tecniche di litografia morbida non è considerato parte del protocollo seguente, ma può essere fatta in base al metodo stabilito 6. 1. Stampa microcontact di fibronectina su PDMS Substrati <ol><li> Mescolare Sylgard 184 (Dow Corning) elastomero PDMS in una base da 10:1 a curare il rapporto agente e degassare l&#39;assembly utilizzando un essiccatore per eliminare eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Cure PDMS contro un master precedentemente fabbricato con 20 micron di larghezza e 2 micron alti crinali, separati da 20 micron spaziatura sia per 2 giorni a temperatura ambiente o 4 ore a 65 ° C per ottenere microtextured francobolli PDMS. </li></ol> * Curare in un essiccatore è altamente raccomandato per eliminare eventuali bolle d&#39;aria. <ol start="3"><li> Spin cappotto PDMS su vetrini coprioggetto di vetro (ad esempio,22x22 mm) a 5.000 rpm per 2 minuti usando un rivestitore a rotazione Headway produrre sottile e uniforme PDMS substrati di spessore 15 micron. </li><li> Pulire francobolli con il 70% di etanolo per rimuovere la polvere e le particelle di sporco. Lasciate asciugare all&#39;aria. </li></ol> Francobolli * può essere utilizzato più volte, però, rinnovando francobolli PDMS su base regolare è raccomandato a causa di una abrasione della superficie nel tempo. <ol start="5"><li> Francobolli di luogo in un plasma-Prep Cleaner SPI II al plasma e di processo per 1 min a 275 mTorr per renderizzare superfici PDMS idrofilo. </li></ol> Ossigeno * trattamento al plasma dovrebbe essere guardato. Tempi di trattamento più lunghi possono causare la rottura del elastomero. <ol start="6"><li> Sterilizzare francobolli con etanolo al 70% per 1 min. Asciugare rapidamente con aria compressa. </li></ol> * Ulteriori misure devono essere eseguite in una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità. <ol start="7"><li> Coprire timbro superfici con Fibronectin soluzione (50 mg / ml in DDH 2 O). Lasciare assorbire almeno 10 min. </li><li> Scuotere soluzione fibronectina dai francobolli e asciugare rapidamente con aria compressa. </li><li> Stabilire contatto conforme tra francobolli e PDMS substrati per 2 minuti e premere con decisione. </li><li> Sciacquare substrati micropatterned con DDH 2 O. Conservare in DDH 2 O per un massimo di 2 settimane a 4 ° C, salvo inizialmente utilizzato. Conservare PDMS francobolli in DDH 2 O. </li></ol> 2. Manutenzione di doppie linee staminali embrionali transgeniche In primo luogo, preparare i seguenti supporti per la coltura di cellule di topo ES: Fibroblasti embrionali di topo (MEF)-Medium: Dulbecco modificato (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS) ES cellule o Differenziazione-grade, 1% penicillina-streptomicina (P / S) Cellule staminali embrionali (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS cellule ES-grade,1% Aminoacidi non essenziali (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% leucemia inibitorio Factor (LIF), 0,0007% 2-mercaptoetanolo (2-ME) <ol><li> Cappotto piastre da 6 pozzetti con 0,1% di gelatina sterile in DDH 2 O e lasciate assorbire 15 min a 37 ° C. </li><li> Aggiungere MEFs da una aliquota scongelati a 50 ml PBS in una provetta conica e centrifugare loro a 1.000 rpm per 5 min. Risospendere in MEF MEF-media. </li><li> Dopo l&#39;assorbimento, aspirare l&#39;eccesso gelatina e aggiungere MEF nei pozzetti. Lasciare MEF 1 giorno a fissare. </li></ol> * Una aliquota di 10 milioni di MEF è sufficiente per 3 piastre da 6 pozzetti. <ol start="4"><li> Quando MEFs sono attaccati, aggiungere cellule ES da una aliquota scongelati a 50 ml PBS in una provetta conica e centrifugare loro a 1000 rpm per 5 min. Risospendere le cellule ES in ESC-media e aggiungerli ai pozzetti contenenti MEF. Cultura cellule ES in ESC-medio fino a confluenza è raggiunto. </li></ol> * Una volta che le cellule staminali hanno raggiunto confluenza, passaging è requIRED per evitare la crescita eccessiva e mantenere colonie di cellule ES. <ol start="5"><li> Preparazione delle cellule ES per passaging. Aspirare ESC-media e lavare una volta con PBS sterile. </li><li> Aspirare PBS e aggiungere 500 ml di tripsina. Processo di 3,5 minuti a 37 ° C. </li><li> Pipettare la soluzione tripsina su e giù diverse volte per abbattere colonie di cellule ES e neutralizzarla con 500 ml di ESC-media. </li><li> Cellule ES passaggio secondo il rapporto desiderato, ad esempio 33 microlitri trasferimento ad un altro ben preparato precedentemente con MEFs al passaggio 1/30. Mantenere le cellule ES in ESC-Medium. </li></ol> * Un rapporto di passaggio di 1/30 consente alle cellule staminali di raggiungere la confluenza entro 3 giorni. Cellule ES Passage secondo il vostro programma nel differenziamento in vitro. 3. Differenziamento in vitro di doppie linee di cellule staminali embrionali transgeniche cellulari e isolamento e il seeding dei progenitori cardiaci In primo luogo, preparare il followisupporti ng necessario per la differenziazione in vitro di cellule staminali: Adattamento-Medium: Medio Iscove Modified Dulbecco (IMDM), il 15% delle cellule ES FBS-grade, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME Differenziazione-Medium: IMDM, 15% FBS Differenziazione-grade. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% di acido ascorbico 0,1 M, 0,0007% 2-ME <ol><li> Avviare il differenziamento in vitro, quando le cellule ES hanno raggiunto confluenza. Cappotto 10 piatti di coltura sterile cm con 0,1% di gelatina in DDH 2 O e lasciarlo assorbire 15 min a 37 ° C. </li></ol> * Essere consapevoli della durata del processo di differenziazione in vitro. Ci vogliono 8 giorni fino progenitori cardiaci può essere isolato. Organizza il tuo esperimenti di conseguenza. <ol start="2"><li> ES cellule Harvest come prima. Dopo l&#39;assorbimento, aspirare l&#39;eccesso gelatina e aggiungere circa 1/3-1/2 della sospensione cellulare ES alla cultura preparatapiatti contenenti Adaptation-media. Cellule di coltura per 2 giorni. </li></ol> * Scegli la quantità di cellule ES per l&#39;adattamento in base alle proprie esperienze. <ol start="3"><li> Harvest adattato cellule ES in una provetta da 50 ml contenente PBS usando 1. 5 ml di tripsina. Centrifugare le cellule ES dissociate a 1000 rpm per 5 minuti e risospendere in Differenziazione-media. </li><li> Fai corpi embrionali (EBS) di circa 1.000 cellule per 10 microlitri in calo piatti cm 15 di coltura utilizzando una pipetta multicanale. Capovolgere le piastre e la cultura EBS come appendere gocce per 2,5 giorni a 37 ° C. </li><li> Dopo 2,5 giorni, piscina EBs di 6-8 cm 15 piatti di coltura in uno utilizzando Differenziazione-media e la cultura li per altri 3,5 giorni a 37 ° C. </li><li> Dopo 3,5 giorni, raccogliere EBs in un tubo da 50 ml conica e far loro si depositano sul fondo per circa 5 min. Aspirare il surnatante e lavare EBS con PBS sterile. Lasciate EBs affondare di nuovo verso il basso per caoximately 5 min. </li><li> Dissociate EBs elaborando con 2. 5 ml di tripsina per 2 minuti in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C agitando la provetta dolcemente. Quindi, aggiungere 2. 5 ml di PBS sterile alla soluzione tripsina e pipettare su e giù con una pipetta 10 ml sierologica circa 8-10 volte per abbattere cluster cellulari. Neutralizzare tripsina con 10 ml di tampone FACS contenente 7,5% FBS cellule ES-o-Differenziazione grado e 0,01% in PBS DAPI. </li><li> Centrifugare dissociato EBs a 1000 rpm per 5 minuti e risospendere in circa 1 ml di tampone FACS. Pipettare su e giù con una pipetta 1 ml circa 8-10 volte per abbattere cluster cellulari. </li></ol> * Aggiungi tampone FACS in base alla quantità stimata di dissociata EBS. Cellule ad essere estremamente concentrati possono ostruire durante FACS e le cellule concentrate troppo bassi possono prolungare il tempo di FACS inutilmente. <ol start="9"><li> Trasferire le cellule a una sterile a fondo rotondo tubo con un colino cella 35 micron per ottenereuna sospensione singola cella. </li><li> Cellule ES Ordina differenziate utilizzando un citofluorimetro FACSAria e ottenere purificata popolazioni di CVP. </li></ol> * Abbiamo sviluppato un multi-step strategia di gating per isolare altamente purificate celle colorate. In breve, abbiamo primo cancello sulla ampiezza forward scatter (FSC-A) e Scatter ampiezza laterale (SSC-A) (Figura 1A). Questo ci permette di separare le cellule intere da detriti cellulari. Abbiamo poi cancello FSC-A e Forward Scatter-Larghezza (FSC-W) (Figura 1B). Questo ci permette di isolare cellule canottiere da doppiette e altri aggregati cellulari. Abbiamo poi cancello SSC-A e Side Scatter-Larghezza (SSC-W) (Figura 1C). Questo aumenta la purezza singoletti cellulari. Abbiamo poi cancello colorazione DAPI per isolare cellule vitali (DAPI-negativi) da cellule non vitali (Figura 1D). Abbiamo poi cancello Phycoeryhthrin ampiezza (PE-A) e PE-Cyanine colorante 7 Ampiezza (PE-Cy7-A) per ottenere vera rosso-positivo (R + </sup&gt;) e True Red-negativi (R - cellule) e di escludere autofluorescenti rosso-negativi cellule (Figura 1E). R + e R - le cellule sono poi gated separatamente ampiezza isotiocianato di fluoresceina (FITC-A) e PE-A per ordinare i veri verde-positivi (+ G) e vero verde-negativi (G -), le cellule all&#39;interno di queste popolazioni (Figura 1F + 1G). Ciò si traduce in 4 popolazioni di cellule come segue: R + G +, R + G -, R - G + e R - G - (Figura 1H). <ol start="11"><li> Passivare micropatterned substrati con 1% Pluronic F-127 in DDH 2 O per 10 min. Poi, lavarli 3 volte con PBS sterile. </li></ol> * Pluronic F-127 è un tensioattivo che blocca l&#39;adesione cellulare. Supporta confinamento di adesione delle cellule alla zona micropatterned. <ol start="12"><li> Fissare le guarnizioni PDMS in tutta la regione modellatae premere con decisione. Poi, CVP seme su fibronectina substrati micropatterned. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

In questo protocollo, abbiamo presentato un metodo per isolare popolazioni purificate di cellule progenitrici cardiogeno e alle sementi li micropatterned substrati fibronectina ciò che permette loro di allineamento e di prendere un miociti cardiaci forma a bacchetta. Normale organizzazione cellulare è fondamentale per la funzione tessuto normale 8,10, in particolare per il tessuto miocardico. Miociti cardiaci hanno dimostrato di sviluppare meccaniche migliorate proprietà elettrofisiologiche 11,12</sup...

Nonostante i recenti progressi nella terapia medica, scompenso cardiaco avanzato rimane una delle principali cause di mortalità e morbilità nel mondo sviluppato. La sindrome clinica nasce da una perdita di tessuto miocardico funzionale e successivamente una incapacità del cuore scompensato per soddisfare le richieste metaboliche dei soggetti affetti. Dal momento che il cuore ha una capacità limitata di rigenerazione, il trapianto di cuore autologo è l&#39;unica terapia in corso clinicamente accettati direttamente volto a rifornire perso tessuto funzionale del cuore. Svantaggi significativi del trapianto di cuore, tra cui un numero limitato di cuori donatori e alla necessità di una terapia a lungo termine immunosoppressiva, preclude l&#39;uso molto diffuso di questa terapia. Come risultato, la terapia medica è stato il cardine del trattamento per pazienti con malattia cardiaca. Una sfida importante nello sviluppo di farmaci è l&#39;identificazione di saggi cellulari che ricapitolano accuratamente fisiologia normale e patologica del miocardio in vitro. <html> La convergenza recente di biologia delle cellule staminali e l&#39;ingegneria dei tessuti tecnologia solleva nuove vie promettenti per la rigenerazione cardiaca. Generazione funzionale del tessuto miocardico da un rinnovabili paziente-specifica fonte sarebbe un importante passo avanti nel campo. Ciò consentirebbe lo sviluppo di malattie saggi specifici cellulari per lo sviluppo di farmaci e di scoperta e avrebbe posto le basi per la medicina rigenerativa cardiaca. Umane staminali embrionali (ES), le cellule e, soprattutto, umane staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule rappresentano un potenziale rinnovabile paziente-specifica fonte di cellule progenitrici ventricolari e dei miociti ventricolari maturi. La combinazione di biologia delle cellule staminali e strategie di ingegneria tessutale risolve questo problema generando tessuto cardiaco funzionale in vitro che possono essere utilizzati per lo sviluppo di saggi cellulari per la scoperta di farmaci o in cardiaci approcci rigenerativi per il trattamento di insufficienza cardiaca avanzata. _content &quot;&gt; Una sfida centrale nella rigenerazione cardiaca è stata l&#39;identificazione di un tipo cellulare ottimale. Una vasta gamma di cellule sono state studiate 1, tuttavia ad oggi, pur differenti precursori multipotenti cardiogeniche da fonti diverse sono stati scoperti, l&#39;identificazione di una cellula fonte che soddisfa i requisiti critici come impegno per il destino cellulare miogenico, mantenimento della capacità di espandersi in vivo o in vitro e la composizione di un tessuto funzionale del miocardio ha dimostrato di essere un problema centrale 2. Abbiamo precedentemente descritto un doppio sistema transgenico murino che permette l&#39;isolamento di popolazioni altamente purificate di progenitori ventricolari impegnati (CVP) da cellule ES differenziazione in vitro. Abbiamo generato un romanzo topo transgenico doppia che esprime la proteina fluorescente rossa DsRed sotto il controllo di un Isl1-dipendente enhancer del gene MEF2C e rafforzata di proteina fluorescente verde sotto il controllo diil cardio-specifica Nkx2.5 enhancer. Sulla base di questa bicolore sistema reporter fluorescente, primo e secondo progenitori cardiaci campo da cellule ES di sviluppo possono essere isolati mediante fluorescenza activated cell sorting (FACS) secondo la loro espressione di MEF2C e Nkx2.5 geni. CVP assomigliano miociti cardiaci in base agli schemi di espressione dei marcatori del miocardio e le qualità strutturali e funzionali 3, quello che offre una grande promessa per scopi di rigenerazione dei tessuti cardiaci. Anche se ci sono stati molti progressi nel campo dell&#39;ingegneria tissutale, imitando nativo architettura cellulare rimane una sfida fondamentale. I metodi convenzionali per affrontare questa sfida sono semina scaffold biologici o sintetici con cellule in vitro. Causa di una serie di svantaggi, tra scaffold rapida degradazione, limitata stabilità fisica e meccanica e bassa densità cellulare 1,4,5, abbiamo tentato di progettare scaffold-meno tessuto. AltHough cellule cardiache possono modificare il loro microambiente locale, attraverso la secrezione di proteine ​​della matrice extracellulare, hanno una capacità più limitata ad organizzarsi per asta a forma di miociti cardiaci in assenza di segnali extracellulari. Così, un modello che fornisce indicazioni appropriate cellule spaziali e biologici a comporre funzionale tessuto miocardico è richiesto. Stampa microcontact risolve questo problema fornendo una tecnica semplice ed economico per controllare con precisione la forma delle cellule, organizzazione e funzione 6-8, tutti che sono cruciali per la generazione di allineato tessuto funzionale del miocardio. Esso comprende l&#39;uso di microtextured polidimetilsilossano (PDMS) francobolli con dimensioni caratteristiche che variano fino a 2 micron 9 che permettono la deposizione di proteine ​​della matrice extracellulare su substrati PDMS in schemi precisi e quindi di incidere adesione cellulare spazialmente. Qui, ci si propone di combinare la tecnologia della bioingegneria dei tessuti con stelo cell biologia per generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio. Di conseguenza, abbiamo qui dimostrano nostro approccio recentemente pubblicato per i seguenti: (1) la generazione di superfici proteiche micropatterned il PDMS substrati da stampa microcontact per la generazione di un modello per il tessuto miocardico allineati, (2) l&#39;isolamento di altamente purificata da progenitori cardiaci cellule ES differenziazione in vitro, e (3) la combinazione di entrambe le tecniche per generare allineato funzionale tessuto miocardico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Acido L-ascorbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> Preparare la soluzione 0.1M in DDH 2 O </td></tr><tr><td> Essiccatore, vuoto da 10 pollici </td><td> Nova-Tech International, Inc. </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo, cloridrato (DAPI) </td><td> Life Technologies </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle modificato da Dulbecco Medio </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II Citofluorimetro </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovinoCellule ES-grade </td><td> Gemini Bio-Prodotti </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum Differenziazione-grade </td><td> Gemini Bio-Prodotti </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectina da plasma bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4759 </td><td> Solubilizzare a 1 mg / ml in DDH 2 O </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium copertura di vetro 22x22mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina da pelle suina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Preparare una soluzione 0,1% in DDH 2 O </td></tr><tr><td> Headway Spin Coater </td><td> Headway Research, Inc. </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Iscove Modified Dulbecco </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fattore inibitorio di leucemia </td><td> Se stesso-Preparato da LIF-secernenti linee cellulari </td><td></td><td> Preparare la soluzione 500x magazzino </td></tr><tr><td> MEM aminoacidi non essenziali </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> I fibroblasti embrionali di topo </td><td> Raccolti da giorni 12-15 embrioni di topo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2443 </td><td> Preparare una soluzione all&#39;1% in DDH 2 O </td></tr><tr><td> Round-Provetta a fondo con 35 filtro cella pm </td><td> BD Biosciences </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPI plasma-Prep II Plasma Cleaner </td><td> SPI Forniture </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard184 Kit di silicone elastomero </td><td> Dow Corning </td><td> 184 SIL ELAST KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuometro </td><td> SPI Forniture </td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing

Insufficienza cardiaca avanzata rappresenta un&#39;importante sfida clinica insoddisfatta, derivanti dalla perdita di vitali e / o completamente funzionale cellule muscolari cardiache. Nonostante la terapia farmacologica ottimale, scompenso cardiaco rappresenta una delle principali cause di mortalità e morbilità nel mondo sviluppato. Una sfida importante nello sviluppo di farmaci è l&#39;identificazione di saggi cellulari che ricapitolano precisione normale e patologica del miocardio fisiologia umana in vitro. Allo stesso modo, le principali sfide in biologia rigenerativa cardiaca ruotano intorno alla identificazione e l&#39;isolamento di progenitori cardiaci paziente-specifici in quantità clinicamente rilevanti. Queste cellule devono poi essere assemblati in tessuto funzionale analogo al nativo architettura del tessuto cardiaco. Stampa microcontact consente la creazione di precise forme proteiche micropatterned che assomigliano organizzazione strutturale del cuore, fornendo così spunti geometriche per controllare l&#39;adesione cellulare spazialmente. Quidescriviamo il nostro approccio per l&#39;isolamento di cellule miocardiche altamente purificato da cellule staminali pluripotenti differenziazione in vitro, la generazione di superfici di crescita cellulare micropatterned con proteine ​​della matrice extracellulare, e l&#39;assemblaggio delle cellule derivate da cellule staminali muscolari cardiache in anisotropo tessuto miocardico.

FACS-purificazione di cellule staminali in vitro differenziate rivelato quattro popolazioni distinte di progenitori (Figura 1). La presenza di micropatterned fibronectina è stata confermata da immunofluorescenza che visualizzato un completo trasferimento di fibronectina linee continue (Figura 2). Placcatura di FACS-progenitori isolati su microdisegnature fibronectina ha comportato l&#39;allineamento della R + G + e parte del R - G + ...

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Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

La generazione di allineato tessuto miocardico è un requisito fondamentale per adattare i recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali a fini clinicamente utili. Qui si descrive un metodo di stampa per microcontatto il controllo preciso di forma e funzione cellulare. Utilizzo di popolazioni altamente purificate di cellule staminali embrionali derivate progenitori cardiaci, abbiamo quindi generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio.

Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. La generazione di allineato tessuto miocardico è un requisito fondamentale per adattare i recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali a fini clinicamente utili. Qui si descrive un metodo di stampa per microcontatto il controllo preciso di forma e funzione cellulare. Utilizzo di popolazioni altamente purificate di cellule staminali embrionali derivate progenitori cardiaci, abbiamo quindi generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Fabbricazione di derivazione biologica Materiali iniettabili per l&#39;ingegneria tissutale miocardica

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Ricerca

Bioingegneria

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

Generazione e caratterizzazione quantitativa di cisti epiteliali biliari funzionali e polarizzate

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...